王彥 馬芬芬 梁偉 王琨 劉霞 楊伏猛 王西珍

醫(yī)療水平的提升在很大的上延長了部分嚴(yán)重疾病患者的生存年限,但也增加了真菌感染性疾病發(fā)生的幾率。既往有資料記載［1］,侵襲性真菌感染者的死亡率高達(dá)50%,雖然部分抗真菌藥物對真菌感染的進(jìn)程能起到一定控制作用,但伴隨真菌對其產(chǎn)生耐藥性及標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌治療未取得顯著療效,臨床治療難度相應(yīng)增加,越來越多的人投身到真菌的耐藥機(jī)制研究中。本文主要研究熱帶假絲酵母菌、白色假絲酵母菌可能的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取2019 年1 月～2020 年6 月入住本院治療的100 例真菌培養(yǎng)陽性者,ATCC 90029 白色假絲酵母菌、ATCC 750 熱帶假絲酵母菌、ATCC 6258克柔假絲酵母菌作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 DNA提取試劑盒,PCR試劑盒,PCR 引物及擴(kuò)增儀、離心機(jī)及成像系統(tǒng)等。

1.2.2 菌株鑒定和體外藥敏試驗(yàn) 對菌株采用分離、純化處理,初步篩選菌株。針對采集的菌株純化以后進(jìn)行接種,恒溫孵育48 h,提取呈白、綠、藍(lán)、紫及紅色的酵母樣菌落作試樣；獲取DNA 后擴(kuò)增、測序初篩后的菌株,完整標(biāo)準(zhǔn)化的分子生物學(xué)鑒定。利用專業(yè)軟件校正測序峰圖與基因序列(ITS1 區(qū)、D 區(qū))。檢測采集到的100 株假絲酵母菌菌株的MIC,并進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn),每次均選標(biāo)準(zhǔn)株作為質(zhì)控菌株,其MIC值處于M27～S4 設(shè)定的區(qū)間中,就判讀對應(yīng)的試驗(yàn)操作有效。本次試驗(yàn)獲得耐氟康唑的熱帶假絲酵母菌5 株、白色假絲酵母菌9 株。

1.2.3 提取假絲酵母菌DNA 嚴(yán)格依照基因抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作,提取以上分離株的基因組DNA。

1.2.4 基因擴(kuò)增 分別把基因文庫登錄號(hào)AY856352與M23673 作為已知序列設(shè)定2 對引物,分別設(shè)置白色假絲酵母菌ERG3 引物序列和熱帶假絲酵母菌引物序列。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的主要參數(shù)：第Ⅰ階段：95℃條件下持續(xù)預(yù)變性5 min；第Ⅱ階段：內(nèi)變性95℃ 30 s、退火55℃ 30 s、延伸70℃ 1 min,共計(jì)進(jìn)行38次循環(huán)；第Ⅲ階段：70℃終延伸9 min,低溫(4℃)保存。PCR反應(yīng)體系體積50 μl,包括forward primer 2 μl,reverse primer 2 μl,PCR master mix 25 ml,蒸餾水20 ml,DNA模版2 μl。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,EB 染色,凝膠成像下攝像。

1.2.5 產(chǎn)物純化及測序分析 委托權(quán)威機(jī)構(gòu)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。

1.3 觀察指標(biāo) 比較分析PCR 產(chǎn)物和GenBank 數(shù)據(jù)庫外供的基因序列,進(jìn)而探尋到基因突變點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)情況 ITS1 擴(kuò)增后形成了片段規(guī)格類似的條帶,在500～620 bp范圍中。鑒定發(fā)現(xiàn),分離到的100 株假絲酵母菌內(nèi),其中熱帶假絲酵母菌、白色假絲酵母菌占真菌總數(shù)的65%,分別有15 株和50 株。其中9 株白色假絲酵母菌株的氟康唑24 h MIC＞16 mg/L,確定其是耐藥菌株；5 株熱帶假絲酵母菌對氟康唑和伏立康唑雙重耐藥。

