范天慈，毛 睿，劉麗婷，竇志英，劉亞男，孫佳惠，常艷旭，龔博煬（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院/天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301600）

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，可補(bǔ)益肝腎、收澀固脫[1]，具有保護(hù)肝腎、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等藥理作用[2]。酒萸肉為山茱萸加黃酒浸潤后酒燉或酒蒸制得的飲片，較山茱萸增強(qiáng)了補(bǔ)益肝腎的功效[3]。酒萸肉現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典》（一部），以馬錢苷、莫諾苷為指標(biāo)成分[1]。研究顯示，酒萸肉含有的山茱萸新苷、沒食子酸，具有護(hù)肝、抗炎、抗菌等作用[4]；其總黃酮類成分具有抗氧化、護(hù)肝等作用[5]；5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）為炮制過程中產(chǎn)生的醛類化合物，為中藥炮制品尤其是酒蒸、酒炙品的常用檢測指標(biāo)[6]。因此，多指標(biāo)成分含量測定對(duì)于綜合評(píng)價(jià)酒萸肉的質(zhì)量具有重要意義。

中藥質(zhì)量受產(chǎn)地、采收時(shí)間、加工方式、炮制方法等多因素影響，而干燥是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。《千金翼方》指出：“夫藥采取，不依陰干、曝干，雖有藥名，終無藥實(shí)”[8]，而《中國藥典》也未對(duì)酒萸肉的干燥參數(shù)作具體規(guī)定，因此市場上不同干燥方式制得的酒萸肉質(zhì)量參差不齊[8]，從而影響臨床療效。紅外干燥、冷凍干燥等技術(shù)在中藥干燥中得到逐步應(yīng)用，兩種或多種干燥方式的聯(lián)合應(yīng)用具有彌補(bǔ)單一干燥方式的不足，同時(shí)滿足多種需求的特點(diǎn)[9－10]，但在中藥加工中尚未廣泛應(yīng)用。因此，本研究通過測定酒萸肉中沒食子酸、5-HMF、馬錢苷、莫諾苷、山茱萸新苷和總黃酮等成分的含量，探討不同干燥方式對(duì)酒萸肉質(zhì)量的影響，旨在為酒萸肉的干燥方式優(yōu)選提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），DHG-9245A型鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），YHG 300-BS-Ⅱ型真空干燥箱（上海百典儀器設(shè)備有限公司），ALPHA 1-2 LD plus型真空冷凍干燥機(jī)（德國 Marin Christ 公司），RWBS-08S型微波干燥機(jī)（南京蘇恩瑞干燥設(shè)備有限公司），SB-3200DTN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司），F(xiàn)A2004型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)W100型高速粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)YA0505YA14）、5-HMF對(duì)照品（批號(hào)H12M9Z61023）、馬錢苷對(duì)照品（批號(hào)P22F10F81444）、莫諾苷對(duì)照品（批號(hào)P11M11F112846）、山茱萸新苷對(duì)照品（批號(hào)Y07A7H12648）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均不小于98%；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)L-001-160520，純度＞98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；黃酒（批號(hào)20190219，酒精度13%）購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸均為分析純，水為純凈水。

山茱萸于2020年10月采自浙江省淳安縣，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李天祥教授鑒定為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸C.officinalisSieb.et Zucc.的新鮮成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒萸肉的制備

取山茱萸，去核后于75 ℃鼓風(fēng)干燥，制成山萸肉飲片。取山萸肉飲片，加入50%黃酒，攪拌均勻，于密閉容器中悶潤1 h后，隔水蒸2 h。取出攤開放涼，分別采用不同方式干燥制得22批酒萸肉，其干燥方式見表1。

表1 22批酒萸肉的干燥方式

2.2 酒萸肉中沒食子酸等6種成分的含量測定

2.2.1 檢測條件 （1）沒食子酸等5種成分的色譜條件：以Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）為色譜柱，以0.3%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，7%B；10～35 min，7%B～15%B；35～50 min，15%B～30%B；50～55 min，30%B～7%B；55～60 min，7%B）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為240 nm。（2）總黃酮的檢測條件：采用“NaNO2-Al（NO3）3-NaOH”顯色法進(jìn)行檢測。取供試品溶液1 mL，加入5% NaNO2溶液0.5 mL反應(yīng)6 min，再加入10% Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻后反應(yīng)6 min，最后加入5% NaOH溶液1 mL混勻，靜置15 min，于510 nm波長處測定吸光度[11]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取沒食子酸、5-HMF、莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷對(duì)照品1.013、1.531、1.085、1.002、1.013 mg，置于10 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容，搖勻，制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為101.3、153.1、108.5、100.2、101.3 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。另稱取蘆丁對(duì)照品9.80 mg，置于10 mL容量瓶中，加入80%乙醇溶解并定容，得到蘆丁質(zhì)量濃度為0.98 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取樣品粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇25 mL，超聲（功率180 W，頻率40 kHz，下同）處理40 min，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得用于測定沒食子酸等5種成分的供試品溶液（Ⅰ）。另精密稱取樣品粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，加入45%乙醇25 mL，超聲處理20 min，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用45%乙醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得用于測定總黃酮的供試品溶液（Ⅱ）。

