李冰玉，趙博，夏中元

(武漢大學人民醫(yī)院麻醉科，武漢430060)

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)可發(fā)生在心、腦、肺、腸、腎等器官，是影響心肌梗死、腦梗死等危重疾病預后的重要因素[1]。IRI的病理機制復雜，包括血供恢復后繼發(fā)活性氧大量產生、線粒體功能障礙、細胞內離子代謝失衡、自噬凋亡等程序性細胞死亡、興奮性氨基酸的毒性作用以及炎癥反應等[2]。近年來，鐵死亡在IRI中的重要作用逐漸受到關注[1-2]。鐵死亡是一種以脂質過氧化為特征的鐵依賴性細胞程序化死亡方式，被定義為鐵代謝紊亂導致的脂質活性氧堆積而引發(fā)的細胞死亡，形態(tài)學上表現為線粒體皺縮變小、線粒體膜密度增加及線粒體嵴減少或消失等[3]。鐵代謝以及活性氧的產生與清除失衡是鐵死亡在IRI中發(fā)揮作用的基礎[4]。鐵自噬與鐵死亡作為鐵代謝調節(jié)的兩條重要途徑聯系緊密，有研究發(fā)現，鐵自噬是誘導鐵死亡所必需[5-6]，鐵死亡發(fā)揮作用時鐵自噬往往參與其中[7-8]。鐵自噬也參與IRI的過程，且鐵自噬與IRI中氧化應激、鐵死亡、鐵超載等關鍵病理生理機制密切相關[5-9]?，F就鐵自噬與IRI的研究進展予以綜述，以期為后期基礎研究及臨床治療提供參考。

1 鐵自噬概述

1.1鐵自噬概念的提出 鐵自噬是一種調控鐵離子代謝的特殊自噬。作為人體中鐵的主要存儲形式之一的鐵蛋白，由核受體輔激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)這一選擇性運載受體介導，被轉運至自噬小體內并通過自噬體-溶酶體途徑降解，釋放出鐵離子。Mancias等[10]通過定量蛋白質組學對自噬體中包括運載受體在內的所有蛋白質進行分析，發(fā)現NCOA4與鐵蛋白密切相關，從而首次發(fā)現并命名了鐵自噬這一過程。

1.2鐵自噬水平的調節(jié) 鐵自噬水平由NCOA4水平決定，而NCOA4水平又受細胞中鐵水平調節(jié)，泛素-蛋白酶體途徑在其中發(fā)揮的作用有待進一步研究。正常生理情況下，當細胞內鐵水平較高時，NCOA4以鐵依賴的方式與E3泛素連接酶HERC2相互作用，并通過泛素-蛋白酶體途徑靶向降解，因此NCOA4水平降低，從而鐵自噬水平降低；反之，細胞鐵水平較低時，NCOA4水平和自噬水平升高，以補充細胞可利用鐵[11]。同時，純化蛋白質研究發(fā)現，鐵水平升高還能夠抑制NCOA4與鐵蛋白結合，從而進一步抑制鐵自噬發(fā)生[12]。然而，在通過脂多糖誘導膿毒癥時，鐵自噬水平上調并誘發(fā)鐵死亡，此時應用泛素-蛋白酶體途徑特異性的抑制劑不會影響鐵蛋白水平[13]，即在膿毒癥模型中泛素-蛋白酶體途徑可能并沒有參與脂多糖誘導的鐵蛋白降解，但也不能排除應激狀態(tài)下鐵蛋白表達增加抵消鐵自噬對鐵蛋白的消耗，但具體機制有待進一步研究。

在非生理狀況下，鐵自噬水平變化可能表現為上調、受抑制甚至不變。在胰腺導管腺癌中，泛素E3連接酶三基序蛋白質11可抑制鐵自噬[14]，而抗真菌藥物環(huán)匹羅司可促進鐵自噬發(fā)生[15]，在胰腺癌細胞中使用erastin后鐵自噬水平無變化[16]。病理條件下鐵自噬水平變化仍不明確，藥物干預對鐵自噬的影響也有待進一步研究。

