蘇一洵，李暉，易陳菊

星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元的功能起重要支持作用。例如，星形膠質(zhì)細(xì)胞可調(diào)控神經(jīng)元突觸形成[1-4]，并影響神經(jīng)沖動(dòng)傳遞、離子平衡以及神經(jīng)遞質(zhì)的清除[5-9]。這些功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一是突觸與星形膠質(zhì)細(xì)胞突起所形成的三聯(lián)突觸（tripartite synapse）。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)神經(jīng)元突觸都被星形膠質(zhì)細(xì)胞突起所包裹，形成三聯(lián)突觸[10,11]，星形膠質(zhì)細(xì)胞也與神經(jīng)元一起參與信息傳遞，對(duì)突觸間的信息傳遞活動(dòng)作出反應(yīng)，并調(diào)節(jié)傳遞的過程[12]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育與神經(jīng)元突觸的形成和活動(dòng)是一個(gè)相互依賴的過程，但其中的作用機(jī)制仍有待探究。星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過三種不同方式促進(jìn)突觸生成：首先，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌Thrombospondins、TGF-β、hevin 和SPARC等細(xì)胞因子，促進(jìn)神經(jīng)元突觸生長(zhǎng)[13-15]；其次，星形膠質(zhì)細(xì)胞生成的含硫酸軟骨素（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG）的細(xì)胞外間質(zhì)可有助于突觸生成[16]；最后，星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面蛋白如Neuroligin2與Cx30可參與促進(jìn)突觸形成[1,17]。目前的研究主要聚焦于星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控興奮性突觸形成的作用，我們對(duì)抑制性突觸形成中星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用所知甚少。此外，我們對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面蛋白調(diào)控神經(jīng)元突觸形成的作用機(jī)制的了解也非常有限。這些很大程度上是由于缺乏有效的體內(nèi)細(xì)胞互作的研究技術(shù)方法，因此無法對(duì)介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元表面互作的功能蛋白進(jìn)行系統(tǒng)性的鑒定，進(jìn)而阻礙了對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞控制突觸發(fā)生的過程進(jìn)行更系統(tǒng)而深入的了解。

最近，來自杜克大學(xué)的Cagla Eroglu 團(tuán)隊(duì)和Scott H.Soderling團(tuán)隊(duì)在Nature雜志上發(fā)表的文章，為解決此問題提供了新的研究工具[18]。他們改進(jìn)了在體化學(xué)遺傳學(xué)BioID方法（in vivoBioID，iBioID）[19]，用以識(shí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的互作蛋白。這種方法被作者命名為Split-TurboID，即利用有鄰近標(biāo)記功能的生物素化酶（TurboID），將TurboID 的N 端和C 端片段分別表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元膜上。在兩種細(xì)胞接觸表面，兩個(gè)片段可重組成完整的TurboID 并獲得酶活性，催化鄰近蛋白的生物素化標(biāo)記。因此可以認(rèn)為，在此處被生物素化標(biāo)記的蛋白就是星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元接觸位點(diǎn)中的蛋白。另外，為了鑒定其中的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜蛋白，作者還把全長(zhǎng)TurboID 表達(dá)到星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上，生物素化標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞膜蛋白。被生物素化的蛋白，將通過定量高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）法進(jìn)行純化、分析。

通過這兩種技術(shù)手段，作者篩選出118 個(gè)高置信度的星形膠質(zhì)細(xì)胞上的三聯(lián)突觸相關(guān)蛋白，其中包括了神經(jīng)膠質(zhì)素-3（Neuroligin-3）、軸突蛋白-1（Neurexin-1）以及鈣離子通道輔助亞基（CACNA2D3、CACNG2和CACNG3）；興奮性突觸蛋白（如AMPA受體：GRIA2和GRIA3）；抑制性突觸蛋白（如GABAA受體）等。這些蛋白已知在三聯(lián)突觸結(jié)構(gòu)表達(dá)，說明了該方法的可靠性。作者選出三個(gè)可能調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元黏附的分子，通過體內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞特異的CRISPR-Cas9 敲除實(shí)驗(yàn)，鑒定出神經(jīng)黏附分子（neuronal cell adhesion molecule，NrCAM）是星形膠質(zhì)細(xì)胞突起向神經(jīng)纖維網(wǎng)浸潤(rùn)體積（neuropil infiltration volume，NIV）的負(fù)調(diào)控因子，敲除NrCAM蛋白會(huì)導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞體積增大與其向神經(jīng)纖維網(wǎng)浸潤(rùn)程度的增加。

