張 薇 任春平 張文莉

[寧夏中西醫(yī)結合醫(yī)院（寧夏第三人民醫(yī)院）檢驗科，寧夏 銀川，750021]

由于臨床肺炎患者增加，準確快速檢出肺炎患者的病原菌對臨床的診治至關重要。重癥肺炎是臨床上常見的危重疾病，其病情發(fā)展迅速，常出現(xiàn)休克及多個器官功能障礙，病死率高且預后差[1]。傳統(tǒng)病原學檢查主要包括痰涂片、痰培養(yǎng)和血清學檢查[2-3]。其中痰培養(yǎng)是臨床最常用的細菌檢測手段，但培養(yǎng)周期較長，細菌培養(yǎng)的陽性率僅為45%～55%[4]。環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術，以特異性強、敏感度高、操作簡便等優(yōu)點被廣泛應用于感染性疾病的診斷。研究顯示，LAMP技術可以快速擴增肺部感染患者痰液中的常見致病菌核酸，以細菌濃度1×103為界值，敏感度達74.0%，特異度達95.3%[5-6]。呼吸道病原菌核酸檢測（恒溫擴增芯片法）在LAMP技術的研究基礎上，采用微流控芯片技術和恒溫擴增技術，摻入熒光染料進行恒溫（65 ℃）反應和實時熒光分析，一步完成對靶基因的擴增和檢測，可以同時檢測13項主要病原菌[7]。但對于重癥肺炎患者檢測結果與痰培養(yǎng)的對照研究及影響因素分析，國內(nèi)鮮有研究報道[8]。本研究通過觀察給予重癥肺炎患者LAMP技術檢測和傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢測結果的相關性，旨在深入探討LAMP技術對早期重癥肺炎的臨床診斷價值和意義，為規(guī)范重癥肺炎患者早期臨床病原微生物檢測奠定理論基礎?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年4月～2022年4月寧夏中西醫(yī)結合醫(yī)院收治的重癥肺炎患者100例作為研究對象。所有患者均知情同意參與本研究并簽署知情同意書，且本研究已被寧夏中西醫(yī)結合醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）符合重癥肺炎診斷標準，即滿足1項主要標準或≥3項次要標準[9]。主要標準：①氣管插管需要機械通氣；②感染性休克積極體液復蘇后仍需要血管活性藥物。次要標準：①呼吸頻率>30次/min；②氧合指數(shù)<250 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa）；③多肺葉浸潤；④意識障礙和（或）定向障礙；⑤血尿素氮≥7 mmol/L；⑥低血壓需要積極的液體復蘇。（2）年齡18～90歲。

排除標準：①艾滋病毒感染者；②肺結核者；③痰液標本采集不合格者；④自動出院或死亡者；⑤合并腫瘤患者；⑥妊娠、哺乳期婦女；⑦神經(jīng)精神障礙者。

1.3 檢測方法

所有患者入院后規(guī)范化留取痰標本（晨起漱口后留取深咳痰約3～5 mL）立即送檢到微生物室，都給予LAMP技術和傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢測。檢測設備：API鑒定板條購自美國Sigma公司，VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定藥敏儀購自美國BD公司，恒溫熒光核酸擴增儀購自日本榮研化學株式會社，核酸提取與純化試劑盒購自德國QIAGEN公司，抗酸染色液購自瑞羅氏公司，BSC-ⅡB2生物安全柜購自國藥北京公司。

1.3.1 傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢測

將采集的痰標本在2 h內(nèi)分別接種于血平板、巧克力平板、伊紅美藍平板上，置于35 ℃恒溫箱中孵育24～48 h，用API鑒定板條或VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定藥敏儀進行鑒定。

1.3.2 LAMP技術檢測

采集的痰標本按以下流程處理：①樣本處理：根據(jù)標本性狀加入不同比例10%氫氧化鈉溶液（NaOH），充分震蕩混勻，于37 ℃液化30 min，以無固態(tài)及拉絲狀為液化完全；取1 mL液化樣本于1.5 mL無菌離心管中，12 000 r/min，離心5 min，棄上清液；加入1 mL洗液，震蕩使沉淀完全懸浮，重復離心，棄上清液。②核酸提?。合蛩占w中加入50～100 μL核酸提取液，振蕩使沉淀完全懸浮，轉移至核酸提取管中，劇烈振蕩5 min，95 ℃加熱5 min，10 000 r/min，離心3 min，將上清液轉移至潔凈離心管中，取得的核酸直接進行檢測。③芯片加樣：按照操作說明，取出恒溫擴增試劑，室溫解凍，瞬時離心至管底，吸取20 μL恒溫擴增試劑加入準備好的200 μL離心管中，加入34.5 μL被檢核酸樣品，輕搖使其充分混合均勻，瞬時離心至管底，反應體系54.5 μL；在潔凈工作臺內(nèi)取出芯片恢復至室溫，吸取50 μL上述配制好的核酸擴增體系，從進出樣口1加入到芯片主通道中，待其充滿芯片主通道即停止加樣；取1張封口膜，覆蓋于進出樣口上，按壓至貼合緊密，固定后上機。

1.4 觀察指標

①調(diào)查與記錄所有患者的一般資料，包括性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)。②對所有患者的病原體檢出情況進行分組，其中單一病原體感染作為單一組，包括肺炎支原體、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌等，合并感染的作為合并組。③以傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢查作為判斷的金標準，判斷LAMP技術在重癥肺炎患者病原體的診斷價值。特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%，敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料對比

在100例患者中，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)判斷為單一病原體感染65例，合并病原體感染35例。合并組的性別、年齡、病程、體質(zhì)量指數(shù)等與單一組對比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料對比 [（±s）/n]

