宋雪艷，劉志歡，謝翠萍，劉營營，楊永亞，劉建華

(河南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南鄭州 450002)

細菌生物被膜(biofilm，BF)是細菌黏附在惰性或活性物體表面自行繁殖，并包圍在多糖基質、纖維蛋白、脂質等分泌物中，形成具有特殊復雜結構的高度組織化、系統(tǒng)化的膜樣聚合物[1]。BF是細菌在紫外線輻射、極端溫度或pH、高鹽、高壓、營養(yǎng)不良、抗生素作用等狀態(tài)下，形成的自我保護機制[2]。90%以上的微生物可以形成BF，BF可出現(xiàn)于自然、人工及宿主體內等任何生態(tài)系統(tǒng)中。在BF的保護下，細菌耐藥性、抗吞噬性、致病性及黏附性等均有所提高，導致感染性疾病反復發(fā)作，遷延不愈，因此掌握其形成的調控機制，尋找快速有效的清除方法非常必要。本文概括了BF的形成過程及影響因素、結構特性和調控機制，并對目前常用的BF消除方法進行綜述。

1 生物被膜形成過程及影響因素

BF的形成是一種動態(tài)過程，與胞外多糖的產生、細胞遷移、亞群分化和相互作用密切相關，有黏附、聚集、成熟、脫落四個步驟[3]。首先細菌黏附在物體表面，形成單菌落，并被自身分泌物不斷包裹形成微菌落。細菌在非生物表面的黏附主要通過氫鍵、范德華力、疏水作用力等相互作用；而在組織表面的黏附則主要通過黏附素等分子間的結合作用。細菌在黏附過程中是可逆的，此時BF尚不成熟，對抗生素的抵抗力不強，應用抗生素治療會取得很好的效果[4]。多糖黏附素是在由ica操縱子功能基因編碼的酶催化合成，在不可逆的微菌落聚集過程中發(fā)揮主要作用[5-6]。隨后，多個微菌落融合并向上生長，并不斷聚集，形成成熟的BF，其結構類似蘑菇狀。BF成熟后期，隨著酚溶性調節(jié)肽等物質的作用[7]，部分細菌從BF上脫落下來，進入下一個循環(huán)過程。細菌BF成熟后，由于胞外聚合物的屏障作用，膜內菌株的新陳代謝速率會降低，進而形成休眠體，此時菌株相關耐藥基因被激活，產生胞外酶[8]，導致了生物被膜菌的耐藥。BF形成過程中，細菌的鞭毛、菌毛及其分泌物也有很重要的作用[9]。有研究表明鞭毛介導的泳動及Ⅳ型菌毛介導的蹭動對早期細菌BF的形成意義重大[4,10]。

2 生物被膜結構特性

在自然條件下，幾乎所有的細菌都能以BF的形式存在，BF具有獨特的宏觀及微觀結構、不均一性、流體黏滯性和固體彈性等綜合性質[11]，可調節(jié)其自身結構以適應內部和外部變化，使細菌有很強的耐藥性和免疫逃避能力。研究表明，BF由內至外分為基質層、條件層、連接層、生物被膜層。成熟的細菌BF的微菌落間分布有水通道，主要用于運輸營養(yǎng)物質和廢物。細菌BF的緊密程度、厚薄度及其形態(tài)因細菌種類、生長環(huán)境、附著表面、營養(yǎng)情況的不同而不同[12]。不同的細菌物種在相同的條件下會形成不同的BF，相同的細菌物種在不同的條件下也會形成不同的BF。如細菌根據環(huán)境的不同形成固體或液體等形式的BF[13]，表達不同的耐藥基因導致細菌耐藥。BF的形成能力與溫度和接觸材料有一定的關系[14]，25℃相較于37℃、15℃等其他溫度，玻璃相較于聚苯乙烯、不銹鋼等其他材料，都更有利于形成BF。細菌在BF中占比很少，水分含量可高達97%，其余大多是胞外多糖、核酸、磷脂等成分。連接細菌的細胞外基質組分之間的差異及營養(yǎng)物質多少的變化等都會導致不同結構的微菌落或被膜結構。浮游態(tài)和BF狀態(tài)是細菌的兩種不同的生命模式。位于BF不同位置的細菌在體積大小和代謝活性等方面均存在顯著差異。BF淺層細菌之間養(yǎng)料、氧氣、酶等都很充分，代謝活躍；而BF深層的細菌不易獲得養(yǎng)料和氧氣等物質，代謝緩慢，細胞分裂很少，體積較小，大多處于休眠狀態(tài)，對抗菌藥物不敏感。位于BF深層的細菌抵抗抗生素的能力是浮游細菌的1 000倍[4]。

