程檬，牛志強，陳宗坤，張海洋，霍晨達，劉立新，魏志剛，萊智勇，徐鈞

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原030001；山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院2. 肝膽胰外科及肝臟移植中心3. 消化內(nèi)科，山西 太原030001）

膽石癥（又稱膽結(jié)石）是指膽道系統(tǒng)包括膽囊和肝內(nèi)外膽管內(nèi)形成結(jié)石的疾病，是肝膽外科最常見的疾病之一。其臨床表現(xiàn)取決于結(jié)石的部位、是否造成梗阻及梗阻的程度、是否引起膽道感染等因素[1]。在發(fā)達國家，大約有20%的成年人患有膽石癥，其發(fā)病率為0.60%~1.39%，女性顯著高于男性[2-3]，且發(fā)病率隨著年齡的增長而增加。我國成人膽石癥發(fā)病率為10%~15%，男女比例約為1∶2.5，好發(fā)于40~60 歲人群，并且隨著人口的老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率還在逐年上升[1]。在針對膽石癥的病因?qū)W研究[4-5]中發(fā)現(xiàn)，糖尿病、肥胖等代謝綜合征相關(guān)疾病可能與膽石癥的形成與發(fā)展存在密切關(guān)系。進一步研究[6]表明，腸道菌群失調(diào)可能引起并促進了糖尿病、肥胖等代謝異常疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，膽石癥患者的腸道菌群多樣性及某些菌群的豐度顯著降低。然而，目前有關(guān)腸道微生態(tài)失衡在膽石癥發(fā)生的病理生理學(xué)機制不甚清楚，亟待全面了解腸道菌群與膽石癥的關(guān)系，為膽石癥的生物預(yù)防提供理論依據(jù)。因此，本文對腸道微生態(tài)失衡在膽石癥病因研究方面的新進展進行概括和探討。

1 膽石癥的病因及發(fā)病機制

1.1 膽石癥的病因

膽石癥具有較高的發(fā)病率，其中80%為無癥狀患者[8]。研究[9]表明，膽結(jié)石的危險因素包括：⑴不可變因素，如年齡、性別、種族、遺傳；⑵可變因素，如代謝綜合征、飲食結(jié)構(gòu)、腸道微生態(tài)失衡等。膽結(jié)石根據(jù)其化學(xué)成分可分為膽固醇結(jié)石、膽色素結(jié)石、混合性結(jié)石。其中，膽固醇結(jié)石占膽結(jié)石的70%以上，剩余30%的病例，其結(jié)石成分包含膽色素，不同類型的結(jié)石其發(fā)病機制也不盡相同。

