孔繁聰 齊凌 黃文鋒 喻敏 周玉蘭 李菲

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是造血干、祖細胞異?？寺⌒栽鲋硨е碌难合到y(tǒng)惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)及預后具有高度異質性。基因突變是導致其異質性的重要原因。超過70%的AML 患者中編碼參與表觀遺傳學調控蛋白質的基因發(fā)生突變，這些基因突變影響造血細胞的自我更新和分化，促使其向髓系轉化，在AML 發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。DNA 甲基化是表觀遺傳學調控的重要組成部分，DNA甲基轉移酶3A（DNMT3A）和甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）是AML 中最常見的調控DNA 甲基化的基因。TET2 基因位于染色體4q24，編碼的TET2 蛋白通過將5-甲基胞嘧啶（5-mC）轉化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）參與DNA 去甲基化，下調DNA 甲基化水平[2]。TET2 發(fā)生功能缺失突變可促進啟動子甲基化，從而導致造血干細胞異常增殖和分化，誘發(fā)髓系惡性腫瘤[3]。多種髓系腫瘤中均可檢測到TET2 突變，常與不良預后有關。關于TET2 突變在AML 患者中的預后意義尚無共識，部分學者認為合并TET2 突變患者預后差[4]，另有部分學者則認為TET2 突變不影響患者預后[5]。目前一致的觀點為在合并CEBPA 雙突變或NPM1 突變且FLT3 突變陰性的正常核型AML患者中，TET2 突變與不良預后相關，表現(xiàn)為無事件生存時間（event-free survival，EFS）、無病生存時間（disease-free survival，DFS)和總生存期（overall survival，OS）縮短[6-7]，提示單獨TET2 突變對AML 患者的預后價值有限，TET2 突變對預后的影響可能依賴與其共存的突變基因。DNMT3A 突變是TET2 突變常見的共存突變之一，該突變與高水平腫瘤負荷相關，是預后不良的分子標志[8]。然而，TET2 和DNMT3A 兩種基因突變共存時對AML 患者預后的影響模式尚未明確。隨著二代測序技術（NGS）在AML 領域的廣泛應用，越來越多的突變基因被發(fā)現(xiàn)，這些突變基因與TET2 突變?nèi)绾喂餐绊慉ML 患者預后值得進一步探索。本研究將對初治并行血液腫瘤相關突變基因外顯子NGS 檢測的AML 患者進行回顧性分析，探究TET2 合并DNMT3A 突變及其他共存基因突變對AML 患者預后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2018 年1 月至2021 年9 月于南昌大學第一附屬醫(yī)院確診的初治且行血液腫瘤相關突變基因外顯子NGS 檢測的512 例成人AML（非M3 型）患者的臨床資料，納入64 例合并TET2 突變患者為研究對象，其中TET2 合并DNMT3A 突變患者27 例，同時納入同期46 例DNMT3A 單突變患者作為對照。男性50 例，女性60 例，中位年齡54（15～79）歲。年齡＜60 歲患者74 例（67.3%），年齡≥60 歲患者36 例（32.7%）。原發(fā)AML 104 例（94.5%），繼發(fā)AML 6 例（5.5%），其中5 例繼發(fā)于骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome,MDS)，1 例繼發(fā)于慢性粒單核細胞白血?。╟hronic myelomonocytic leukemia,CMML）。根據(jù)中國急性髓系白血病診療指南[9]進行危險度分層：低危34 例（30.9%），中危32 例（29.1%），高危44 例（40.0%）。所有入組患者治療前均經(jīng)細胞形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學、分子生物學確診[10]，另外抽取3 mL 骨髓（EDTA 抗凝管）送檢血液腫瘤相關基因外顯子NGS 檢測。本研究檢測的56 種血液系統(tǒng)腫瘤相關基因包括：ANKRD26、ASXL1、ASXL2、BCOR、BCORL1、CASP8、CBL、CCND1、CCDN2、CCDN3、CDC25C、CDKN1B、CEBPA、CSF3R、CUX1、DDX41、DNMT3A、ETV6、EZH2、FLT3、GATA1、GATA2、IDH1、IDH2、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KMT2A、KRAS、NF1、NPM1、NRAS、PHF6、PTEN、PTPN11、RAD21、RELN、RUNX1、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SMC1A、SMC3、SRP72、SRSF2、STAG2、TERT、TET2、TP53、U2AF1、WT1、ZBTB7A、ZRSR2。本研究經(jīng)南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準且患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液腫瘤相關基因外顯子NGS 檢測方法 提取送檢標本中基因組DNA，分析上述基因蛋白質編碼區(qū)域的點突變和短片斷插入/缺失突變。檢測采用NGS 方法進行。使用Illumina 測序平臺，靶向檢測與血液腫瘤密切相關的56 個基因的外顯子區(qū)，平均基因覆蓋率＞99%，平均檢測深度為2 000×，測序原始數(shù)據(jù)采用Torrent Suitev 3.0 軟件進行分析。

