胡曼，趙虹，陳準立，朱冬雨，張瑛，李倩儀，陸征宇

1 小膠質(zhì)細胞（MG）在腦梗死炎癥反應中的作用

小膠質(zhì)細胞（microglia，MG）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的主要免疫細胞，在大腦中發(fā)揮監(jiān)測CNS 損傷[1]、吞噬并清除神經(jīng)元碎片[2]、突觸修剪[3]等功能，并為神經(jīng)發(fā)生提供所必需的分泌因子[4,5]。

腦梗死發(fā)生后，大量神經(jīng)元細胞因血流減少、能量耗竭而死亡，死亡或垂死的細胞釋放損傷相關(guān)的配體和興奮性毒性谷氨酸，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，加重神經(jīng)元損傷[6]。在腦梗死炎癥反應過程中，MG在缺血/再灌注炎性反應中起主導作用，并在腦梗死修復過程中發(fā)揮重要作用[7]。腦梗死發(fā)生后，MG激活是大腦炎癥反應的第一步[8]，激活的MG可產(chǎn)生多種介質(zhì)，包括誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）[9]、一氧化氮（nitric oxide，NO）[10]、促炎細胞因子（如TNF-α）[11]、抗炎細胞因子（如TGF-β）[12]、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神 經(jīng) 營 養(yǎng) 蛋 白-3（neurotrophin-3，NT-3）[13]等，一方面，通過產(chǎn)生毒性物質(zhì)而加重神經(jīng)元的損傷，即M1 型（促炎表型）激活[14]；另一方面，又通過產(chǎn)生BDNF等生長因子促進神經(jīng)元修復，即M2型（抗炎表型）激活[14]。因此，對于以MG為靶點治療腦梗死應當盡可能使MG處于M2型，使其發(fā)揮神經(jīng)保護作用，減弱炎性毒性作用。

然而，是否存在M1和M2型MG尚有爭議。單細胞測序研究顯示炎癥反應中MG 并未產(chǎn)生M1 和M2兩種細胞類群，僅發(fā)現(xiàn)部分MG在阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等神經(jīng)退行性疾病中活化為“疾病相關(guān)小膠質(zhì)細胞（disease-associated microglia，DAM）[15]。該研究發(fā)現(xiàn)DAM 在AD模型中位于MG區(qū)域附近，其形態(tài)和關(guān)鍵標記基因與MG 相似，與MG 相比，DAM 在嘌呤能受體P2ry12/P2ry13、Cx3cr1、Tmem119 等幾個MG 穩(wěn)態(tài)基因的表達水平降低[16,17]。DAM中還有一些基因被上調(diào)，如髓細胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells-2，TREM-2）基因[18,19]。該研究還證實存在介于靜息態(tài)MG 與DAM 之間的中間狀態(tài)DAM。DAM特異性基因的基因集合富集分析顯示其參與溶酶體/吞噬途徑、內(nèi)吞作用和調(diào)節(jié)免疫應答。但目前尚無證據(jù)證明腦梗死炎癥反應中存在DAM。

血腦屏障（blood brain barrier，BBB）是一種環(huán)繞在腦血管周圍的內(nèi)皮細胞合胞體，保護CNS免受神經(jīng)毒性物質(zhì)的侵襲[20]，與神經(jīng)元共同構(gòu)成神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）。腦梗死發(fā)生后，神經(jīng)元因功能障礙而釋放過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 激活MG，產(chǎn)生更多的ROS，進一步放大MG 的激活，損傷內(nèi)皮細胞，加劇血腦屏障的破壞，這是BBB 損傷的第一階段[21,22]。MG中的缺氧誘導因子-1和NF-κB在腦缺血后表達上調(diào)，刺激MG產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，介導第二階段的BBB 破壞[23]。缺血性腦卒中后，MG 活化可通過釋放IL-1β、IL-6、TNF-α，上調(diào)星形膠質(zhì)細胞中水通道蛋白-4（aquaporin-4，AQP-4）的表達，引起星形膠質(zhì)細胞凋亡增強和BBB 的破壞。該研究還發(fā)現(xiàn)，P38信號通路參與MG介導的BBB的破壞。缺血再灌注后立即給予P38 抑制劑治療可降低小鼠腦內(nèi)AQP-4 的表達。骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchyml stem cells，MSCs）移植可抑制MG介導的AQP-4上調(diào)和星形膠質(zhì)細胞凋亡，從而維持BBB 的完整性[24]。血漿纖維蛋白原在BBB破壞后沉積在活化的MG區(qū)域，并與MG上的Mac-1相互作用，導致MG活化[25]。然而，另一項研究證明MG 在腦梗死后分泌前降蛋白，參與減少BBB的破壞和腦卒中后腦水腫，發(fā)揮保護作用[26]。因此，MG 活化與BBB 破壞之間的因果關(guān)系仍不明確。