1.2 膽固醇結(jié)石的發(fā)病機制

膽固醇結(jié)石主要來源于膽固醇過飽和的濃縮膽汁中固體膽固醇晶體的沉淀[10]，此類結(jié)石的發(fā)病機制主要包括遺傳因素、膽汁成分改變、膽固醇的腸道吸收、膽囊運動障礙[11]等4個方面。⑴遺傳因素：Gellert-Kristensen 等[12]一項Meta 分析確 定 了ABCG8、 SULT2A1、 CYP7A1、 TM4SF4、ABCB4 和TTC39B 等基因中6個不同位點可編碼參與膽固醇代謝、轉(zhuǎn)運以及膽汁酸磺?；拿福c膽固醇結(jié)石的發(fā)生密切相關(guān)。ABCB11 基因編碼的膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP） 蛋白的主要功能是將細(xì)胞內(nèi)膽汁酸運輸?shù)侥懝?，促進膽固醇溶解，抑制膽固醇結(jié)晶[13]。Gan 等[14]對443例肝內(nèi)膽管結(jié)石患者與560 名健康志愿者進行外顯子測序，發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管結(jié)石患者存在ABCB11 基因突變。該研究進一步采用聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡分析檢測肝內(nèi)膽管結(jié)石患者肝組織中ABCB11 mRNA 和BSEP 蛋白的表達水平，結(jié)果表明肝組織中ABCB11mRNA 表達降低，其編碼的BSEP 蛋白也隨之下降，蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜中的分布減少，提示ABCB11 基因突變可能是膽石癥的危險因素。膽石癥的形成可能是多個基因相互作用的結(jié)果，這為膽石癥的病因?qū)W研究提供了新的思路。⑵膽汁成分改變：膽固醇結(jié)石的發(fā)生主要由于膽汁中膽固醇過飽和而導(dǎo)致膽固醇凝結(jié)為晶體析出。而導(dǎo)致膽固醇過飽和的因素都有可能是引起膽石癥發(fā)生的病因。Wang 等[15]利用致石飲食喂養(yǎng)去勢雌性小鼠，同時肌肉注射G 蛋白偶聯(lián)受體激動劑，結(jié)果表明G 蛋白偶聯(lián)受體激動劑通過激活G 蛋白偶聯(lián)受體（雌激素受體），破壞膽固醇和膽汁酸鹽的代謝途徑，進而導(dǎo)致膽固醇沉積形成結(jié)石。女性膽道結(jié)石患病率顯著高于男性，可能是由于雌激素通過上調(diào)雌激素受體和G 蛋白偶聯(lián)受體而促進膽固醇沉積。肝臟膽固醇的高分泌使膽汁中膽固醇過飽和，在膽囊中快速變相結(jié)晶沉積。肝X 受體（liver X receptor，LXR）作為膽汁酸傳感器，是控制膽固醇和膽汁酸代謝的重要途徑。LXR 受體激活增加膽汁中膽固醇的含量，易導(dǎo)致膽固醇結(jié)晶沉淀，形成膽固醇結(jié)石[16]。Uppal 等[17]喂養(yǎng)小鼠致石飲食，同時激活小鼠的LXR 受體，發(fā)現(xiàn)LXR 受體激活使小鼠對致石飲食致敏，誘導(dǎo)膽囊膽固醇結(jié)晶形成。⑶膽固醇的腸道吸收：膽石癥患者表現(xiàn)出膽固醇的吸收和合成之間不平衡。高膽固醇飲食人群膽汁內(nèi)膽固醇分泌增加而膽汁酸的合成減少，膽汁過飽和而易發(fā)生膽道結(jié)石。Han 等[18]喂食豚鼠致石飲食，再應(yīng)用顯微鏡觀察其膽囊結(jié)石，發(fā)現(xiàn)膽固醇吸收率和膽結(jié)石患病率之間存在顯著的正相關(guān)，腸道膽固醇吸收率高是膽固醇結(jié)石形成的獨立危險因素。腸道膽固醇的吸收依賴于腸道刷狀緣細(xì)胞上的尼曼-匹克（Niemann-Pick C1-Like 1，NPC1L1）轉(zhuǎn)運體。應(yīng)用NPC1L1 轉(zhuǎn)運體的選擇性抑制劑，可抑制腸道膽固醇吸收，減少通過膽固醇的腸淋巴循環(huán)到達肝臟的膽固醇量，在這種情況下，即使喂食致石飲食，膽結(jié)石易感小鼠膽固醇結(jié)石的形成也會被阻止[19]。因此降低膽固醇的腸道吸收，可有效防止膽石癥的發(fā)生。⑷膽囊運動：利用CT、磁共振等影像學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)膽囊結(jié)石患者空腹和餐后殘余膽囊體積增大，排空延遲[20]。膽囊運動功能障礙為膽固醇成核和結(jié)石生長提供了充足的時間。Wang 等[21]利用CCK基因敲除小鼠與野生型小鼠進行研究，結(jié)果表明與野生型小鼠相比，基因敲除小鼠的空腹膽囊體積增加，膽汁膽固醇濃度升高，膽囊內(nèi)形成微小結(jié)石。該研究進一步對基因敲除小鼠腹腔注射CCK-8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠膽結(jié)石生成減少，表明膽囊受到CCK 的刺激后體積減小、排空增強，從而減少膽結(jié)石的生成。

除此之外，糖尿病[4]、肥胖[5]、腸道微生態(tài)失衡[22]等都為膽固醇結(jié)石發(fā)生的獨立危險因素。因此，為減少膽石癥及其并發(fā)癥的發(fā)生，一級預(yù)防顯得尤為重要。