1.3鐵自噬與鐵死亡的關系 鐵自噬與鐵死亡密切相關，目前大多數研究提示鐵自噬是調控鐵死亡的重要環(huán)節(jié)，鐵自噬水平上調可促進鐵死亡的發(fā)生，鐵自噬水平下調則可抑制鐵死亡。Hou等[16]發(fā)現敲除或敲低自噬相關蛋白5和自噬相關蛋白7可抑制 erastin誘導的鐵死亡，表現為細胞內游離鐵水平降低，脂質過氧化減少，谷胱甘肽水平增加；而基因沉默NCOA4同樣可抑制鐵蛋白降解和鐵死亡，細胞內游離鐵水平和氧化應激水平降低，谷胱甘肽水平增高；NCOA4過表達則促進鐵蛋白降解和鐵死亡。來自血管內皮細胞的外泌體可通過抑制鐵自噬來拮抗糖皮質激素誘導的骨質疏松癥，從而抑制成骨細胞的鐵死亡[17]。然而，在Gryzik等[18]應用NCOA4基因表達調控技術及多種鐵死亡誘導劑對多種品系細胞進行的實驗研究中，雖然大多數實驗結果支持鐵自噬對鐵死亡具有調控作用，但在HeLa細胞中表現出Ras選擇性致死化合物3誘導的鐵死亡水平與鐵自噬水平無關。因此，在大多數情況下，鐵自噬對鐵死亡具有調控作用，但在特定的組織、細胞及病理生理背景下，鐵自噬與鐵死亡的關系仍不明確。

鐵死亡對鐵自噬的作用尚不明確，在不同鐵死亡誘導劑作用下，鐵死亡水平上調，但NCOA4介導的鐵自噬水平變化不同。索拉非尼處理后肝星狀細胞中NCOA4表達增加[6]，而在胰腺癌細胞中厄拉汀治療前后的NCOA4表達無差異[16]，使用青蒿琥酯后，肝星狀細胞中NCOA4表達水平及鐵自噬水平甚至降低[19]，提示鐵死亡對鐵自噬可能無特定調控機制。在這些研究中，應用鐵死亡誘導劑后鐵自噬水平變化表現出的復雜性是否與特定細胞、病理生理背景及化合物有關仍有待探究。

1.4鐵自噬在鐵代謝中的作用 NCOA4及其介導的鐵自噬過程在調節(jié)機體鐵代謝、維持鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。鐵可作為合成血紅蛋白的關鍵組分參與氧的結合及運輸，作為輔酶參與神經遞質的合成，作為檸檬酸循環(huán)和電子運輸的輔酶因子參與ATP的產生、DNA的生物合成及修復等，維持鐵代謝的平衡對機體至關重要[20]。敲除NCOA4后觀察到因鐵缺乏導致的血紅蛋白合成障礙與小細胞低色素性貧血，表明NCOA4對調控鐵代謝具有重要作用[11，21]。另外，實驗觀察到鐵蛋白的蓄積以及血清鐵減少的機制可能為NCOA4缺乏導致鐵自噬無法完成，即鐵蛋白無法正常降解釋放出細胞可利用鐵；為維持正常生理活動，機體消耗血清鐵，導致血清鐵減少，并由于缺鐵導致小細胞低色素性貧血[11，21]。由此可見，NCOA4介導的鐵自噬在鐵代謝的調控中發(fā)揮重要作用，鐵自噬水平的改變可引起鐵代謝紊亂，從而誘發(fā)疾病。

2 鐵自噬在IRI中的作用

NCOA4介導的鐵自噬作為調節(jié)鐵代謝的重要途徑，在神經變性疾病、缺鐵性貧血等疾病中均有重要作用，此外，鐵自噬還在多種臟器中參與IRI的發(fā)生發(fā)展過程[20]。心、腦、腎等臟器發(fā)生缺血再灌注后，在宏觀層面表現為受累組織壞死，受損細胞死亡；在微觀層面則觀察到受累細胞中NCOA4表達增加，鐵自噬水平上調，因而組織細胞中游離鐵增加，同時自噬小體增多、線粒體形態(tài)發(fā)生皺縮等改變，活性氧大量產生，細胞內還原性物質谷胱甘肽等減少，氧化還原產物丙二醛等增加，鐵蛋白水平表現為先降低后升高至高于正常水平的動態(tài)變化[8，22-24]。研究發(fā)現，鐵蛋白信使RNA水平在再灌注發(fā)生后24 h內隨時間推移不斷升高，且游離鐵水平增高可導致鐵調節(jié)蛋白失活進一步促進鐵蛋白翻譯，因此鐵蛋白水平的特殊變化可能是鐵蛋白表達水平升高和降解增多綜合作用的結果[8，25]。然而，作為鐵儲存形式的鐵蛋白生成增加并未引起游離鐵減少，其原因可能與鐵代謝的其他調節(jié)機制有關，缺血再灌注后鐵代謝變化的具體機制仍有待研究。