MG焦亡也參與腦缺血性損傷[27]。在大鼠腦缺血模型中，焦亡執(zhí)行蛋白（gasdermin D，GSDMD）表達升高，使該蛋白表達沉默可極大地緩解腦缺血性損傷[28]。在腦梗死中，MG 在缺血損傷后24 h 通過吞噬多形態(tài)核粒細胞發(fā)揮抗炎作用，減少神經(jīng)元死亡[29]。但是在短暫腦缺血后72 h，大腦中Mac-2+常駐MG耗竭，MG通過缺血后的吞噬作用介導神經(jīng)元的延遲死亡[6]。

2 通過干預MG治療腦梗死

目前，通過干預MG 來治療腦梗死的方法主要包括藥物誘導MG向M2型極化、抑制腦梗死后MG焦亡和腦梗死恢復期的吞噬作用、干細胞移植及MG移植。

2.1 藥物誘導MG M2型極化治療腦梗死

目前用于誘導MG M2型極化治療腦梗死的藥物多數(shù)來源于實驗室研究。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP）是一種具有神經(jīng)保護功能的多肽，研究者使用干細胞移植將PACAP 注入小鼠腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)大腦中動脈栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）后3 d給予PACAP可減少腦梗死面積，促進功能恢復，并在缺血后7 d和14 d誘導MG向M2表型分化[30]。二甲雙胍廣泛用于治療2型糖尿病，現(xiàn)已被證明能降低卒中發(fā)生率，并在體內(nèi)和體外促進巨噬細胞M2 極化。MCAO 后24 h 給予二甲雙胍治療，增強MG M2極化相關(guān)基因表達，促進血管生成和神經(jīng)生成，促進功能恢復；同組體外研究表明，MG 的M2極化對二甲雙胍誘導的血管生成至關(guān)重要[31]。臨床試驗表明，人參皂苷治療可改善急性腦梗死患者的神經(jīng)功能，人參皂苷的治療作用與抑制MG激活和減少M1表型相關(guān)的促炎細胞因子表達有關(guān)[32]。動物實驗證明，慢性膳食攝入n-3多不飽和脂肪酸（n-3 PUFAs）不僅能長期保護缺血損傷，而且能積極促進神經(jīng)血管動力學恢復和腦修復[33]。有研究在MCAO 后5 d 開始采用二十二碳六烯酸（DHA）腹腔注射聯(lián)合飲食魚油（FO）治療腦梗死，結(jié)果顯示，DHA和FO聯(lián)合治療能增強MG的M2型極化，促進長期的感覺運動恢復，且比單獨注射DHA 更有效[34]。17β-雌二醇（17 β-estradiol，E2）具有神經(jīng)保護作用。在年輕成年去卵巢大鼠腦缺血體內(nèi)研究[35]中，外源性低劑量E2 嚴重抑制了MG 的激活，并使MG從“激活的”變形蟲形態(tài)向“靜止的”分枝形態(tài)轉(zhuǎn)變。進一步研究M1和M2表型標記物發(fā)現(xiàn)，E2可顯著抑制“促炎”M1表型，同時增強大鼠腦缺血后海馬區(qū)M2 型MG 的“抗炎”表型。且E2 治療消除了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的BV2-MG對海馬HT-22神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用[35]。有研究在大鼠MCAO 再灌注后，每隔1 d 腹膜內(nèi)注射促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO），結(jié)果顯示，EPO減少了M1型MG，增加了M2 型MG，在MCAO 后第14 天，腦組織損失量顯著減少，白質(zhì)損傷減輕，神經(jīng)行為改善[36]。此外，還有實驗證明，Malibatol A（MA)[37]、銀杏內(nèi)酯B（Ginkgolide B，GB）[38]、金絲桃素[39]、姜黃素[40]等植物提取物，均可促進腦梗死后MG的M2 型極化。