1.3 膽色素結(jié)石的發(fā)病機制

膽色素結(jié)石的發(fā)生主要是由于膽汁中游離膽紅素過飽和，與鈣結(jié)合形成不溶性的膽紅素鈣[23]。既往研究[24]表明，膽色素結(jié)石的發(fā)病機制包括細(xì)菌感染、膽汁淤積、肝臟膽紅素分泌過多等3個方面。⑴細(xì)菌感染：楊玉龍等[25]對55例膽色素結(jié)石進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌存在于膽色素結(jié)石的核心，說明細(xì)菌在結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過程中起到始動因子的作用，證實了細(xì)菌在結(jié)石的形成過程中發(fā)揮著重要作用。⑵膽汁淤積：在膽道狹窄的情況下，膽汁流速減慢導(dǎo)致膽汁淤積，為膽色素結(jié)石的成石提供了充分的時間與場所。Huang 等[26]對245例行經(jīng)皮經(jīng)肝膽道鏡取石術(shù)的患者進行長期觀察，發(fā)現(xiàn)膽道狹窄患者的肝內(nèi)膽管結(jié)石復(fù)發(fā)時間早于對照組，表明膽汁淤積對膽色素結(jié)石的形成有一定的作用。⑶肝臟膽紅素分泌過多：肝臟代謝產(chǎn)生膽汁的過程中，非結(jié)合膽紅素生成增多是膽色素結(jié)石形成的一個先決條件。孫百軍等[27]對急性膽道感染大鼠的肝細(xì)胞進行培養(yǎng)，并對培養(yǎng)液中非結(jié)合膽紅素的含量進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著非結(jié)合膽紅素含量的增加，膽色素結(jié)石的形成趨勢逐漸上升。

膽色素結(jié)石發(fā)病機制極為復(fù)雜，其具體的病因及發(fā)病機制仍需進一步研究完善。

2 腸道菌群

人和其他哺乳動物的腸腔內(nèi)分布著數(shù)萬億的微生物，我們統(tǒng)稱為腸道菌群[28]。腸道菌群目前被認(rèn)為是由500~1 000 種細(xì)菌組成的新的、復(fù)雜的器官[29]。所有腸道微生物的基因組被稱為“微生物組”，它比人類核基因組大100 多倍。正常人類腸道菌群的功能包括：代謝和營養(yǎng)功能、保護宿主免受病原菌的侵襲、維持腸道黏膜的完整性及免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[30-31]。正常情況下，腸道菌群處于一種動態(tài)平衡中。當(dāng)受到宿主或外界環(huán)境的影響，腸道微生態(tài)失衡，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，腸道微生態(tài)對人類健康的影響日益顯著[32]。目前研究表明，腸道微生態(tài)失衡與肝癌[33]、結(jié)直腸癌[34-35]、炎癥性腸病[36]、肥胖、糖尿病、抑郁癥、心血管疾病等慢性疾病密切相關(guān)[6]。由此可見，保持人體和腸道微生物良好的共生關(guān)系對人體健康是至關(guān)重要的。

3 膽石癥與腸道菌群的研究進展

3.1 膽固醇結(jié)石與腸道菌群

膽石癥的發(fā)生可能與腸道微生態(tài)失衡密切相關(guān)。Wang 等[22]采用致石飲食喂養(yǎng)小鼠，通過16S rRNA 基因測序確定小鼠的糞便微生物群，發(fā)現(xiàn)在形成膽固醇結(jié)石的小鼠糞便中Firmicutes 菌的含量及Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）的比值降低，腸道菌群豐度和多樣性也顯著降低。由此可見，腸道菌群失調(diào)可能在小鼠膽固醇結(jié)石形成的發(fā)病機制中起重要作用。Wang 等[7]利用16S rRNA基因測序技術(shù)對膽石癥患者及健康志愿者的糞便進行DNA 測序，結(jié)果表明膽石癥患者腸道菌群多樣性及某些菌群的豐度顯著降低，尤其是厚壁菌，且腸道中產(chǎn)生7α-脫羥基酶的細(xì)菌數(shù)量顯著增加，而參與膽固醇代謝的菌群數(shù)量顯著減少。從而得出腸道菌群失調(diào)影響膽汁酸和膽固醇的代謝，并與膽結(jié)石形成有關(guān)。目前，腸道微生態(tài)失衡引起膽石癥的機制尚待進一步明確，可能與以下途徑有關(guān)。

3.2 腸道菌群失調(diào)影響膽汁酸和膽固醇的代謝

3.2.1 腸肝循環(huán)與膽汁酸代謝 在解剖上，膽道系統(tǒng)作為消化道的重要組成部分，是聯(lián)系肝臟與腸道的重要樞紐。膽汁酸由肝細(xì)胞以膽固醇為原料在膽固醇7α-羥化酶（cytochrome P450 7A1，CYP7A1）的作用下合成結(jié)合膽汁酸，然后排入腸道。結(jié)合膽汁酸被腸道中產(chǎn)膽汁酸鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH） 的細(xì)菌催化為游離膽汁酸，游離膽汁酸再被7α-脫羥基菌轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸，最后各種類型的膽汁酸被腸上皮細(xì)胞吸收并穿過基底外側(cè)膜進入門靜脈返回肝臟，完成腸肝循環(huán)[37]。膽汁酸的腸肝循環(huán)使肝臟、膽道系統(tǒng)和腸道產(chǎn)生天然的聯(lián)系，在整個過程中，CYP7A1 是膽汁酸生成的限速酶，腸道菌群通過調(diào)節(jié)此酶的基因表達水平來調(diào)控膽汁酸的合成。因此，腸道菌群失調(diào)引起膽結(jié)石的形成，可能與膽汁酸和膽固醇的代謝異常相關(guān)。