選擇性抑制鐵自噬可以顯著減輕IRI。在缺血再灌注病理條件下，基因沉默鐵自噬的關鍵蛋白NCOA4可導致腦組織梗死體積減小，神經功能評分升高，且與未進行NCOA4敲除的神經元相比，NCOA4敲除的神經元谷胱甘肽水平和谷胱甘肽過氧化物酶活性升高，丙二醛水平降低，發(fā)生皺縮的線粒體減少[8]。表明鐵自噬被阻斷后，缺血再灌注細胞中的氧化應激水平降低，鐵死亡也被顯著抑制，同時細胞內游離鐵水平下降，鐵超載得到緩解。在心臟和腎臟發(fā)生缺血再灌注的病理條件下，同樣觀察到抑制鐵自噬對IRI的顯著改善作用[22-23]。自噬廣譜抑制劑也可有效降低鐵自噬水平，但并未發(fā)現IRI明顯減輕，其原因可能為廣譜抑制劑同時抑制了線粒體自噬，而線粒體自噬通過及時清除受損線粒體對IRI具有保護作用，鐵自噬的損害性作用與線粒體自噬的保護性作用被同時抑制，從而表現為相互抵消的綜合結果[8，26]。目前，鐵自噬在IRI中的作用相關研究均為動物及細胞實驗，且對IRI的作用僅通過器官組織壞死體積、細胞生存情況及粗略的功能評分進行評估，對器官功能變化的檢測及預后分析等關注不夠，可能成為未來的研究方向。

在缺血再灌注發(fā)生后，鐵自噬水平上調可能存在與生理條件下不同的調節(jié)機制。再灌注后，介導NCOA4降解的E3泛素連接酶HERC2表達水平并未下降，表明再灌注后NCOA4蛋白水平增高的原因并非是降解減少，仍存在其他途徑[8]。鐵自噬水平上調的啟動時機尚不明確，但可以排除單純的缺氧，相反，缺氧條件下鐵自噬水平下調[27-28]。其原因可能為缺氧條件下鐵自噬的關鍵蛋白NCOA4轉錄水平下調，且NCOA4的信使RNA被miR-6862-5p持續(xù)降解進一步導致鐵自噬水平受抑制[27]。此外，缺氧還可能通過抑制核因子κB受體活化因子配體導致鐵自噬水平下調[28]。

3 鐵自噬在IRI中的作用機制

鐵自噬在帕金森病、尿路感染等中有重要作用，其作用機制均基于鐵自噬調控鐵代謝的作用[20]。目前鐵自噬參與IRI的機制尚未完全闡明，可能與鐵死亡、活性氧大量生成及鐵超載等有關，同時這三者之間也通過鐵代謝緊密聯系。

3.1鐵自噬與鐵死亡 在缺血再灌注期間，鐵死亡水平上調，具體表現為谷胱甘肽、胱氨酸谷氨酸逆向轉運蛋白溶質載體家族7成員11和谷胱甘肽過氧化物酶4表達降低，活性氧及氧化產物增多，線粒體皺縮，受累細胞存活率降低，受累組織壞死等[22，24]。有研究發(fā)現，高良姜素可通過激活胱氨酸谷氨酸逆向轉運蛋白溶質載體家族7成員11-谷胱甘肽過氧化物酶4軸使谷胱甘肽過氧化物酶4的表達增加，鐵螯合劑(如去鐵胺)則可減輕IRI[29-31]。