米諾環(huán)素是一種抗炎蛋白酶抑制劑，在腦卒中模型中被證明可通過降低血腦屏障通透性、促進MG 向M2 表型的極化而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[41]。同時也在臨床試驗中用于治療缺血性卒中。受試者在腦卒中癥狀出現(xiàn)后6 h內(nèi)靜脈注射米諾環(huán)素，預設劑量為每天3、4.5、6 或10 mg/kg，持續(xù)72 h，隨訪90 d，結(jié)果顯示，米諾環(huán)素輸液是安全的，單用或與組織纖溶酶原激活劑聯(lián)合使用米諾環(huán)素均耐受性良好，最大劑量為10 mg/kg，有望用于控制腦梗死后炎癥[42]。

2.2 抑制腦梗死后MG的焦亡

關(guān)于腦梗死后MG 焦亡，目前的研究主要是經(jīng)典焦亡通路介導的MG 焦亡。在CNS 中，Caspase-1 主要在MG 中高度表達，Caspase-1又名IL-1β轉(zhuǎn)換酶，在靜息狀態(tài)以無活性的酶原形式存在于細胞質(zhì)，活化的Caspase-1 具有蛋白剪切功能，可將沒有活性的IL-1β和IL-18 前體加工成熟[43]，還可以切割GSDMD蛋白，誘導細胞膜穿孔，促使細胞內(nèi)容物釋放和細胞焦亡發(fā)生[44]。在腦梗死早期即可觀察到Caspase-1 主要在MG中活化，選擇性抑制Caspase-1表達具有神經(jīng)保護作用，可減輕腦缺血性損傷，這表明MG 經(jīng)典焦亡通路極有可能介導腦缺血損傷中MG 焦亡[45]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NLRP1、NLRP3、NLRP4 等炎性小體均參與調(diào)控MG中Caspase-1 活化，這可能是干預腦缺血中MG焦亡、抑制其神經(jīng)毒性的關(guān)鍵靶點。

2.3 抑制MG在腦梗死后期的吞噬作用

在注射血管收縮劑內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）到大鼠紋狀體或小鼠感覺運動皮質(zhì)的腦梗死模型中，MG 在局灶性腦缺血后3～7 d 表達吞噬相關(guān)蛋白、乳脂球EGF 樣因子-8（milk fat globule EGF factor 8，MFG-E8）和Mer 受體酪氨酸激酶（Mer receptor tyrosine kinase，MerTK）。MFG-E8 和MerTK 這兩種蛋白的缺失可完全阻止腦缺血后運動功能缺失，并通過抑制神經(jīng)元吞噬作用，顯著減少腦萎縮。如果MG 在MerTK 或MFG-E8基因上存在缺陷，也可減輕腦梗死后神經(jīng)損傷[6]。因此，在腦梗死早期干預MG的吞噬作用可作為腦梗死治療的靶點。

2.4 腦梗死恢復期神經(jīng)再生（干細胞移植）

干細胞移植是治療神經(jīng)退行性疾病[46]、脊髓損傷[47]、腦梗死[48,49]等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的良好策略。移植物細胞與周圍環(huán)境的相互作用對神經(jīng)保護作用很重要，移植的干細胞可與缺血后的腦內(nèi)活化的MG相互作用并產(chǎn)生影響。

在大鼠短暫性腦缺血模型中，移植人神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSCs）CTX0E03 在MCAO 后1～4 周促進紋狀體MG增殖，可維持DCX+/Ki67+神經(jīng)母細胞的增殖活性，且CTX0E03移植后神經(jīng)細胞增殖活性的保留是在MG高增殖率的前提下進行的，這些結(jié)果提示，MG 可能部分介導CTX0E03 移植對腦梗死后神經(jīng)元增殖作用[50]。移植NSCs 對缺血性腦損傷后神經(jīng)功能恢復的有益作用部分是通過抗炎反應實現(xiàn)的，主要由腦內(nèi)駐留的MG、巨噬細胞和淋巴細胞介導[51,52]。