3.2.2 膽汁酸鹽水解酶與游離膽汁酸 正常人體腸道中含有大量生成BSH 的細(xì)菌，可使結(jié)合膽汁酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x膽汁酸。游離膽汁酸作為法尼類受體（famesoid X receptor， FXR）的配體，可抑制CYP7A1 的表達，從而減少膽汁酸的合成。這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制使膽汁酸池的大小在生理狀態(tài)下保持動態(tài)平衡[38]。當(dāng)腸道微生態(tài)失衡時，生成BSH的細(xì)菌活性增強，產(chǎn)生的游離膽汁酸增多，從而更加抑制CYP7A1 的表達使膽汁酸的生成減少，導(dǎo)致膽汁中膽固醇過飽和析出成石。Inagaki 等[39]在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)FXR 激活后誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞釋放成纖維細(xì)胞生長因子15 （fibroblast growth factor 15，F(xiàn)GF15），F(xiàn)GF15 通過血液循環(huán)作用于肝細(xì)胞上的受體，抑制肝酶CYP7A1 的表達，導(dǎo)致膽汁酸代謝障礙。Jung 等[40]通過對正常人的膽管細(xì)胞進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)FXR 被膽汁酸激活后可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長因子19（fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19）的表達和分泌，并通過血液循環(huán)與肝細(xì)胞中的受體結(jié)合，抑制CYP7A1 的轉(zhuǎn)錄與表達，降低膽汁酸代謝。

3.2.3 7α-脫羥基菌與次級膽汁酸 7α-脫羥基菌具有將游離膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸的功能。正常人體腸道中僅有少量的細(xì)菌具有7α-脫羥基活性。游離膽汁酸在其作用下轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸石膽 酸 （lithocholic acid， LCA）和脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）。LCA 與DCA 是膽囊平滑肌細(xì)胞上G 蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體（the G proteincoupled bile acid receptor 5，TGR5）的激動劑，可使膽囊平滑肌松弛，膽囊充盈。Li 等[41]利用TGR5 基因敲除小鼠與野生型小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠的膽囊平滑肌松弛，膽囊體積較大。當(dāng)腸道中具有7α-脫羥基活性的細(xì)菌增多時，生成的LCA與DCA 也增多，刺激TGR5 使膽囊平滑肌松弛，膽囊充盈，膽囊排空延遲，為生成膽固醇結(jié)石提供了充足的時間。Hu 等[42]在膽石癥患者及易感小鼠的糞便中發(fā)現(xiàn)富含脫硫弧菌，脫硫弧菌與游離膽汁酸結(jié)合發(fā)生脫羥基化反應(yīng)生成次級膽汁酸，可導(dǎo)致DCA 增加和βMCA（β-muricholic acid，β-鼠膽酸，親水性膽汁酸）減少，而提高膽汁酸的疏水性，促進腸道膽固醇吸收，增加膽汁中膽固醇含量。該研究進一步表明，脫硫弧菌的代謝產(chǎn)物硫化氫增加，促進肝臟FXR 表達和抑制CYP7A1 的表達，減少膽汁酸代謝，使膽固醇沉積成石。因此，腸道微生態(tài)失衡可通過影響膽汁酸代謝而促進膽固醇結(jié)石的形成。

3.2.4 腸道小分子物質(zhì)導(dǎo)致代謝異常 腸道菌群代謝產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，如短鏈脂肪酸、氧化三甲胺等也會參與機體的代謝從而增加膽石癥患病幾率。短鏈脂肪酸不僅可提供腸道上皮細(xì)胞所需的能量，還可被吸收入機體參與調(diào)節(jié)機體的能量代謝[43]。腸道菌群失調(diào)時短鏈脂肪酸的產(chǎn)量異常，可能與糖尿病、脂肪肝等代謝異常疾病相關(guān)[44]。這些疾病為膽石癥的獨立危險因素，間接增加了膽石癥的患病風(fēng)險。氧化三甲胺可影響膽汁酸及膽固醇的代謝[45]，從而影響膽石癥的發(fā)生。

