王雅迪 張鶴揚(yáng) 秦巧臻 黑俊皓 江小霞 劉一涵 賀慧霞

頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（jaw bone marrow mesenchymal stem cells，JBMMSCs）是從頜骨中分離得到的具有高度增殖、遷移活性及分化潛能的一類成體干細(xì)胞。JBMMSCs起源于外胚層，在頜面部胚胎發(fā)育期由顱神經(jīng)嵴（CNC）細(xì)胞從神經(jīng)管遷移到顱骨前區(qū)，形成面部和前顱骨的一些骨骼和軟骨［1,2］。JBMMSCs可在一定誘導(dǎo)條件下向成骨細(xì)胞（通過膜內(nèi)成骨直接形成骨）、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞（通過軟骨內(nèi)成骨形成骨和軟骨）、神經(jīng)細(xì)胞等分化［3-5］。有研究表明［6,7］，JBMMSCs在增殖及成骨分化方面的能力明顯優(yōu)于BMSCs（bone mesenchymal stem cells，BMSCs），且具有臨床上易得、與頜骨同源等優(yōu)勢，成為目前修復(fù)頜骨缺損領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

另一方面，頜骨缺損常由頜面部創(chuàng)傷、腫瘤、感染等引起，而這些因素都會極大的損傷頜骨周圍神經(jīng)，骨損傷導(dǎo)致的神經(jīng)纖維損傷后，其周圍骨組織的自然愈合及骨形成的時間會明顯延長，這表明，神經(jīng)系統(tǒng)與骨組織代謝密切相關(guān)［8］。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一類，它能使中樞神經(jīng)元和外周神經(jīng)元加速生長、促進(jìn)發(fā)育，修復(fù)損傷的神經(jīng)系統(tǒng)。同時，在骨代謝、成骨分化中有促進(jìn)作用［9-11］。近年來，有研究證實(shí)NGF 能促進(jìn)中胚層來源的長骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化及骨形成，但未見NGF 對外胚層來源的JBMMSCs 功能的影響研究。因此，本文擬探討NGF對JBMMSCs增殖及成骨分化作用的影響，為其用于頜骨骨缺損的修復(fù)與再生篩選合適的作用濃度，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 α-MEM 培養(yǎng)基（gibco，Ameican)，胎牛血清（Excell，China），胰蛋白酶（BioFrox，American)，地塞米松、抗壞血酸C、β-甘油酸鈉、NGF(Peportech，American)，F(xiàn)ITC標(biāo)記 的抗體CD45，APC 標(biāo)記的 抗體CD29、90，CCK-8 試劑盒（Sigma，American），堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒（Sigma，American）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，American)、qRT-PCR 試劑（上海生工生物，中國)、RIPA 裂解液（Solarbio，China）、BCA 蛋白定量試劑盒（上海貝博生物科技公司，China），OPN、RUNX2、MCM-2、Ki67 抗體（Abcam，American)。

1.1.2 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，American)，離心機(jī)（Thermo，American)，流式細(xì)胞儀（BD，American)，倒置顯微鏡（Olympus，American)，F(xiàn)TC-3000P 實(shí)時熒光定量 PCR 儀（Funglyn Biotech Inc，American)，酶標(biāo)儀（Thermo，American)，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad，American）。

1.2 方法

1.2.1 JBMMSCs 的提取及鑒定 將新生BL3C57 小鼠處死后，于75%的乙醇浸泡5 min，無菌條件下取下頜骨，剪為約1 mm3大小的組織塊；收集后加入胰酶消化約20 min，棄胰酶，加入α-MEM 培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h 后半量換液，72 h 后完全更換培養(yǎng)基，以后每3 d 換1次，細(xì)胞80%～90%融合消化、傳代。本研究經(jīng)中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動物管理與使用委員會批準(zhǔn)（IACUC-DWZX-2021-759）。

1.2.2 JBMMSCs的鑒定 取P2代對數(shù)期生長的JBMMSCs（下同），胰酶消化后收集，用α-MEM培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml，使用FITC標(biāo)記的抗體CD45、APC標(biāo)記的抗體CD29、CD90的單克隆抗體于4℃冰箱內(nèi)避光孵育30～40 min，用PBS洗滌3遍后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.2.3 分組及處理 根據(jù)NGF 濃度設(shè)為四組，處理方法如下：0 ng/ml NGF組、10 ng/ml NGF組、50 ng/ml NGF組、100 ng/ml NGF組［20-22］。分別以含有上述濃度NGF 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)JBMMSCs，每3 d換液1次。

1.2.4 CCK-8 檢測增殖 取JBMMSCs 以每孔4×103個細(xì)胞的密度接種于96 孔板中，24 h 后更換為含不同濃度NGF（0、10、50、100 ng/ml）的完全培養(yǎng)基。分別在第0、1、3、5、7 d 時，每孔加入10 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔A值。

