周康杰 胡 楠 張競舟 洪義東 卞保祥 宋子琰 吳風(fēng)雷

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)即腫瘤細胞產(chǎn)生和生活的內(nèi)環(huán)境，包括腫瘤細胞及其周圍的成纖維細胞、免疫細胞、炎性細胞、膠質(zhì)細胞、細胞間質(zhì)、微血管等，其具備缺氧、慢性炎癥及免疫抑制的3項特征，形成十分復(fù)雜的機制網(wǎng)絡(luò),對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生重要作用[1]。微環(huán)境中的局部信號分子如IL-4、IL-6、IL-10、前列腺素E2(PGE2)、巨噬細胞集落刺激因子和TGF-β, 參與慢性炎癥及Th2細胞的形成,促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；另TGF-β通過多個過程促進腫瘤進展，包括維持腫瘤干細胞穩(wěn)態(tài)、抑制免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)EMT和轉(zhuǎn)移等[2]。此外，TGF-β還同時具有腫瘤抑制因子和腫瘤啟動子的活性，并且能夠調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達[3]。

免疫檢查點是維持自身耐受性和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)信號通路的關(guān)鍵因子[包括程序性死亡受體1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡受體配體1、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)等免疫檢查點]，主要通過影響T淋巴細胞免疫應(yīng)答發(fā)揮作用。生理情況下，免疫檢查點能夠保護正常組織免受自身免疫和炎癥的傷害。而在腫瘤狀態(tài)下，T淋巴細胞的激活受到抑制，免疫檢查點無法正常發(fā)揮功能，從而引發(fā)腫瘤的免疫逃逸。ICB治療是通過有效阻斷PD-L1/PD-1、CTLA-4等免疫檢查點，間接強化抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高免疫治療效果，其中針對免疫檢查點PD-1/PD-L1已成為繼手術(shù)、化療、放療、靶向藥物等常見治療手段之外最新的腫瘤治療方法之一。2021年中國臨床腫瘤學(xué)會 (Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)發(fā)布的胃癌指南中，免疫治療首次進入中國胃癌的一線用藥推薦。

盡管目前ICB治療在胃癌治療領(lǐng)域中前景良好，但仍存在免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors, ICIs)阻斷效果與療效不匹配等局限性。有研究表明，在腫瘤免疫微環(huán)境中，以腫瘤為中心，將其分為3種表型，分別為免疫沙漠表型、免疫炎癥表型及免疫豁免表型[4]。免疫沙漠表型：腫瘤實質(zhì)和基質(zhì)內(nèi)都沒有有效的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)；免疫炎癥表型：腫瘤細胞實質(zhì)、基質(zhì)、周圍環(huán)境均有大量的CTLs浸潤；免疫豁免表型：TME有大量CTLs細胞存在，但不能滲透到腫瘤實質(zhì)內(nèi)，而是被限制在腫瘤細胞的外圍基質(zhì)。此表型經(jīng)ICIs治療后，外圍基質(zhì) CTLs 細胞有增殖和活化，但未浸潤至腫瘤實質(zhì)，抗腫瘤效果差。這也可能是某些腫瘤突變負荷高，免疫原性好，但治療效果卻不盡如人意的原因[4]。

有研究表明，高表達TGF-β的惡性腫瘤多為免疫豁免表型，當(dāng)阻斷TGF-β信號通路后，CTLs 細胞在腫瘤實質(zhì)內(nèi)的浸潤明顯增多，TME轉(zhuǎn)化為免疫炎癥表型，明顯增強了免疫檢查點抑制劑 PD-L1 單抗(阿特珠單抗)的抗腫瘤療效[5]。還有研究報道，在晚期消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，TGF-β的表達與腫瘤實質(zhì)中CTLs細胞浸潤呈負相關(guān)[6]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷 TGF-β信號通路可以削減TME中CTLs細胞向免疫抑制性T細胞的轉(zhuǎn)化[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在TME的腫瘤細胞、免疫細胞及成纖維細胞中TGF-β與PD-L1表達都具有正相關(guān)性[8～12]。這些通路機制的研究為胃癌的免疫治療提供新的靶點，有助于提高ICB治療的療效。