3.2.5 腸道菌群失調(diào)引起免疫調(diào)節(jié)異常 腸道微生態(tài)失衡時可改變腸道屏障功能，引起機體的免疫調(diào)節(jié)異常。當(dāng)腸道中腸桿菌屬的種類增多而糞桿菌屬的種類減少時，腸道內(nèi)T 細(xì)胞的數(shù)量明顯增多[46]。Maurer 等[47]利用喪失T細(xì)胞和B細(xì)胞功能的小鼠（Rag 小鼠）與野生型小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠比Rag 小鼠更易患膽固醇結(jié)石。將T 淋巴細(xì)胞移植到Rag 小鼠后膽結(jié)石患病率顯著增加，而移植B 淋巴細(xì)胞后膽結(jié)石患病率無明顯變化。此研究表明T 細(xì)胞在小鼠膽固醇結(jié)石的生成中起著關(guān)鍵作用。有關(guān)免疫調(diào)節(jié)異常與膽石癥發(fā)病的研究相對較少，腸道菌群失調(diào)引起免疫調(diào)節(jié)異常是否是膽石癥的發(fā)病機制尚待研究。

3.3 膽色素結(jié)石與腸道菌群

膽色素結(jié)石的形成與膽道細(xì)菌感染、膽汁淤滯等多種因素相關(guān)[24]。孫權(quán)等[48]從膽色素結(jié)石中提取到細(xì)菌DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)進行檢測，結(jié)果證實在膽色素結(jié)石中存在細(xì)菌DNA，表明細(xì)菌可能參與膽色素結(jié)石的形成過程。研究[49-50]表明，膽管內(nèi)的細(xì)菌可直接或間接來源于腸道，細(xì)菌可能直接通過Oddi 括約肌反流入膽管，也可能經(jīng)過腸黏膜屏障進入門脈系統(tǒng)再入膽管。腸黏膜屏障功能異常將導(dǎo)致細(xì)菌移位，引起膽道感染，增加膽色素結(jié)石的患病風(fēng)險。細(xì)菌感染引起膽色素結(jié)石的機制可能是：⑴細(xì)菌產(chǎn)生大量的β-葡萄糖醛酸苷酶，將結(jié)合膽紅素水解成非結(jié)合膽紅素，非結(jié)合膽紅素再與鈣離子結(jié)合形成膽色素結(jié)石[51]。⑵細(xì)菌還可產(chǎn)生內(nèi)毒素，激活機體細(xì)胞釋放內(nèi)源性β-葡萄糖醛酸苷酶，參與結(jié)石的形成[49-50]。⑶細(xì)菌可產(chǎn)生糖蛋白，使細(xì)菌易于黏附到異物表面促進膽色素沉淀和凝聚[51]。⑷細(xì)菌產(chǎn)生磷酯酶降低膽汁中卵磷脂的濃度，使膽紅素溶解度降低，促進游離膽紅素與鈣結(jié)合發(fā)生沉淀[51]。⑸細(xì)菌產(chǎn)生的自由基是膽紅素鈣形成的觸發(fā)因子，還可促使膽道上皮細(xì)胞分泌更多的糖蛋白促進成石。

4 總結(jié)與展望

膽石癥因其具有較高的發(fā)病率，且為肝膽外科常見的良性疾病，故其病因及發(fā)病機制的研究引起國內(nèi)外的大量關(guān)注。16S rRNA 測序技術(shù)及細(xì)菌宏基因測序技術(shù)等的問世以及生物信息學(xué)分析平臺的升級，為了解腸道菌群生態(tài)變化和其扮演的生物學(xué)功能提供了重要技術(shù)支持。既往研究已表明腸道菌群對人體健康有很大影響，與糖尿病、代謝綜合征、炎癥性腸病等多種疾病密切相關(guān)。在膽石癥的病因?qū)W研究中發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)可能直接或間接地導(dǎo)致膽石癥的發(fā)生。腸道菌群失調(diào)可通過多種途徑影響膽結(jié)石的形成，主要途徑可能是菌群變化影響了消化系統(tǒng)膽固醇及膽汁酸的代謝，以及膽道系統(tǒng)感染使得膽色素與鈣離子結(jié)合形成了膽色素結(jié)石。目前關(guān)于腸道菌群與膽石癥相關(guān)的病理生理學(xué)機制研究正逐漸開展起來。在膽結(jié)石發(fā)生過程中，腸道菌群扮演著何種角色，具體通過何種途徑，產(chǎn)生何種病理和生理學(xué)作用，都需要更多的研究來證實和闡明。如能明確腸道微生態(tài)和膽石癥發(fā)生的病理生理學(xué)關(guān)系及作用機制后，可為膽石癥的一級預(yù)防提供重要的理論依據(jù)和防治策略。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。