1.2.5 堿性磷酸酶染色（ALP）取JBMMSCs以每孔3×104個細(xì)胞的密度接種于24 孔板中，24h后更換為含不同濃度NGF（0、10、50、100ng/ml）的完全培養(yǎng)基，每3d換液1次，誘導(dǎo)7d后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛溶液固定30-60min，根據(jù)ALP試劑盒說明配置染液，室溫避光孵育4h后，PBS 洗滌3次，使用BIX 顯微鏡觀察。Image J軟件分析各組ALP染色的光密度。

1.2.6 qRT-PCR基因表達(dá)檢測 取JBMMSCs以3×105個/孔的密度接種于六孔板中，以上述分組進(jìn)行培養(yǎng)3 d后［23］，根據(jù)說明書使用總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，分光光度計檢測mRNA濃度及純度。然后使用Hifair? Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus）試劑盒去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄1μgmRNA。在NCBI上查找ALP、OPN、RUNX2、BMP2、Ki67、MCM-2及內(nèi)參GAPDH的mRNA序列，Primer 5軟件設(shè)計引物，引物序列見（表1)，由生工生物工程股份有限公司合成，使用Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行qPCR，每個反應(yīng)使用同一cDNA 樣品進(jìn)行3次重復(fù)。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃5 min，1個循環(huán)；變性95℃10 s，退火/延伸60℃30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算目標(biāo)基因相對于內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)量。

表1 增殖及成骨相關(guān)基因引物序列

1.2.7 Western blot 蛋白表達(dá)檢測 取JBMMSCs 以3×105個/孔的密度接種于六孔板中，以上述分組培養(yǎng)3 d 后用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞并提蛋白，BCA 法測蛋白濃度后，與loading buffer 混合為20 μg 蛋白樣本，100℃煮沸后，加入SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，隨后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h，OPN、Ki67、RUNX2、MCM-2（1∶1000）一抗于4℃孵育過夜；次日，1×TBST 洗PVDF 膜3 遍，每遍5 min 后室溫孵育1∶2000 稀釋的二抗1 h，再次洗PVDF 膜3遍，每遍10 min，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)灰度值分析蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，多組間比較用方差分析，若方差齊則兩兩比較用t 檢驗(yàn)，P<0.05 為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 JBMMSCs 形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的JBMMSCs 4 h貼壁，6 h細(xì)胞伸展呈紡錘狀、短梭形或多角形，細(xì)胞集落融合成片，呈玫瑰花狀生長。3～4 d 匯合達(dá)90%進(jìn)行消化、傳代。傳代后的細(xì)胞增殖速度明顯減慢，但細(xì)胞體積略變大，形態(tài)較為均一，胞漿豐富，緊貼于皿底（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察JBMMSCs形態(tài)

2.2 JBMMSCs 流式表型分析 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:JBMMSCs 表面相對特異性標(biāo)志物：CD29（99.6%）、CD90（79%）陽性表達(dá)，CD45（0.1%）陰性表達(dá)。表明本實(shí)驗(yàn)所用的JBMMSCs 與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似表型（圖2）。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測JBMMSCs的表型

2.3 CCK-8 細(xì)胞增殖檢測 不同濃度NGF 刺激JBMMSCs 后CCK-8 檢測結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時間延長，各組細(xì)胞增殖明顯增加。與對照組比較，第3 d 時100 ng/ml組細(xì)胞呈現(xiàn)增殖趨勢；第5 d時50 ng/ml、100 ng/ml組細(xì)胞增殖顯著（P<0.05，P<0.0001），第7 d各組均較對照組細(xì)胞增殖速度顯著增加，其中50 ng/ml、100 ng/ml組JBMMSCs細(xì)胞活力均高度顯著增加（P<0.001）。以上結(jié)果可表明，NGF可促進(jìn)JBMMSCs增殖，其促進(jìn)作用具有NGF濃度和時間依賴性（圖3）。

圖3 不同濃度的NGF對JBMMSCs增殖能力的影響（*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001,Mean±SEM，n=6）

2.4 ALP活性檢測 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7 d，ALP染色胞漿呈現(xiàn)藍(lán)紫色，隨著NGF濃度增加，細(xì)胞增多，胞漿染色加深。當(dāng)NGF在濃度大于50 ng/ml時，細(xì)胞呈團(tuán)塊狀，胞漿染色呈深紫藍(lán)色，表明ALP活性明顯增強(qiáng)。圖像灰度半定量分析結(jié)果顯示50 ng/ml、100 ng/ml組ALP 活性顯 著高 于0 ng/ml組及10 ng/ml組（P<0.05）（圖4）。