作者進(jìn)一步探尋NrCAM 調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及其對(duì)神經(jīng)纖維網(wǎng)浸潤(rùn)的機(jī)制。他們?cè)隗w內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元中表達(dá)不同標(biāo)記的NrCAM，利用受激發(fā)射損耗熒光顯微技術(shù)（STED）進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的NrCAM在空間上存在共定位，證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞NrCAM 與神經(jīng)元NrCAM 可能通過跨細(xì)胞同源互作起作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不管是星形膠質(zhì)細(xì)胞還是神經(jīng)元缺失NrCAM，抑或是兩者同時(shí)缺失NrCAM，都將導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的體積增大，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞突起向神經(jīng)纖維網(wǎng)浸潤(rùn)顯著增加。作者再通過在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)不同NrCAM突變體，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞通過彼此NrCAM 的細(xì)胞外免疫球蛋白區(qū)域進(jìn)行互作，以維持星形膠質(zhì)細(xì)胞的正常形態(tài)，限制星形膠質(zhì)細(xì)胞突起向神經(jīng)纖維網(wǎng)的浸潤(rùn)。

如前所述，星形膠質(zhì)細(xì)胞可與神經(jīng)元突觸形成三聯(lián)突觸，并調(diào)控突觸形成。因此，作者進(jìn)一步研究星形膠質(zhì)細(xì)胞NrCAM是否存在于三聯(lián)突觸中，并調(diào)控突觸形成。利用STED 成像，作者發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的NrCAM 與興奮性突觸及抑制性突觸在空間上非常接近，而且接近程度與已知的三聯(lián)突觸蛋白埃茲蛋白（Ezrin）相似，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞NrCAM 同樣存在于三聯(lián)突觸中。當(dāng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中敲除NrCAM后，僅增加了星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起到抑制性突觸的距離，并未影響星形膠質(zhì)細(xì)胞突起與興奮性突觸的距離。同樣的，神經(jīng)元特異的NrCAM敲除也能減少星形膠質(zhì)細(xì)胞與抑制性突觸的互作。

作者在之前的研究中曾利用抑制性突觸組織者橋尾蛋白（gephyrin）做餌，通過iBioID 識(shí)別到NrCAM 存在于GABA 能突觸后膜上[20]。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，作者驗(yàn)證了NrCAM 能與橋尾蛋白互作。由此猜測(cè)，NrCAM可能通過和橋尾蛋白形成復(fù)合體，控制抑制性突觸的發(fā)生發(fā)展。為了驗(yàn)證這一猜想，作者在HEK 293T中過表達(dá)了人源NrCAM，并和神經(jīng)元共培養(yǎng)，檢測(cè)NrCAM是否可誘導(dǎo)神經(jīng)元抑制性突觸在293T細(xì)胞上形成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，293T 上表達(dá)NrCAM 可引導(dǎo)抑制性突觸前膜和突觸后膜的形成與特化，而敲除神經(jīng)元中的NrCAM或橋尾蛋白將消除這種作用。相對(duì)應(yīng)的，過表達(dá)NrCAM 不能引導(dǎo)興奮性突觸的形成。這一系列實(shí)驗(yàn)證據(jù)說明，星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元的NrCAM 跨細(xì)胞膜的同源互作，通過神經(jīng)元橋尾蛋白，促進(jìn)了抑制性突觸的形成與特化。