2.2.4 沒食子酸等5種成分的系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（Ⅰ）及空白溶液（80%甲醇），按“2.2.1（1）”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖1，空白圖略）。結(jié)果顯示，各成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于3 000，空白溶液對(duì)測定無干擾。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下沒食子酸等5種成分的混合對(duì)照品溶液和蘆丁對(duì)照品溶液，用80%甲醇稀釋，得系列線性工作溶液，分別按“2.2.1（1）（2）”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣測定。以各待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對(duì)應(yīng)的峰面積或吸光度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果見表2。

表2 沒食子酸等5種成分和蘆丁的回歸方程與線性范圍

2.2.6 方法學(xué)考察 2種檢測方法經(jīng)方法學(xué)考察結(jié)果顯示，精密度、重復(fù)性及準(zhǔn)確度均較好，供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定（RSD均小于3%）。

2.2.7 各批次酒萸肉的含量測定 取22批酒萸肉樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1（1）（2）”項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積或吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，每批樣品平行測定3次。結(jié)果見表3。

表3 酒萸肉樣品中沒食子酸等5種成分和總黃酮的含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）

2.3 層次分析法綜合評(píng)價(jià)酒萸肉質(zhì)量

參考文獻(xiàn)[12―13]，采用層次分析法判斷各成分的重要性，得到酒萸肉中各成分的重要性依次為：馬錢苷＞莫諾苷＞山茱萸新苷＞沒食子酸＞5-HMF＞總黃酮，得到判斷優(yōu)先矩陣結(jié)果見表4。

表4 沒食子酸等5種成分和總黃酮的判斷優(yōu)先矩陣結(jié)果

根據(jù)表4結(jié)果，采用層次分析法計(jì)算得到馬錢苷、莫諾苷、山茱萸新苷、沒食子酸、5-HMF、總黃酮的權(quán)重系數(shù)分別為 0.380 6、0.251 6、0.160 2、0.100 9、0.064 3、0.042 5。一致性比例因子為0.019 4（＜0.10），表明該判斷優(yōu)先矩陣符合一致性檢驗(yàn)，權(quán)重系數(shù)合理有效。按公式計(jì)算綜合評(píng)分：綜合評(píng)分＝（Y1×0.100 9+Y2×0.064 3+Y3×0.251 6+Y4×0.380 6+Y5×0.160 2+Y6×0.042 5）×100（Y1～Y6依次為沒食子酸、5-HMF、馬錢苷、莫諾苷、山茱萸新苷、總黃酮的含量）。綜合評(píng)分越高，表示酒萸肉質(zhì)量越優(yōu)[14]。結(jié)果顯示，ZW3樣品的綜合評(píng)分最高，其次為ZG2和ZH2，詳見表5。

表5 22批酒萸肉的綜合評(píng)分結(jié)果

3 討論

22批酒萸肉中沒食子酸、5-HMF、莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、總黃酮的含量分別為1.043 8～1.563 8、0.648 5～2.358 8、5.031 0～10.305 7、6.681 2～7.534 2、0.986 5～1.148 8、33.657 2～50.741 5 mg/g。60 ℃鼓風(fēng)烘干、遠(yuǎn)紅外干燥時(shí)所得飲片的質(zhì)量優(yōu)于同法45、75、90 ℃所得飲片，這可能與高溫影響成分穩(wěn)定、破壞成分有關(guān)[15]。微波干燥速率快，60、75、90 ℃微波干燥所得飲片的綜合評(píng)分較高，質(zhì)量較優(yōu)。－80 ℃下預(yù)凍所得飲片的質(zhì)量優(yōu)于－20 ℃預(yù)凍所得飲片，其原因可能為－80 ℃預(yù)凍效果好，水分升華快。聯(lián)合干燥方式在酒萸肉干燥中未展現(xiàn)出優(yōu)勢，其原因可能為飲片蒸制過程中產(chǎn)生的自由水較多，而鼓風(fēng)干燥、遠(yuǎn)紅外干燥產(chǎn)生的水較少，可實(shí)現(xiàn)快速干燥。

遠(yuǎn)紅外干燥通過紅外波穿透的方式實(shí)現(xiàn)干燥[16]，對(duì)飲片外觀影響較小，顏色保留程度高。鼓風(fēng)干燥可能會(huì)褪除部分顏色。微波干燥升溫急劇，飲片易產(chǎn)生棕褐色、輕微皺縮等特征，與其他干燥方式有明顯差異。鼓風(fēng)、遠(yuǎn)紅外、微波等加熱干燥方式與曬干、陰干、冷凍干燥等不經(jīng)過高溫干燥方式處理的酒萸肉樣品滋味有明顯區(qū)分。這表明加熱干燥方式與自然干燥、低溫干燥對(duì)飲片滋味影響有差異。

綜上所述，酒萸肉的干燥方式宜采用75 ℃微波干燥、60 ℃鼓風(fēng)干燥或60 ℃遠(yuǎn)紅外干燥。