一、TGF-β在TME中的作用

轉(zhuǎn)化生長因子超家族由60多個不同的成員組成，包括TGF-β、激活素、抑制素、骨形態(tài)形成蛋白、生長分化因子等，并且已被確認在各種細胞環(huán)境中促進TGF-β信號表達。在哺乳動物中TGF-β信號有3種高度相似的異構(gòu)體，分別是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，這些異構(gòu)體共享約80%的相同氨基酸序列。TGF-β信號通路具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細胞生長、分化、凋亡、運動、侵襲、細胞外基質(zhì)生成、血管生成和免疫應(yīng)答等。TGF-β在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有兩種不同的作用，即TGF-β具有腫瘤抑制因子或腫瘤啟動子活性，從而調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達[3]。

在早期腫瘤中，TGF-β通過促進細胞周期阻滯和凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，而在晚期腫瘤中TGF-β則通過促進免疫抑制、促進腫瘤血管生成、誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等機制調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[13]。腫瘤過度產(chǎn)生的TGF-β創(chuàng)造了一種免疫抑制環(huán)境，這種環(huán)境對于在腫瘤進展期促進腫瘤細胞的生存和生長至關(guān)重要[14]。

TGF-β能夠刺激成纖維細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細胞，促進腫瘤細胞的免疫逃逸，并且腫瘤相關(guān)成纖維細胞可以分泌多種因子促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，如成纖維細胞生長因子、基質(zhì)細胞衍生因子1，基質(zhì)金屬蛋白酶和胰島素樣生長因子1等[15]。TGF-β信號通路和腫瘤血管形成密切相關(guān)，TGF-β/血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相關(guān)信號通路是腫瘤血管形成的重要通路。同時TGF-β能夠顯著增加VEGF/VEGF-R的表達，促進內(nèi)皮細胞的毛細血管形成和遷移，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的血管生成，從而促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF-β可通過下調(diào)E-鈣黏蛋白、上調(diào)波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生EMT，進一步促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[16]。TGF-β通過抑制抗原遞呈細胞[如樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)]的遷移和誘導(dǎo)凋亡來逃避免疫監(jiān)視。腫瘤來源的TGF-β可顯著抑制DCs激活的CD4+T細胞的增殖。TME中的TGF-β使腫瘤相關(guān)巨噬細胞從腫瘤前(M2)表型極化到抗腫瘤(M1)表型。

目前在未治療的腫瘤樣本組織病理切片中，有研究將同PD-L1/PD-1治療響應(yīng)相關(guān)的免疫表型分為3種類型，如免疫炎癥表型、免疫沙漠表型及免疫豁免表型[4]。免疫炎癥表型：腫瘤實質(zhì)中存在有大量CD4+和CD8+的淋巴細胞，也伴隨有髓系細胞和單核細胞。在腫瘤浸潤淋巴細胞及腫瘤細胞中可能表達 PD-L1。這一表型反映出在TME中被抑制的抗腫瘤活性。對PD-L1/PD-1通路的阻斷治療最有可能在這一表型中有效。免疫豁免表型：免疫細胞未能浸潤入腫瘤實質(zhì)，而被限制在基質(zhì)及腫瘤周邊為特征。這一表型通常對 PD-L1/PD-1抑制劑無效。免疫沙漠表型：T淋巴細胞在腫瘤實質(zhì)以及周邊基質(zhì)的缺失為特征。這一表型大多對 PD-L1/PD-1抑制劑無效。而高表達TGF-β的腫瘤多為免疫豁免表型，阻斷TGF-β信號通路后可將免疫豁免表型轉(zhuǎn)化為免疫炎癥表型，促進腫瘤中CTLs細胞的浸潤，從而抑制腫瘤進展[5]。

二、TGF-β與TME中免疫檢查點PD-L1的關(guān)系

1.TGF-β調(diào)控DCs中PD-L1的表達:TGF-β能上調(diào)抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells，APC)上PD-L1的表達,而APC表面表達的PD-L1又釋放抑制性可溶性分子到TME中,通過PD-L1與其受體的相互作用直接抑制CTLs,或者誘導(dǎo)CTLs釋放抑制性可溶性分子[11]。即TGF-β上調(diào)DCs的PD-L1表達，導(dǎo)致T淋巴細胞失能、降低抗腫瘤反應(yīng)從而產(chǎn)生免疫抑制反應(yīng)。