2.2 PCR 擴(kuò)增情況 PCR 對臨床分離獲得的14 株假絲酵母菌進(jìn)行擴(kuò)增,都獲得了預(yù)期產(chǎn)物,規(guī)格和DNA Marker 相比較,部位吻合,未形成非特異性產(chǎn)物帶。

2.3 基因測序情況 基于Blast 比較熱帶假絲酵母菌和白色假絲酵母菌的測序結(jié)果,將起始密碼子ATG的A 計(jì)數(shù)設(shè)定成1,基于此探尋到突變基因。5 株熱帶假絲酵母菌ERG11 基因存有同義、錯(cuò)義突變分別為5、4 個(gè),錯(cuò)義突變分別是Y132H、G487T、A530C、G533C；ERG3 基因依次有7 個(gè)和12 個(gè)；白色假絲酵母菌ERG11 和ERG3 基因各發(fā)現(xiàn)4 個(gè)同義突變,前者有3 個(gè)錯(cuò)義突變,后者為0。分析 ERG11 基因序列以后,發(fā)現(xiàn)其在氟康唑敏感菌株僅是發(fā)生了單個(gè)突變,康唑劑量自身依賴敏感程度和耐藥菌株內(nèi)ERG11 基因突變以多位點(diǎn)錯(cuò)義突變同時(shí)出現(xiàn)為主。

3 討論

既往有文獻(xiàn)報(bào)道,痰液、陰道、大便和腹水內(nèi)白假絲酵母菌的檢出率相對較高,占比依次為76.1%、68.2%、63.7%和 60.0%,但是在血液與尿液內(nèi)所占比例并不高,分別為31.8%和47.3%,熱帶假絲酵母菌在尿液內(nèi)的檢出比例達(dá)到了12.4%,但是在痰液道、大便血液內(nèi)的占比均不到7.0%。有文獻(xiàn)資料記載,在1997～1998年之間熱帶念珠菌的檢出率是4.6%,1999 年升至5.3%,2001～2003 年時(shí)這一指標(biāo)的檢出值已經(jīng)上升至7.4%。假絲酵母菌是臨床上發(fā)生率較高的一種真菌感染性疾病,免疫力正常的群體內(nèi)以皮膚黏膜感染維主要表現(xiàn),而在人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、腫瘤化療者等免疫力偏低群體中經(jīng)常表現(xiàn)為深部真菌感染或全身性的播撒式感染,并且感染經(jīng)常屢次發(fā)作久治不愈。多烯類、唑類、嗎啡類等均是當(dāng)下臨床常用的抗真菌類藥物［2］。唑類藥物特別是氟康唑有生物利用度高、組織穿透力強(qiáng)、半衰期長及療效顯著等優(yōu)勢,從20世紀(jì)80年代以來,成為了防治假絲酵母菌感染的一線藥物。但規(guī)模化使用抗真菌藥物加快了藥物耐藥進(jìn)程。

假絲酵母菌產(chǎn)生耐藥性的原因十分復(fù)雜,其耐藥機(jī)制主要和基因突變及過度表達(dá)、細(xì)胞壁組分變性與生物被膜產(chǎn)生等存在相關(guān)性。但既往已有研究證實(shí),單個(gè)靶酶基因突變就會(huì)導(dǎo)致白假絲酵母菌對氟康唑的敏感性降低［3］。ERG11 基因也被叫做ERG16 或者CYP51A1 基因,其編碼蛋白為氮唑類藥物作用的靶酶,即羊毛固醇14-去甲基化酶(14-DM),該類酶是一種細(xì)胞色素P-450 酶,由528 個(gè)氨基酸構(gòu)成,參與真菌細(xì)胞膜麥角固醇的合成過程,在維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能常態(tài)化方面發(fā)揮著重要作用。ERG11 基因突變可能會(huì)引起參與編碼的氨基酸改變,Erg11P 結(jié)構(gòu)隨之變化,進(jìn)而作用于酶和藥物的親和過程,形成耐藥。既往有研究發(fā)現(xiàn),ERG11 編碼的14-去甲基化酶為合成麥角固醇生物過程中的一種必需中間合成酶,唑類抗真菌藥能夠和本酶活性位點(diǎn)上的血紅蛋白結(jié)合,對真菌麥角固醇生物合成階段的關(guān)鍵酶活性能形成一定抑制作用,降低麥角固醇的合成效率,對真菌質(zhì)膜的完整性造成不同程度的損傷,進(jìn)而發(fā)揮抑制真菌生長、繁殖過程的作用。在本課題研究中,發(fā)現(xiàn)5 株熱帶假絲酵母菌ERG11 基因存有同義、錯(cuò)義突變分別為5、4 個(gè),錯(cuò)義突變分別是Y132H、G487T、A530C、G533C,并且意外的發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變和多點(diǎn)位多變同時(shí)出現(xiàn),本文報(bào)道出的突變位點(diǎn)都是已經(jīng)位點(diǎn),沒有探查到新突變。喬祖莎等［3］研究、總結(jié)了43 株假絲酵母菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)情況,發(fā)現(xiàn)氟康唑耐藥率達(dá)55.8%,RT-PCR 研究后發(fā)現(xiàn)ERG11 基因mRNA 呈現(xiàn)出高表達(dá)特征,PCR 對ERG11 基因測序過程中發(fā)現(xiàn)5 個(gè)基因出現(xiàn)了錯(cuò)義突變情況,其中Y132H 基因和本文報(bào)道結(jié)果相一致。