1.2.2 治療方案 誘導化療方案包括：標準劑量阿糖胞苷（Ara-C）聯(lián)合伊達比星（IDA）或柔紅霉素（DNR），IA 或DA 方案；去甲基化藥物單藥或聯(lián)合預激方案（包括Ara-C、粒細胞集落刺激因子聯(lián)合阿克拉霉素、依托泊苷或高三尖杉酯堿）。去甲基化藥物包括阿扎胞苷或地西他濱。姑息治療是以降低白細胞為目的，應用小劑量Ara-C 或羥基脲的最佳支持治療。具體用藥劑量參考中國成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜毎籽。┰\療指南（2017 年版）[9]。接受誘導治療患者100 例（90.9%），其中IA/DA 方案77 例、去甲基化藥物單藥或聯(lián)合預激方案21 例、其他方案2 例，姑息治療10 例（9.1%）。

1.2.3 療效評價 治療間歇期（化療間歇第14 天）、恢復期（化療間歇第28 天）行骨髓穿刺評估化療效果。療效評估標準參照張之南《血液病診斷及療效標準》[11]。包括：完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、未緩解（non-response，NR）。

1.2.4 隨訪 隨訪方式以住院病歷、門診病歷及電話為主。隨訪日期截至2021 年11 月或患者死亡日期，失訪患者截至失訪日期。中位隨訪時間19.9（16.4～23.4）個月，失訪患者2 例（1.8%）。OS 定義為自診斷日期至患者死亡或隨訪截止日期。無復發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）時間定義為患者達血液學CR 日期至患者死亡、首次復發(fā)或隨訪截止日期。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。以中位數(shù)（median，M）范圍進行連續(xù)性變量描述，百分比（%）描述分類資料。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。使用GraphPad Prism 8.0 繪制OS、RFS 生存曲線以及基因突變發(fā)生率柱狀圖。對于影響OS 的因素，行單因素和Cox 比例風險回歸模型多因素分析。均采用雙側檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TET2 突變患者的基因特征分析

512 例AML 患者中共檢測到TET2 突變64 例，突變頻率為12.5%（64/512），每例TET2 突變患者突變基因譜概況見圖1（圖中僅顯示已知功能類基因，基因功能分類以文獻[12]為參考）?；蛲蛔償?shù)目為1、2、3 個及數(shù)目≥4 個的患者分別有1 例占1.6%（1/64）、6 例占9.4%（6/64）、8 例占12.5%（8/64）及49 例占76.5%（49/64），基因突變數(shù)目≥2 個的患者比例高達98.4（63/64），每例患者平均合并5.2 個突變基因。與TET2 共突變發(fā)生率最高的基因為NPM1 43.8%（28/64），其次為DNMT3A 42.2%（27/64）、FLT3-ITD/TKD 40.6%（26/64）、CEBPA 26.6%（17/64）、TTN 20.3%（13/64），K/NRAS、WT1 共突變率均為15.6%（10/64），KIT、TP53 共突變率分別為14.1%（9/64）和12.5%（8/64），IDH1/2、ASXL1 和MUC16A 共突變率均為10.9%（7/64），共突變發(fā)生率≥5%的基因見圖2。

圖1 64 例TET2 突變AML 患者突變基因譜概況

圖2 TET2 共存突變基因發(fā)生率

2.2 TET2 及DNMT3A 突變對患者療效及生存的影響

為排除不同治療方案對預后的影響，本研究將接受IA/DA 方案誘導化療且進行完整療效評估、年齡≤65 歲的70 例原發(fā)AML 患者納入療效及生存分析。TET2 合并DNMT3A 突變患者初次誘導CR 率為46.2%，低于TET2 單突變患者的76.9%（P=0.077），與DNMT3A 單突變患者無顯著性差異（P=0.952）。生存分析顯示，TET2 合并DNMT3A 突變患者的中位總生存期（median overall survival，mOS）時間為9.5個月，2 年OS 率為21.4%（95%CI：0～46.7%），明顯低于TET2 單突變患者[mOS：N/A，P=0.002；2 年OS率：60.6%（95%CI：38.8%～82.4%），P＜0.05]，而與DNMT3A 單突變患者的mOS 及2 年OS 率均無顯著性差異[mOS：25.1 個月，P=0.414；2 年OS 率：50.5%（95%CI：31.7%～69.3%），P＞0.05）]，見圖3A。TET2 合并DNMT3A 突變患者的中位RFS（median RFS，mRFS）為10.5 個月，2 年RFS 率為34.3%（95%CI：31.4%～65.5%）；TET2 或DNMT3A 單突變患者的mRFS 均為N/A，2 年RFS 率分別為63.4%（95%CI ：41.1%～85.7%）和59.4%（95%CI：22.2%～96.6%），三者之間mRFS 及2 年RFS 率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05，圖3B）。