PD-L1是DC上表達的關(guān)鍵共抑制分子能夠參與免疫耐受的誘導(dǎo)和維持。DC上表達的PD-L1和T淋巴細胞上表達的PD-1相互作用可以抑制T淋巴細胞的免疫活性[17]。PD-L1的表達與調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)的發(fā)育和功能有關(guān)[18]，與T淋巴細胞共培養(yǎng)TGF-β-DC 48h，結(jié)果顯示TGF-β-DC明顯誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡和CD4+CD25+Foxp3+Treg的產(chǎn)生。進行相關(guān)分析表明，TGF-β-DC可以誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡和DC中PD-L1的表達。TGF-β可增加DCs中PD-L1及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)的表達，并表現(xiàn)出時間和劑量依賴性，而阻斷STAT3后PD-L1的表達明顯下降。與TGF-β共培養(yǎng)的DC可誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡，增加CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率。即TGF-β可以通過STAT3信號上調(diào)DC中PD-L1的表達，進而抑制T淋巴細胞免疫，抗腫瘤作用減弱。

2.TGF-β調(diào)控腫瘤細胞中PD-L1的表達：在乳腺癌細胞外泌體中，PD-L1與TGF-β表達呈顯著的正相關(guān)。在體外，TGF-β誘導(dǎo)外泌體中PD-L1的表達，而阻斷TGF-β后外泌體中PD-L1的水平下降。外泌體中PD-L1通過誘導(dǎo)CD8+T細胞的功能障礙增強了免疫抑制作用。單一阻斷TGF-β可減少腫瘤細胞中外泌體中PD-L1釋放，而同時阻斷TGF-β和外泌體中PD-L1可增強腫瘤特異性T細胞的靶向殺傷作用[10]。有研究表明，在肺癌細胞中，TGF-β能夠顯著上調(diào)PD-L1的表達[9]。同時在研究樂伐替尼與瑞格菲尼對肝癌細胞PD-L1的作用及機制中發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染siRNA干擾肝癌Hep3B和SMMC7721 細胞中TGF-β1的表達，發(fā)現(xiàn)干擾組的PD-L1蛋白表達量較對照組下降，即抑制TGF-β1的表達可以下調(diào)PD-L1的表達。TGF-β1與PD-L1之間存在相關(guān)機制和功能聯(lián)系[8]。另有研究在腫瘤患者血液樣品中發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者基線可溶性TGF-β與可溶性PD-L1呈顯著正相關(guān)；治療后可溶性TGF-β的變化與治療后可溶性PD-L1值的變化與基線值比較也存在顯著正相關(guān)[19]；這些研究發(fā)現(xiàn)證明了TGF-β與PD-L1的表達呈顯著的正相關(guān)性，即TGF-β與PD-L1之間確實存在相關(guān)機制通路。

而在順鉑耐藥的肺癌細胞中，脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)-TGF-β通路能夠調(diào)節(jié)PD-L1的表達，阻斷TGF-β信號通路，可抑制PD-L1的表達。TGF-β抑制劑與PD-L1抗體聯(lián)合治療能夠進一步增強NK細胞對順鉑耐藥細胞的殺傷作用[20]。在腫瘤細胞中，EMT/β-catenin/多元醇二磷酸寡糖蛋白轉(zhuǎn)移酶(dolichyl-diphosphooligosaccharideprotein glycosyltransferase subunit，STT3)/PD-L1通路可以調(diào)節(jié)PD-L1的表達，TGF-β可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子β-catenin 表達，調(diào)節(jié)EMT/β-catenin/STT3/PD-L1通路，從而促進PD-L1糖基化增強[21]。另在研究PD-L1在胃癌EMT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程受NF-κB的調(diào)控中發(fā)現(xiàn)，在體外胃癌細胞中，使用TGF-β1受體抑制劑，能夠降低了PD-L1的表達[22]。在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，非腫瘤細胞(成纖維細胞)可以通過具體的機制通路調(diào)控PD-L1的表達，即TGF-β可以通過Smad2/3或non-Smad2/3(PI3K-AKT-MTOR)信號通路上調(diào)TME中PD-L1表達[12]。這些結(jié)論表明，在腫瘤細胞中TGF-β能夠通過相關(guān)機制通路調(diào)控PD-L1的表達。