在多種不同細胞及病理生理背景下，鐵自噬水平上調均可促進鐵死亡的發(fā)生，在IRI發(fā)生過程中，鐵自噬對鐵死亡同樣存在調控關系[8，13，22-23]。腦缺血再灌注發(fā)生后，在泛素特異性肽酶14的去泛素化作用下，缺血再灌注的神經細胞中NCOA4表達上調，泛素特異性肽酶14抑制劑則可阻斷NCOA4介導的鐵自噬，此時鐵死亡水平下降，IRI減輕，可能成為臨床應用的有效靶點[8]。在腎IRI發(fā)生期間也觀察到了同樣的現象，Sui等[23]發(fā)現，再生人冷誘導RNA結合蛋白可與胚胎致死性異常視覺樣蛋白1相互作用，并激活鐵自噬從而促進鐵死亡，通過抑制鐵自噬可減輕腎IRI。在糖尿病心肌IRI期間，通過干擾小RNA進行NCOA4基因敲除，可以抑制鐵自噬和鐵死亡，從而減輕糖尿病心肌IRI；同時，通過抑制DNA甲基轉移酶1可以抑制鐵死亡并減輕糖尿病心肌IRI，NCOA4介導的鐵自噬也參與這一過程[24]。在心、腦、腎等多器官的IRI相關研究中，無論是離體還是在體實驗，鐵自噬在IRI期間發(fā)揮的作用均與鐵死亡密切聯系。

在IRI發(fā)生期間，鐵自噬促進鐵死亡的機制可能與鐵自噬釋放的鐵離子及其促進氧化應激導致活性氧大量生成有關。這與erastin和Ras選擇性致死化合物3等鐵死亡的常見激活劑發(fā)揮作用的核心機制不同，激活劑大多為阻礙活性氧的清除[31]。首先，鐵死亡的發(fā)生與鐵水平有關，過表達熱激蛋白β1基因或沉默轉鐵蛋白基因可降低鐵水平，從而抑制鐵死亡，而通過補充鐵可以加速鐵死亡[32]。當鐵自噬激活、NCOA4水平升高時，釋放鐵增加導致的鐵水平升高可以促進鐵死亡，這可能是鐵自噬促進鐵死亡的機制之一。此外，鐵死亡的發(fā)生與氧化應激密切相關，鐵死亡的特征即為脂質過氧化積累到致死水平。而鐵自噬通過釋放的鐵離子催化Fenton反應產生大量活性氧，促進鐵死亡的發(fā)生[33]。在其他應激條件下也觀察到相似的過程，Li等[13]發(fā)現，脂多糖作用下的心肌細胞中鐵自噬水平上調并釋放出大量Fe2+，此時細胞中線粒體膜上的絲氨酸轉運蛋白SFXN1(sideroflexin 1)的信使RNA和蛋白表達均升高，大量Fe2+與SFXN1結合并被轉運至線粒體，再通過Fenton反應產生大量活性氧，從而促進鐵死亡的發(fā)生；而當鐵自噬受到抑制時，SFXN1表達下調，鐵死亡受到抑制。同時，鐵離子作為脂氧合酶、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶等氧化酶必不可少的組成部分直接參與氧化應激過程，這也可能是鐵自噬促進鐵死亡的機制之一。在缺血再灌注后，鐵死亡水平上升，在缺氧條件下則受到抑制，這與鐵自噬水平的變化一致[34]。器官缺血時往往因攜氧血紅蛋白無法正常運輸氧氣，從而伴隨著組織細胞缺氧。在缺氧條件下，NCOA4表達降低，鐵自噬受抑制，線粒體鐵蛋白上調，而鐵蛋白重鏈和線粒體鐵蛋白可以保護細胞減少鐵死亡的發(fā)生[27]，這可能是在缺血再灌注期間鐵自噬調控鐵死亡的另一個原因。此外，還可能存在更復雜的機制，值得進一步探究。