大鼠短暫MCAO 3、7 d后，骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植抑制了MG的活化。MSCs分泌的可溶性趨化因子和IL-5 可降低MG 對LPS 刺激的反應[51]。然而，另一項研究表明，MCAO后MSCs經(jīng)尾靜脈移植可改善運動行為，同時伴MG激活增強[53]。移植MSCs對MG活化的爭議結(jié)果可能與移植時機、劑量及實驗觀察時間有關(guān)。在9 d的新生小鼠缺氧缺血模型中，MSCs移植降低了MG對缺氧的反應，誘導MG極化，促進缺血腦損傷后神經(jīng)功能的改善[54,55]。體外研究表明，MSCs可通過釋放NO促進MG向M2型極化，影響MG活性[56,57]。

內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是另一種治療缺血性疾病的干細胞類型，卒中后循環(huán)EPCs 有短暫升高[58]，循環(huán)EPCs水平與缺血嚴重程度呈負相關(guān)[59]。EPCs移植可以減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能[60-62]。EPCs 的療效與MG 密切相關(guān)，MG和EPCs之間存在相互作用，LPS激活的MG可釋放高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein 1，HMGB1），使用HMGB1 抑制劑甘草酸可阻斷EPCs 移植的療效[63]。由此可見，MG 可通過釋放HMGB1 調(diào)節(jié)EPCs 旁分泌功能，增強腦梗死后EPCs移植的治療功能。

2.5 MG移植

MG是腦內(nèi)的免疫細胞，可產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進缺血性腦損傷后的神經(jīng)恢復，有研究者嘗試將外源性MG 直接移植入腦內(nèi)，結(jié)果提示MG 對腦梗死有保護作用[64,65]。在短暫性MCAO大鼠模型中，腦缺血48 h后靜脈注射MG有助于減少神經(jīng)元凋亡，增加包括GDNF、BDNF、VEGF、BMP7 在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎細胞因子IL-4、IL-15 的表達，促進神經(jīng)功能恢復[50]。然而，在永久性MCAO大鼠模型中，MG經(jīng)尾靜脈移植并不影響神經(jīng)結(jié)局[66]。結(jié)果有爭議可能是因為不同的實驗動物，不同的時間、路線和劑量的MG移植。除腦梗死外，有研究者在慢性缺血模型、脊髓損傷、AD、PD中也進行MG移植，都顯示出MG 對組織修復和功能恢復的有益作用[67,68]。然而，MG 移植在組織損傷后影響神經(jīng)功能的確切機制尚不清楚，需要進一步研究移植MG在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用。

3 小結(jié)與展望

關(guān)于MG在腦梗死治療中的研究目前主要集中于如何減輕缺血后炎癥反應并促進神經(jīng)修復及再生。研究最多的當屬藥物誘導腦梗死后MG向M2型極化的研究，例如二甲雙胍、米諾環(huán)素等多次在動物實驗中取得療效，但目前仍存在諸多問題。首先，藥物干預作用的靶點難以確定。藥物干預可能會引發(fā)其他連帶反應，造成無法預料的損傷。另一方面，關(guān)于MG極化過程的研究尚待明確，極化模型也存在一定的爭議，目前的實驗室研究尚未發(fā)現(xiàn)M1型和M2型MG，在腦梗死動物模型中也未發(fā)現(xiàn)DAM。這些問題都阻礙藥物干預大量走入臨床研究。多數(shù)實驗均證實MG活化與BBB破壞相互促進，加重腦梗死后炎癥反應，但也有證據(jù)顯示MG可減輕腦梗死后BBB的破壞，因此MG活化與BBB破壞之間的因果關(guān)系仍不明確，如何調(diào)控MG來減輕腦梗死后BBB 破壞有待進一步研究。抑制腦梗死后MG 焦亡和抑制MG 在腦梗死后期吞噬作用的研究目前較少，需更多的證據(jù)支持。干細胞移植也是目前缺血性腦卒中研究的熱點，其難點在于如何使移植干細胞分化為神經(jīng)細胞，替代死亡的神經(jīng)元的功能。MG 作為腦內(nèi)最重要的免疫細胞，對干細胞移植有重要影響，闡明MG 在腦梗死后干細胞移植中的作用是研究的必經(jīng)之路。MG移植則寄希望于外源性MG發(fā)揮促進神經(jīng)修復的作用，探索移植MG 在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機制是該研究的第一步。總之，藥物干預、神經(jīng)干細胞移植、MG 移植等為腦梗死治療提供了多種治療可能，需進一步深入研究。