三、阻斷TME中TGF-β在ICB治療中的作用

傳統(tǒng)免疫治療主要通過強化抗腫瘤免疫反應(yīng)進行治療，但由于免疫檢查點的存在，難以造成持久有效的抗腫瘤免疫作用。而ICB治療則通過有效阻斷PD-L1/PD-1、CTLA-4等免疫檢查點，間接強化抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高免疫治療效果。但是ICIs在未經(jīng)選擇的實體瘤患者中，有效率只有10%～30%[23]。其中一個可能的原因是ICIs只攻擊由腫瘤及其TME組成的復(fù)雜系統(tǒng)的一個方面。除了PD-1/PD-L1軸和CTLA-4配體相互作用外,TME中還有許多其他的免疫抑制實體，如Tregs、骨髓衍生抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和細胞因子(IL-8和TGF-β)等,這可能導(dǎo)致次優(yōu)的抗腫瘤免疫反應(yīng)[24]。腫瘤中TGF-β的過度分泌與腫瘤免疫因子增加、TIL殺傷腫瘤作用減弱、免疫效應(yīng)細胞浸潤受限密切相關(guān)[25]。TGF-β可能是腫瘤治療中的一個靶點，TGF-β/免疫檢查點的雙重阻斷具有協(xié)同作用。在TME中，腫瘤細胞往往通過多種免疫抑制途徑逃避免疫監(jiān)視。TGF-β能夠改變抗腫瘤免疫反應(yīng)的多個過程，包括抗原遞呈、T淋巴細胞浸潤和腫瘤殺傷活性。因此，ICI單藥治療可能無法恢復(fù)強大的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

研究表明，在小鼠體內(nèi)建立人類微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌模型，發(fā)現(xiàn)ICI單藥治療不能有效清除腫瘤細胞。然而，聯(lián)合TGF-β阻斷治療明顯增強了ICI的抗癌作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以通過促進免疫豁免表型的形成而誘導(dǎo)免疫抑制，而這些免疫豁免表型容易對ICI治療產(chǎn)生抗藥性[6]。這在轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者中也有類似的現(xiàn)象。對于接受阿替利珠單抗治療的轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者(特別是在腫瘤周圍基質(zhì)中富集大量CD8+T細胞的患者)，治療效果與TGF-β的表達高度相關(guān)[25]。研究人員用EMT6小鼠乳腺和MC38小鼠結(jié)腸癌模型重建了免疫豁免表型，單一阿替利珠單抗和TGF-β阻斷劑均不能減輕腫瘤負荷，但阿替利珠單抗和TGF-β阻斷劑聯(lián)合治療均能有效地根除腫瘤細胞。進一步的研究表明，雙阻斷的協(xié)同作用與增強T淋巴細胞浸潤到腫瘤中心和抗腫瘤免疫應(yīng)答有關(guān)[25]。阻斷TGF-β可增強抗PD-1抗體對小鼠模型的治療作用[26]。同樣，通過誘導(dǎo)腫瘤CD8+T細胞中PD-1的上調(diào)，發(fā)現(xiàn)MDSCs分泌的TGF-β與PD-1/PD-L1抑制劑耐藥高度相關(guān)[27]。在順鉑耐藥的肺癌細胞中，TGF-β抑制劑與PD-L1抗體聯(lián)合治療能夠進一步增強NK細胞對順鉑耐藥的肺癌細胞的殺傷作用[20]。雙PD-1/PD-L1和TGF-β信號通路阻斷在體外/體內(nèi)中協(xié)同恢復(fù)了抗原特異性CD8+T細胞的功能和抗腫瘤能力。