細(xì)胞色素P-450 羊毛甾醇-14α-去甲基化酶為唑類化合物的主要作用靶點(diǎn),通過結(jié)合羊毛甾醇-14α-去甲基化酶活性位點(diǎn)上的血紅蛋白,對羊毛甾醇-14α-去甲基化酶催化合成麥角甾醇的過程形成一定抑制作用,進(jìn)而對真菌細(xì)胞膜造成損傷,對真菌正常生長、繁殖過程形成抑制作用。氟康唑靶酶編碼基因ERG11 突變與高表達(dá)是形成耐藥性的主因,也是國內(nèi)外領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)問題之一。當(dāng)下,國內(nèi)很多學(xué)者針對酵母菌對唑類藥物產(chǎn)生的耐藥機(jī)制進(jìn)行了大量研究,普遍認(rèn)為主要和如下幾點(diǎn)相關(guān)：①唑類藥物作用的靶酶部分編碼基因突變,誘導(dǎo)編碼的氨基酸發(fā)生變化,進(jìn)而影響酶和藥物之間的親和程度,形成耐藥性；②靶酶基由于表達(dá)過度生成了大量的靶酶,造成細(xì)胞中血藥濃度不能像初始那樣對酶生物活性形成抑制作用,這也是引起耐藥問題的主要原因之一；③外排泵出現(xiàn)不同程度的改變：ABCT 與MF 均是常見的外排泵基因,分別屬于ACB 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、易化擴(kuò)散載體超家族,如果它們過度表達(dá),則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中藥物積累量降低,形成耐藥性。

本實(shí)驗(yàn)研究中采集的100 株致病假絲酵母菌中,熱帶假絲酵母菌、白色假絲酵母菌分別有15株和50株,占真菌總數(shù)的65%［4］。分析各自占比不難發(fā)現(xiàn)伴隨假絲酵母菌病流行病學(xué)的改變,和過往報(bào)道相比較,非白色假絲酵母菌致病率有提高趨勢。比較經(jīng)雙向測序獲得結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)菌株,白色假絲酵母菌ERG3 基因上未見新的突變點(diǎn),ERG11 基因上存有T485A 與C795T兩個(gè)同義突變點(diǎn)［5］；而在熱帶假絲酵母菌ERG11 基因內(nèi)新發(fā)現(xiàn)了C639T 同義突變點(diǎn),其沒有引起氨基酸發(fā)生變化,ERG11 基因上存有同義、錯(cuò)義突變分別有5、4 個(gè)［6］。鑒于白色假絲酵母菌樣本量過少的實(shí)況,ERG11 基因也成為眾多醫(yī)學(xué)者研究的重點(diǎn),未見新的錯(cuò)義突變位點(diǎn),和既往研究報(bào)道結(jié)果相一致［7,8］。近期有學(xué)者在研究中指出,藥物敏感株和耐藥株兩者的形成同義位點(diǎn)的突變情況也可能會(huì)存在一定差異,對基因的表達(dá)程度基本不會(huì)形成明顯影響,可以聯(lián)合進(jìn)行mRAN 檢測,進(jìn)而更好的探究突變位點(diǎn)與耐藥兩者的相關(guān)性。

綜上所述,假絲酵母菌ERG11、ERG3 均存在程度不一的突變,其可能參與假絲酵母菌耐藥性形成過程。在后續(xù)研究中,為進(jìn)一步檢驗(yàn)基因突變與氟康唑耐藥性形成之間的關(guān)系,還需借助定點(diǎn)突變法進(jìn)行,由功能性表達(dá)方面著手,探明假絲酵母菌的耐藥機(jī)制,為臨床合理安全選用抗真菌藥物提供更可靠的依據(jù)。