圖3 患者的生存分析

2.3 TET2 與其他常見共存突變對患者療效及OS 的影響

TET2 突變背景下，其他常見共存突變對療效及OS 的影響見表1（受病例數(shù)限制，僅分析共存突變對OS 的影響）。伴K/NRAS 突變患者的CR 率為28.6%，明顯低于無K/NRAS 突變患者的75.0%（P=0.030），而是否合并NPM1、FLT3-ITD、CEBPA 雙等位基因突變（CEBPAdm）、TTN 或WT1 突變對CR 率均無顯著性差異（均P＞0.05）。在OS 方面，合并FLT3-ITD突變患者的OS 明顯短于無FLT3-ITD 突變患者（P=0.030），而是否合并NPM1、CEBPAdm、TTN、K/NRAS 或WT1 突變對OS 差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表1 TET2 與其他基因突變對AML 患者療效及OS 的影響

2.4 影響TET2 突變AML 患者OS 的單因素及多因素分析

目前，已知初診時年齡、外周血白細胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平及某些基因突變對AML 患者預后有明確影響。前面已分析DNMT3A 和FLT3-ITD 突變對TET2 突變AML 患者的OS 有顯著影響。為研究影響TET2 突變AML 患者OS 的獨立預后影響因素，納入DNMT3A、FLT3-ITD、年齡、WBC、LDH、骨髓原始細胞比例、預后分層等進行單因素分析，逐一篩選出有差異的影響因素。結果顯示年齡≥60 歲、合并DNMT3A 突變、合并FLT3-ITD 突變、初次誘導療效未達CR 是影響TET2 突變AML 患者OS 的預后不良因素（P＜0.05），而其他因素對OS 無顯著性影響（P＞0.05，表2）。將單因素分析中有統(tǒng)計學意義者納入Cox 比例風險回歸模型進行多因素分析，結果表明年齡≥60 歲、合并FLT3-ITD 突變、初次誘導療效未達CR 為影響TET2 突變AML 患者OS 的獨立危險因素（表2）。

表2 影響TET2 突變AML 患者OS 的單因素及多因素分析

3 討論

成人AML 是一類具有高度異質性的疾病，基于NGS 技術檢測突變基因并進行危險度分層是實現(xiàn)精準治療及改善預后的前提。隨著NGS 技術在臨床的廣泛應用，越來越多的表觀遺傳調控相關基因突變被發(fā)現(xiàn)，這些突變基因通過改變?nèi)旧|結構，促進癌基因異常激活和（或）抑癌基因失活，導致白血病細胞異常增殖和分化[13]。TET2 和DNMT3A 是常見的表觀遺傳調控基因，二者共同維持著DNA 甲基化與去甲基化的動態(tài)平衡。研究表明，TET2 和DNMT3A 突變均出現(xiàn)在白血病演變的前期[14]，且TET2 或DNMT3A突變的造血干細胞均表現(xiàn)出相似的分化缺陷[15]，這兩種基因突變可能是白血病發(fā)生的始動突變，二者在白血病的發(fā)生過程中具有協(xié)同作用。DNMT3A 突變在AML 患者中預后不良[8]，TET2 合并DNMT3A 突變是否影響AML 患者預后尚未明確。本研究結果發(fā)現(xiàn)TET2 伴DNMT3A 突變患者初次誘導CR 率（46.2%）低于TET2 單突變患者（76.9%），與DNMT3A 單突變患者（45.2%）無顯著性差異。生存分析表明，TET2 合并DNMT3A 突變患者的mOS 及2 年OS 率顯著低于TET2 單突變患者，而與DNMT3A 單突變患者無顯著性差異，提示AML 患者在TET2 突變基礎上合并DNMT3A 突變影響患者預后。劉潔等[16]研究發(fā)現(xiàn)，8 例TET2 合并DNMT3A 突變和33 例DNMT3A 單突變患者的初次誘導CR 率分別為83.3%和61.3%，高于本研究結果；Aslanyan 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與DNMT3A單突變者（18 例）比較，TET2 合并DNMT3A 突變者（9 例）的OS 有降低趨勢（P=0.066）。上述研究與本研究結果有差異，可能與這兩個研究中兩組患者誘導化療方案不同及樣本量偏少有關；本研究中部分患者在完成誘導化療后未接受后續(xù)治療，亦會影響預后。上述研究表明，消除年齡及誘導方案等混雜因素后，TET2 突變在AML 患者中的預后可能更多地依賴與其相伴隨的共存突變。