圖4 不同濃度NGF對JBMMSCs ALP染色結(jié)果的影響

2.5 Real-timePCR 增殖及成骨相關(guān)基因檢測 不同濃度的NGF 處理JBMMSCs 3 d，可見與0 ng/ml組比較,各組ALP、OPN、BMP2、RUNX2的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），其中50ng組、100ng組更顯著（P<0.0001）。此外，Ki67、MCM-2 的表達(dá)量隨著濃度的升高而升高，而100 ng/ml NGF 時表達(dá)量卻呈明顯下降趨勢（P<0.05）（圖5）。

圖5 qRT?PCR檢測不同濃度NGF對JBMMSCs成骨及增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響（A?F）隨著NGF濃度的增加，ALP、OPN、RUNX2、BMP2的mRNA表達(dá)量也隨之增加；Ki67、MCM?2在NGF 50 ng/ml時表達(dá)量達(dá)到最高，100 ng/ml NGF時表達(dá)量卻呈下降趨勢（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,Mean±SEM，n=3）

2.6 Western blot 檢測增殖及成骨相關(guān)蛋白表達(dá) NGF 處理JBMMSCs 3 d，WB 結(jié)果顯示：OPN、Ki67、MCM-2 表達(dá)隨著NGF 濃度升高而升高（P<0.05），而RUNX2 在低濃度時mRNA 表達(dá)呈濃度依賴性，而在100 ng/ml高濃度時呈下降趨勢（P<0.001）（圖6）。

圖6 WB檢測不同濃度NGF對JBMMSCs增殖及成骨相關(guān)蛋白表達(dá)

3.討論

提高下頜骨缺損修復(fù)效果、減少其延遲愈合或不愈合，始終是口腔臨床醫(yī)學(xué)中亟待解決的重要課題。近來，越來越多的研究表明骨骼感覺神經(jīng)在骨骼損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用，NGF 也因此受到越來越多的關(guān)注。NGF 作為最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，具有營養(yǎng)神經(jīng)元和促進(jìn)突起生長的雙重生物學(xué)功能［9］，此外，NGF 還可通過其高親和力的受體原肌球蛋白受體激酶A (TrkA）誘導(dǎo)骨骼神經(jīng)再生，進(jìn)而對骨修復(fù)后期的發(fā)生的血運(yùn)重建和骨基質(zhì)沉積發(fā)揮促進(jìn)作用［8,12,13］。Grills［14］等人在肋骨骨折的大鼠模型中首次發(fā)現(xiàn)，在骨折斷端處的骨膜祖細(xì)胞、成熟或不成熟的骨細(xì)胞、部分軟骨細(xì)胞中均有NGF 的出現(xiàn)，以旁分泌和自分泌的形式作用于骨折端的成骨細(xì)胞。Li Z［11］等人的研究發(fā)現(xiàn)，在骨折小鼠的組織學(xué)切片中顯示骨膜基質(zhì)祖細(xì)胞和骨折相關(guān)的巨噬細(xì)胞中NGF 的表達(dá)顯著上調(diào)，且反應(yīng)性骨膜中富含NGF的CGRP+TrkA+的感覺神經(jīng)纖維活化明顯；通過注射TrkA 抑制劑1NMPP1抑制其活性，可發(fā)現(xiàn)感覺神經(jīng)纖維數(shù)量的減少，更重要的是骨折處血運(yùn)重建減緩，骨折處組織愈合顯著延遲，這說明NGF可能通過TrkA 調(diào)控骨組織修復(fù)。同樣的，Asaumi［15］等人在大鼠股骨骨折模型中發(fā)現(xiàn)，NGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotrophins-3）的mRNA 表達(dá)水平在骨折修復(fù)過程中增加，且在骨折發(fā)生的第二天其NGF 的值達(dá)到頂峰，明確了NGF 在骨損傷修復(fù)中的重要促進(jìn)作用。新出現(xiàn)的證據(jù)表明［9,13］，NGF 除了可誘導(dǎo)神經(jīng)生長并促進(jìn)其存活，NGF 還可與其低親和力受體P75 結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞向骨組織受損處遷移，促進(jìn)骨愈合。綜上所述，NGF 不僅能夠在周圍神經(jīng)損傷時發(fā)揮維持、保護(hù)及再生的作用，同時能夠促進(jìn)細(xì)胞向骨組織損傷處遷移，上調(diào)成骨基因表達(dá)，并加快損傷周圍的骨組織愈合速度。但這些研究多集中在股骨、肋骨等骨組織，而NGF對頜骨損傷修復(fù)的作用尚未見報道。