以此為基礎(chǔ)，作者進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證星形膠質(zhì)細(xì)胞NrCAM對(duì)抑制性突觸形成的作用，并發(fā)現(xiàn)敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞NrCAM 可顯著減少抑制性突觸前膜與突觸后膜的共定位。這種抑制性突觸的減少，可以由表達(dá)人源NrCAM 補(bǔ)償。另外，敲除神經(jīng)元NrCAM 同樣可復(fù)現(xiàn)抑制性突觸前膜與突觸后膜的共定位減少。為了證明這種結(jié)構(gòu)性的改變具有功能性意義，作者在活體腦片中進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞NrCAM可顯著降低大腦皮質(zhì)2/3層錐體神經(jīng)元微型抑制性突觸后電流（miniature inhibitory postsynaptic currents，mIPSCs）的頻率和振幅，證實(shí)在體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞NrCAM是抑制性突觸的形成與功能所必需。

綜上所述，作者利用其研發(fā)的全新Split-TurboID工具，首次在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同細(xì)胞類群之間的接觸性互作蛋白的標(biāo)記。過往報(bào)道的突觸間縫隙蛋白組學(xué)研究方法——通過HRP 耦聯(lián)的軸突蛋白和神經(jīng)連接蛋白在體外進(jìn)行識(shí)別[21,22]，需要利用過氧化氫的標(biāo)記，然而其對(duì)活體大腦正常功能和對(duì)神經(jīng)纖維網(wǎng)中多細(xì)胞互作的過程都具有相當(dāng)大的毒性，因此難以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。而Split-TurboID 恰好克服了這個(gè)難點(diǎn)，因而能運(yùn)用到體內(nèi)進(jìn)行不同細(xì)胞類型連接的蛋白組學(xué)研究。作者將其應(yīng)用于星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間互作的研究，鑒定出118 個(gè)潛在的星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元表面互作蛋白，其中包括NrCAM這一神經(jīng)黏附蛋白。并發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞NrCAM 通過與神經(jīng)元NrCAM 的跨細(xì)胞膜同源互作，負(fù)調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的體積與其對(duì)神經(jīng)纖維網(wǎng)的浸潤(rùn)，并通過抑制性突觸后膜組織者橋尾蛋白，促進(jìn)抑制性突觸的形成和功能。

Cagla Eroglu 實(shí)驗(yàn)室此前發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的Neuroligin2也可調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的體積大小以及突觸形成[18]。然而，與NrCAM 不同的是，Neuroligin2促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞體積擴(kuò)增與其對(duì)神經(jīng)纖維網(wǎng)的浸潤(rùn)，同時(shí)只對(duì)興奮性突觸形成有促進(jìn)作用，而對(duì)抑制性突觸沒有顯著作用。另一方面，與NrCAM 相似，星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的連接蛋白Cx30 同樣也是三聯(lián)突觸中的關(guān)鍵蛋白，參與負(fù)調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞突起向神經(jīng)纖維網(wǎng)的浸潤(rùn)[23]，并抑制興奮性突觸中信號(hào)傳遞。Cx30在發(fā)育過程中則可通過下游RhoA-ROCK通路，抑制微環(huán)境中MMP9的表達(dá)，從而促進(jìn)抑制性突觸的形成[16]。這些研究共同揭示了三聯(lián)突觸中星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控突觸形成與功能的機(jī)制，同時(shí)也提出了一個(gè)有趣的問題：星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)調(diào)控與其對(duì)興奮性或抑制性突觸的不同調(diào)控是否存在功能上的偶聯(lián)？

另外值得注意的是，Split-TurboID 鑒定出的三聯(lián)突觸相關(guān)蛋白中，還包括了連接蛋白家族成員Gjc3（Cx29）。連接蛋白可在細(xì)胞之間形成縫隙連接通道，介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)與物質(zhì)交流，也可作為半通道，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)與胞外基質(zhì)的物質(zhì)交流。鑒于Split-TurID技術(shù)的高置信度，結(jié)合Cx30在調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與突觸發(fā)生的功能，Cx29可能也是三聯(lián)突觸的重要功能蛋白，其在調(diào)控突觸形成中的潛在關(guān)鍵作用有待進(jìn)一步研究。