AML 患者常出現(xiàn)多個基因共存突變。Papaemmanuil 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，86%AML 患者攜帶至少2 個突變基因。李劍雄等[18]應用高通量測序技術對93 例AML 患者行34 種血液腫瘤相關的基因檢測發(fā)現(xiàn)53.8%的AML 患者攜帶至少2 個突變基因。本研究對512 例AML 患者進行基因突變檢測，共檢出64 例合并TET2 突變患者，突變頻率為12.5%，與Chen 等[19]報道結果相符。其中，98.4% 的TET2 突變AML 患者攜帶≥2 個突變基因，半數(shù)以上（76.5%）攜帶≥4 個突變基因，平均每例患者合并5.2 個突變基因。本研究共存突變基因發(fā)生率高于上述文獻報道，與本研究檢測的突變基因種類更多及分析隊列不同有關（針對TET2 突變患者），此外人種或生活環(huán)境的差異亦有影響。NPM1、DNMT3A、FLT3-ITD/TKD、CEBPA、TTN等突變?yōu)門ET2 常見的共存突變，與相關研究結果[20-21]報道一致。除共存突變外，AML 患者中亦可檢出互斥突變。也有研究發(fā)現(xiàn)，TET2 突變與IDH1 或IDH2為互斥突變，因為兩者在AML 中的部分作用相互重疊[22]。本研究觀察到TET2 突變與IDH1 或IDH2 突變共存，而未發(fā)現(xiàn)TET2 突變同時合并IDH1 和IDH2 突變，可能與IDH1 與IDH2 共突變率較低或TET2 突變背景下IDH1 與IDH2 突變相互排斥有關。上述研究結果表明，白血病的發(fā)生由多個突變基因綜合作用的結果，契合白血病“二次打擊”學說。

多種髓系腫瘤中存在TET2 突變，多與預后不良相關，而在CMML 患者中TET2 突變提示OS 較好[23]。在AML 患者中，TET2 單獨突變對預后的影響尚存爭議[5,24]。大部分研究認為其在細胞遺傳學正常且ELN2017 危險度分層低?；颊咧刑崾静涣碱A后，這部分患者EFS 明顯縮短，而在ELN 中危患者中對預后無不良影響[7]。Liu 等[25]對8 項研究共2 552 例AML患者進行Meta 分析，結果提示TET2 突變對細胞遺傳學正常和危險度分層為低危及中危的患者均有不良預后影響。提示大部分研究并未將年齡及誘導治療方案進行分類分析，一定程度上影響了對結果的解讀。盡管如此，這些結果仍然提示單個TET2 突變對AML的預后價值有限?；诖?，有必要探索TET2 聯(lián)合其他基因突變在AML 患者中的預后意義。

本研究在TET2 突變基礎上聯(lián)合其他突變基因對AML 患者進行預后分析，結果發(fā)現(xiàn)合并K/NRAS突變患者的CR 率明顯低于無K/NRAS 突變患者。目前，K/NRAS 突變對AML 患者療效及預后的影響尚未明確。Wang 等[26]對1 149 例初治AML 患者進行NGS 檢測，NRAS 突變合并U2AF1 突變患者誘導緩解率低、預后差，證實了多基因聯(lián)合突變在AML 預后評估中的價值。本研究未發(fā)現(xiàn)K/NRAS 突變對OS 具有不利影響，且因病例數(shù)少，未將KRAS 和NRAS 突變分開比較，可能是導致與文獻報道結果差異的原因，后續(xù)可擴大樣本量及延長隨訪時間進一步分析。FLT3/ITD 高頻突變AML 患者CR 率低、OS 短、易復發(fā)[9]，F(xiàn)LT3/ITD 突變合并其他基因突變亦提示預后不良。本研究發(fā)現(xiàn)TET2 突變合并FLT3-ITD 突變患者的OS 明顯短于TET2 突變不合并FLT3-ITD 突變患者，但CR 率無顯著性差異，可能與納入的FLT3-ITD 突變患者中63.6%（7/11）為低頻突變有關。

綜上所述，TET2 突變常合并多種共存突變，共存突變影響患者療效及預后。鑒于本研究納入病例數(shù)及隨訪時間有限，結果存在一定局限性，未來可進行更大樣本量的前瞻性研究進一步明確TET2 突變及其共存突變在AML 患者中的預后價值。