顱頜面骨是由外胚層的神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育而來，其骨形成的方式為膜內(nèi)成骨，不同于由中胚層的間葉細(xì)胞發(fā)育而來的長骨—軟骨成骨［1,2］。哺乳動物顱面骨的修復(fù)及再生需要多種類型的細(xì)胞和外在誘導(dǎo)因子的共同作用，與軀干骨不同，頜骨的發(fā)育形成和愈合不需要軟骨作為基礎(chǔ)，而是由間充質(zhì)祖細(xì)胞凝聚而成［11,12,16］。JBMMSCs 作為頜骨組織中骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，具有明確的定向成骨分化能力。近年來，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)JBMMSCs 的成骨分化能力要明顯優(yōu)于BMSCs。Aghaloo 等人［6］對原代頜骨與長骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行比較研究，通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)：JBMMSCs 中堿性磷酸酶活性、成骨細(xì)胞礦化等基因表達(dá)量明顯高于BMSCs。更重要的是，植入裸鼠后，頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形成的鈣結(jié)節(jié)較長骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所形成的鈣結(jié)節(jié)大70%，骨礦化程度是長骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的3 倍。本實(shí)驗(yàn)與之相似，Brandon 等人［7］比較了豬頜骨與長骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖、成骨分化特性和基因表達(dá)的不同。結(jié)果顯示JBMMSCs 的增殖和成骨分化能力明顯強(qiáng)于BMSCs，此外，通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)404個高豐度的基因，其中334個基因與成骨和成血管相關(guān)，48個基因的差異表達(dá)至少升高1.5 倍，顱神經(jīng)嵴相關(guān)基因BMP44 在頜骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中高表達(dá)。本課題前期實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)JBMMSCs 具有自我增殖、更新及多向分化能力，可作為種子細(xì)胞適用于同源性骨缺損的修復(fù)與再生。然而，單純JBMMSCs 的成骨分化能力依舊較差［17］。因此，研究外胚層細(xì)胞來源的NGF 對同樣來源于外胚層的JBMMSCs 增殖及成骨分化能力的影響，以及可能的理論機(jī)制，對提高JBMMSCs 的成骨分化及增殖效率，進(jìn)而修復(fù)頜骨缺損具有重要意義。

NGF的濃度對其作用效果有重要影響。崔國勝［18］等人研究NGF對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響，選用100 ng/ml NGF為終濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：NGF可能通過TrkA受體，在一定程度上促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化、增強(qiáng)其礦化能力，且此促進(jìn)作用可以被TrkA受體抑制劑K252a阻斷。此外，汪瓊等人［19］研究了NGF對脂多糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，選用100 ng/ml NGF對成骨細(xì)胞進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)：高中劑量的NGF可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞一氧化氮的釋放，該濃度下細(xì)胞活力不受影響。本實(shí)驗(yàn)對比研究了不同濃度NGF 對JBMMSCs的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定濃度的NGF能夠有效的提高JBMMSCs的增殖及成骨分化能力，但不同濃度NGF作用不盡相同。50 ng/ml NGF能有效提高JBMMSCs的增殖能力且其增殖能力隨NGF濃度的增加而提高，同時Ki67、MCM-2等基因及蛋白的表達(dá)在一定濃度范圍內(nèi)也隨濃度增加而增加，但100 ng/ml NGF時，Ki67、MCM-2的表達(dá)卻呈下降趨勢。不同濃度NGF對JBMMSCs分化的影響也呈現(xiàn)此特點(diǎn)。JBMMSCs 表達(dá)ALP、OPN、RUNX2、BMP2等成骨相關(guān)基因，而且隨著NGF劑量的加大，ALP、OPN、RUNX2、BMP2的基因及蛋白表達(dá)也隨之升高，但在100 ng/ml時，這些基因及蛋白表達(dá)卻下降。這表明：NGF在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性，濃度過高作用反而下降。本實(shí)驗(yàn)濃度篩選結(jié)果表明：50 ng/ml NGF刺激能有效提高外胚層來源的JBMMSCs 增殖及成骨分化能力，該濃度為應(yīng)用JBMMSCs 修復(fù)骨缺損、促進(jìn)骨再生的最佳濃度。50 ng/ml NGF的刺激與正常干細(xì)胞最為接近，可模擬最佳的體內(nèi)修復(fù)環(huán)境?？梢?，給予不同濃度NGF對應(yīng)用JBMMSCs治療頜骨缺損等疾病具有重要意義。

綜上所述：本研究檢測了不同濃度NGF 對小鼠JBMMSCs 增殖及成骨分化的影響,為NGF 應(yīng)用于頜骨缺損、骨代謝性疾病所致的骨質(zhì)不佳、骨量不足進(jìn)行骨修復(fù)和再生治療提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。也為進(jìn)一步研究神經(jīng)刺激在頜骨修復(fù)再生中的作用奠定基礎(chǔ)。