組別 例數(shù) 性別（男/女）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）合并組 35 18/17 50.67±3.28 11.69±0.24 21.73±1.11單一組 65 33/32 50.98±2.48 11.87±0.83 21.78±0.98 t/χ2 0.004 0.314 0.224 0.087 P 0.950 0.714 0.801 0.934年齡（歲）病程（d）

2.2 LAMP技術檢測情況

在100例患者中，LAMP技術平均檢測時間為（2.10±0.02）h，LAMP技術檢出肺炎鏈球菌21例，金黃色葡萄球菌11例，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌18例，大腸埃希菌15例，銅綠假單胞菌14例，鮑曼不動桿菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麥芽窄食單胞菌9例，其他22例。傳統(tǒng)痰培養(yǎng)判斷為單一病原體感染65例，合并病原體感染35例，檢出肺炎鏈球菌22例，金黃色葡萄球菌10例，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌17例，大腸埃希菌14例，銅綠假單胞菌13例，鮑曼不動桿菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麥芽窄食單胞菌8例。LAMP技術判斷為單一病原體感染62例，合并病原體感染38例，LAMP技術診斷的敏感性與特異性分別為100.00%（35/35）和95.38%（62/65）。見表2。

表2 LAMP技術在重癥肺炎患者病原體感染的診斷敏感性與特異性

3 討論

近年來，重癥肺炎病死率逐年升高，有文獻報道，我國重癥肺炎的病死率達50%[10]。臨床上對肺炎的診斷主要依據(jù)影像學檢測，但影像學檢測的敏感度及特異性并不是100%，且部分患者會錯過檢查[11]。重癥肺炎患者在臨床指征、抗感染方面不同于普通社區(qū)獲得性肺炎患者，治療過程非常復雜，如能在疾病早期給予治療，可降低病死率[12]。因此，確定重癥肺炎患者感染的病原體至關重要。本研究顯示，在100例患者中，傳統(tǒng)痰培養(yǎng)判斷為單一病原體感染65例，合并病原體感染35例。

傳統(tǒng)病原學檢查主要包括痰涂片、痰培養(yǎng)和血清學檢查等，但存在以下缺陷：①痰涂片靈敏度低，只能初步識別革蘭氏染色陰、陽性菌，了解細菌大致形態(tài)，不能明確具體病原菌；②痰培養(yǎng)是臨床最常用的細菌檢測手段，但培養(yǎng)周期較長，細菌培養(yǎng)的陽性率僅為45%～55%；③血清抗原抗體檢測有滯后性，患者臨床癥狀已好轉，抗體檢測仍可呈陽性[13]。

涂片抗酸染色法雖然具有經(jīng)濟要求不高、操作簡單、快速得出結果等特點，但是檢出限比較高，只有當痰標本中的細菌含量達到10 000條/mL左右時，才能被涂片抗酸染色法檢出，檢測的靈敏性有待提高。作為一種分子生物學檢測方法，LAMP技術對于痰液標本中目的細菌的陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法。特別是LAMP反應在合成DNA的過程中會釋放出副產(chǎn)物，如偶氫離子、焦磷酸根離子，因此反應液的pH值會隨著反應的過程而發(fā)生一定的變化。如果產(chǎn)物由初始堿性變?yōu)樗嵝?，可使用pH敏感指示劑作為染料檢測DNA擴增，有利于肉眼區(qū)分陽性與陰性，提高LAMP技術應用的靈敏性。LAMP技術與PCR技術相似，可針對目標基因DNA或cDNA在不同區(qū)域設計多條引物，利用恒溫聚合酶進行恒溫擴增，實驗反應時間比較短，直接通過溶解曲線、擴增曲線即可判斷結果[14-15]。LAMP技術可檢測13種病原體，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等，能有效區(qū)分同一病原菌的各種亞型，也能鑒別不同類型的病原菌，具有高度診斷特異性，也具有快速、簡便、經(jīng)濟等特點[16-17]。本研究在100例患者中，LAMP技術平均檢測時間為（2.10±0.02）h，檢出肺炎鏈球菌21例，金黃色葡萄球菌11例，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌18例，大腸埃希菌15例，銅綠假單胞菌14例，鮑曼不動桿菌22例，肺炎克雷伯菌10例，嗜麥芽窄食單胞菌9例，其他22例。LAMP技術判斷為單一病原體感染62例，合并病原體感染38例，LAMP技術診斷的敏感性與特異性分別為100.00%和95.38%，也說明LAMP技術在重癥肺炎患者病原體檢測中具有重要的價值。從機制上分析，LAMP技術核酸的擴增效率極高，1 h內(nèi)產(chǎn)物可達靶基因的109～1010倍，不需要復雜的溫控設備，對環(huán)境要求相對較低[18]。不過在具體檢測過程中，要采集合格標本，用可控式負壓吸痰管收集痰標本，并立即送檢，采集要求涂片顯示白細胞>25/LP，上皮細胞<10/LP，痰液量至少0.6 mL。LAMP技術在檢測中每張芯片均設有1個陽性質(zhì)控，9個陰性質(zhì)控，若任一結果錯誤則檢測結果無效，需進行復檢[19]。試劑盒有陰性對照品和陽性對照品，以質(zhì)控實驗環(huán)境和人員操作，保證結果的準確性[20]。同時由于經(jīng)費問題，本研究設置的組別比較少，沒有對具體某個病原體進行對比分析，將在后續(xù)研究中探討。

綜上所述，重癥肺炎患者多伴隨有病原體感染情況，LAMP技術能準確快速檢出重癥肺炎患者病原體感染情況，具有時間短、特異性高等優(yōu)勢，有很好的臨床應用價值。