有研究提出鐵自噬在IRI中的作用可能全部基于鐵死亡，但證據不足。Li等[8]對NCOA4敲除的腦缺血再灌注模型使用鐵死亡抑制劑，結果與未敲除NCOA4且未給予鐵死亡抑制劑的缺血再灌注模型組相比IRI顯著減輕，但與僅給予鐵死亡抑制劑未進行基因敲除的缺血再灌注模型組相比，腦梗死體積及神經功能評分改善不顯著；在細胞實驗中表現為給予鐵死亡抑制劑條件下，敲除NCOA4組與未進行基因敲除組缺血再灌注后神經元存活數量比較差異無統計學意義。但該研究僅從神經元存活數量、腦梗死體積和神經功能評分三個方面進行討論，并不代表細胞器和分子水平無變化，氧化應激水平及游離鐵等更能反映出微觀變化的指標，有待進一步分析。

3.2鐵自噬與活性氧生成 氧化應激產生大量活性氧是IRI的經典病理途徑，以往研究發(fā)現可能的機制包括線粒體內氧化還原反應產生活性氧增加，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶表達上調，白細胞呼吸爆發(fā)，血管內皮細胞黃嘌呤氧化酶形成增加，兒茶酚胺自氧化，體內清除活性氧的能力下降等[1,35]。

在IRI期間，鐵自噬也參與活性氧的產生。在糖氧剝奪復氧復糖神經元中，細胞中的還原性物質谷胱甘肽顯著減少，谷胱甘肽過氧化物酶活性降低，氧化應激產物丙二醛增加；NCOA4敲除后，谷胱甘肽含量增加，谷胱甘肽過氧化物酶活性升高，丙二醛水平降低[8]。鐵自噬的關鍵運載蛋白NCOA4可將儲存鐵的鐵蛋白轉運至溶酶體，并轉化為游離鐵[10]。在溶酶體中，由于眾多含鐵大分子(如鐵蛋白)、細胞器(如線粒體)降解，溶酶體內積聚大量鐵；且溶酶體內的酸性環(huán)境和還原環(huán)境導致鐵多以具有催化活性的Fe2+形式存在。溶酶體內的大量有催化活性的鐵可與線粒體中少量逸出的過氧化氫產生Fenton反應，而缺血再灌注可使線粒體生成大量超氧化物和過氧化物，從而放大了線粒體與溶酶體之間的串擾現象[35]。Fenton反應生成的羥自由基又繼續(xù)攻擊溶酶體膜，破壞溶酶體膜的完整性，這導致多種水解酶和更多具有催化活性的Fe2+被釋放到細胞質，進一步產生大量活性氧損害細胞[36]。同時，Qin等[7]研究發(fā)現，源自線粒體的活性氧可能通過激活AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和unc-51樣自噬激活激酶1軸而觸發(fā)鐵自噬，導致胞內游離鐵及活性氧的進一步增加。一些鐵螯合劑發(fā)揮的顯著抗腫瘤作用與溶酶體中鐵蛋白的降解有關，其中一種可動員鐵蛋白內鐵、促進鐵自噬的新型鐵螯合劑二-2-吡啶基酮二硫代氨基甲酸酯發(fā)揮的抑制癌細胞增殖作用，也被證明與促進癌細胞內鐵自噬介導的溶酶體內活性氧生成有關[37]。有研究認為，鐵死亡啟動所需的活性氧也源于鐵自噬產生的活性氧[33]。

鐵自噬不僅參與并加劇活性氧的產生，且可能將活性氧的產物向毒性更強的方向轉化，導致并加重缺血再灌注過程中氧化應激損傷?；钚匝醢ㄗ杂苫?、單線態(tài)氧、過氧化氫、一氧化氮以及脂性過氧化物等，其中自由基包括氧自由基、脂質自由基、氯自由基以及甲基自由基等，氧自由基包括超氧陰離子和羥自由基等。一般來說，線粒體中的活性氧主要是超氧化物和過氧化物[38]，而羥自由基主要是由于溶酶體或不穩(wěn)定鐵池中發(fā)生Fenton反應所致[33]。人體內正常或非正常代謝產生的超氧陰離子和超氧陰離子在酶促作用下生成的過氧化氫對組織細胞的損傷作用均較小。但超氧陰離子和過氧化氫通過Fenton型Haber-Weiss反應，在Fe2+的催化下可以轉化為毒性更強、更活躍的羥自由基[33,38]。羥自由基可以使膜脂質過氧化，蛋白質骨架斷裂，DNA發(fā)生堿基修飾、斷裂和交聯以及破壞細胞間質等，從而損害組織和細胞的正常功能[39]。