那么就有可能將PD-L1/PD-1抑制劑和TGF-β抑制劑結(jié)合，提高抗腫瘤免疫治療的活性。例如，M7824能夠有效地、具體地同時綁定 PD-L1和TGF-β。在合成小鼠模型中，M7824比單獨使用抗PD-L1抗體或抗TGF-β治療更有效地抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移TGF-β受體抑制劑可以增強抗PD-L1單克隆抗體的抗腫瘤作用。聯(lián)合抑制TGF-β和PD-L1治療組的存活率明顯高于抗PD-L1單克隆抗體組。阻斷TGF-β受體活性增強了抗PD-L1單克隆抗體治療的抗腫瘤免疫能力，提高了免疫原性和MC38腫瘤模型的整體長期生存，M7824提高了腫瘤浸潤性淋巴細胞的數(shù)量和免疫能力[28]。同樣的，靶向CTLA-4和TGFβR-Ⅱ的雙功能融合蛋白可抑制Tregs和Th17細胞的分化，并增加腫瘤特異性IFN-γ+效應(yīng)細胞和記憶細胞的功能?？笴TLA-4-TGFβR-Ⅱ融合蛋白的抗癌作用優(yōu)于CTLA-4或PD-1抑制劑[7]。

四、展 望

在TME中，TGF-β通過促進纖維化、促進腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)EMT、誘導(dǎo)免疫抑制以及與免疫表型之間的關(guān)系等機制促進腫瘤進展。TGF-β在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，使其成為早期診斷腫瘤、預(yù)測腫瘤進展的標志物。由于TGF-β通過多種機制調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，TGF-β信號已被證明與靶向和常規(guī)腫瘤藥物以及免疫治療的耐藥性有關(guān)，所以其成為抑制腫瘤進展的重要靶點，可以通過多種方式阻斷TGF-β信號通路，從而抑制腫瘤進展。TGF-β改變了抗腫瘤免疫反應(yīng)的多個過程，包括抗原遞呈、T淋巴細胞浸潤和腫瘤殺傷活性。

2020年ESMO上公布的Checkmate-649研究結(jié)果表明，在納武利尤單抗聯(lián)合化療組中，晚期胃癌患者中PD-L1綜合陽性評分(combined positive score, CPS)≥5和CPS≥1的患者總生存期(overall survival，OS)都達主要研究終點，CPS≥5比CPS≥1的患者OS獲益更明顯，臨床數(shù)據(jù)更具有優(yōu)勢[29]。因此，PD-L1的高表達可能是影響ICB治療重要的因素。盡管目前ICB治療在胃癌治療領(lǐng)域中前景良好，但仍存在ICIs效果與療效不匹配等局限性，即PD-1抑制劑阻斷效果與療效不匹配，這是由于PD-1抑制劑雖然有效地阻斷了配體激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但它無法抑制T淋巴細胞內(nèi)PD-L1自身持續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。只要PD-L1蛋白存在時，即對T淋巴細胞產(chǎn)生抑制作用[30]。在腫瘤中，既要阻斷胞外PD-1和PD-L1結(jié)合，又要阻斷胞內(nèi)PD-L1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而恢復(fù)T淋巴細胞正常功能活性，持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤活性。能否找到相關(guān)通路阻斷胞內(nèi)PD-L1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，成為提高免疫治療療效的關(guān)鍵。

高表達TGF-β的惡性腫瘤多為免疫豁免表型，阻斷TGF-β信號通路后，CTLs 細胞在腫瘤實質(zhì)內(nèi)的浸潤明顯增多，TME轉(zhuǎn)化為免疫炎癥表型，明顯增強了ICIs(PD-L1)的療效。表明在TME 中TGF-β抑制了 CTLs 細胞向Tregs細胞的轉(zhuǎn)化以及CTLs向腫瘤實質(zhì)的浸潤[5]。同時在DCs、腫瘤細胞和成纖維細胞等研究中，已經(jīng)證明了TGF-β與PD-L1的調(diào)節(jié)關(guān)系。因此找到TME中TGF-β調(diào)控PD-L1表達的相關(guān)機制通路，并阻斷其通路表達，可以提高ICB治療的療效。TGF-β信號的高表達與PD-1/PD-L1信號軸的升高破壞了抗腫瘤免疫反應(yīng)。靶向TGF-β將為提高傳統(tǒng)癌癥治療的療效提供一個新的方法，并且首選靶向TGF-β與免疫治療相結(jié)合來增強患者的反應(yīng)。因此，如果在TME中找到TGF-β調(diào)節(jié)PD-L1變化的具體機制通路，那么選擇更佳的治療方案，如聯(lián)合轉(zhuǎn)化TME免疫表型的抗TGF-β藥物，提高腫瘤患者的免疫治療效果，為腫瘤免疫治療帶來新的方向。