3.3鐵自噬與鐵超載 正常生理狀態(tài)下，鐵自噬可以維持組織細胞的鐵代謝平衡，然而在缺血再灌注等應激因素作用下，鐵自噬過度激活，導致細胞內鐵超載[13]。在腦缺血再灌注后6 h以及缺氧缺糖復氧復糖的神經元細胞中均檢測到游離鐵顯著增加，敲除NCOA4則未發(fā)現游離鐵水平升高[8]。在心肌IRI期間，同樣觀察到大量鐵積聚，但在NCOA4基因沉默組中，鐵自噬關鍵蛋白缺失可導致鐵自噬受到抑制，游離鐵水平降低[24]。在IRI期間，除鐵自噬過程本身因降解鐵蛋白會增加胞內游離鐵引發(fā)鐵超載外，活性氧大量產生與鐵死亡的發(fā)生也可能導致鐵超載[3]。

鐵超載與2型糖尿病、高血壓、心肌肥大、骨質疏松、非酒精性脂肪性肝病等代謝性疾病相關，且在不同器官組織中鐵超載表現出的損傷不同。一項研究建立了2例神經鐵蛋白病患者成纖維細胞誘導的多能干細胞系，并利用成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列/Cas9系統建立了同基因對照，結果發(fā)現神經鐵蛋白病組成纖維細胞、神經前體細胞和神經元的胞質鐵含量增加，出現衰老表型，神經元的衰老尤為突出[40]。同時，鐵超載可提高神經元自噬水平，其機制可能為鐵超載激活自噬相關的AMPK通路，但不限于此。在通過連續(xù)28 d腹腔注射右旋糖酐鐵構建的鐵超載大鼠模型中，大鼠海馬神經元內鐵水平、轉鐵蛋白受體1表達及自噬小體數量明顯增加，內質網腫脹明顯，調控中樞神經系統自噬水平的關鍵因子AMPK活化，微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ、B細胞淋巴瘤/白血病-2相互作用蛋白1的表達明顯增加，大鼠認知功能障礙明顯[41]。有研究顯示，通過小檗堿激活AMPK通路可抑制腎缺血再灌注小鼠的腎組織發(fā)生鐵死亡，進而減輕腎纖維化[42]，這為干預鐵死亡及鐵自噬引發(fā)的鐵超載提供了可能的干預靶點。在心肌中，氧化應激及鐵超載是心肌肥大的重要因素，而鐵自噬可介導這一過程，在心肌缺血再灌注后鐵超載則可能導致線粒體結構異常以及功能障礙，從而導致損傷[43]。與IRI一致，鐵超載也可發(fā)生在全身多個重要的器官組織，預防或減少鐵的過度沉積可能是減輕IRI的重要措施。

以往雖然有較多基礎研究應用鐵螯合劑來減輕鐵超載并取得肯定效果，但應用鐵螯合劑調節(jié)鐵代謝以減輕IRI的臨床研究效果有限[2,4]，且研究本身存在諸多轉化應用的限制，包括鐵螯合劑本身的細胞毒性、鐵受影響器官的螯合效率差異、使用鐵螯合劑的具體時間、患者之間的異質性以及其他嚴重的脫靶副作用等[1-2]。這表明從臨床應用轉化角度考慮，鐵本身可能不是用于調控鐵代謝以減輕IRI的最佳靶點。

4 結 語

目前預防或減輕缺血再灌注導致的細胞及器官功能損傷仍是醫(yī)學面臨的難題。近年來，鐵自噬作為一種新型的特殊類型自噬成為研究熱點，鐵自噬在IRI中的作用機制等逐漸受到關注，且仍值得進一步研究。鐵自噬與鐵死亡作為調控鐵代謝的兩個重要途徑，具有諸多相似點與聯系，鐵死亡在多種疾病中的作用均與鐵自噬有關，但兩者間的調控關系及具體機制尚未完全明確。此外，鐵自噬上游通路未完全闡明，目前尚未發(fā)現臨床適用的抑制鐵自噬通路的治療措施。深入研究鐵自噬，有望為IRI相關疾病提供新的臨床治療靶點。