3 生物被膜形成的調控機制

細菌生長過程中，會分泌一些物質，而這些物質可以作為生物信號分子，并通過一些信號調控途徑在細胞內或細胞間傳遞信息，使細菌在多細胞水平上協(xié)調統(tǒng)一相互配合，以完成一些重要的生理學功能，其中包括BF的形成。這些信號調控途徑主要有群體感應系統(tǒng)、環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)和多糖調控系統(tǒng)等。

群體感應系統(tǒng)是細菌產生和檢測信號分子的過程，并以細胞密度依賴的方式來協(xié)調它們的行為，可調控BF的形成。其信號傳遞分子即自誘導因子，能感知周圍同類細菌的密度，并根據細菌密度的增加而增加。當增加到一個臨界濃度時，群體感應系統(tǒng)信號調控胞外多糖、黏附素、表面活性劑等物質的產生，從而影響B(tài)F的形成[15-16]。

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)在調控細菌BF形成過程中具有重要作用。BF的形成與環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)的濃度有關，當環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)濃度低時，細菌的一些運動基因表達增加，不易形成BF；當環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)濃度高時，細胞黏附因子的產生會增多，胞外基質分泌也會增加，使細菌更易黏附在細胞或生物材料表面，有利于BF的形成[17]。

多糖是維持BF結構的主要成分，有利于細菌與物體表面的黏附。因而多糖調控系統(tǒng)對細菌BF的形成扮演著舉足輕重的角色。如銅綠假單胞菌，其胞外多糖Psl、Pel是Ⅳ型菌毛非依賴性小菌落所必需的，對銅綠假單胞菌BF形成后期的亞群相互作用和大菌落形成必不可少[18-19]。

4 生物被膜清除方法

BF的控制和清除可以從抑制細菌的初始黏附和破壞成熟的BF結構入手，方法主要有物理清除方法、生物化學清除方法、中藥清除方法等。

4.1 物理清除方法

控制BF的物理方法有超聲波、低電流、紫外燈照射、噴射清洗、高溫清洗等。研究顯示低頻超聲單獨作用時不能影響B(tài)F，但與抗生素聯(lián)用后，能破壞BF結構，使活菌數(shù)量顯著降低[20]；電流可以影響細菌BF結構中菌體的數(shù)量，且能增強抗生素的殺菌效果。細菌黏附初期是可逆的，所以此時用紫外燈照射、清洗、加熱等物理方法，就能夠有效清除BF。因此，在生物被膜形成的適宜階段進行物理清除可取得一定的效果。

4.2 生物化學清除方法

研究表明，金屬螯合劑、抗菌藥物、抗菌多肽、表面活性劑、過氧化氫、酒精等都可以破壞BF的形成。EDTA是最常見的金屬螯合劑，能降低混合細菌的黏附度，抑制BF的形成[21]。當使用單一抗菌藥物時，一些細菌會產生各自的耐藥機制，進而對該抗菌藥物耐藥，并形成BF。而當兩種或兩種以上抗菌藥物聯(lián)用時，能夠破壞BF，使BF狀態(tài)的菌株更容易被殺死。抗菌多肽的分子小、作用機制獨特、不易產生耐藥性且生物功能廣泛，能夠降低BF相關基因的表達，阻止細胞外化合物的產生，抑制細菌BF的形成[22]。細菌所要黏附表面的形貌、電荷、官能團類型、粗糙度等都會影響B(tài)F的形成。可通過使用防黏性涂層或含藥物涂層、具有抗生物被膜和抗菌性能的固有生物活性材料等去抑制BF的形成。

最新研究發(fā)現(xiàn)，酶制劑、噬菌體等可用于抑制BF的形成。如酶制劑能靶向作用于BF胞外基質，降解BF中群體感應系統(tǒng)信號分子，阻斷細胞間的交流，從根本上清除BF[23]。噬菌體能夠感染細菌、真菌、放線菌等微生物，編碼胞外多糖解聚酶和裂解酶去破壞BF基質，且自身可以進入BF內部裂解細菌，抑制BF的形成以及破壞已形成的BF[24-25]。所以可根據條件的不同，選擇合適的生物化學方法對生物被膜進行清除。

4.3 中藥清除方法

中藥單一成分或其混合提取物，如黃芩苷、銀杏酚酸、魚腥草素鈉、苦參堿、桑螵蛸的脂質提取物、大黃提取物等都有利于BF的清除。研究表明黃芩苷能夠改變細菌基因和蛋白質表達[26]，抑制BF形成。黃芩苷單體可以抑制泛耐藥鮑曼不動桿菌BF的形成，當其與美羅培南、亞胺培南等抗生素聯(lián)用后，效果更好[27]。桑螵蛸的脂質提取物可以減少細菌黏附、破壞生物被膜結構、裂解細菌[28]。此外，對生物被膜有抑制或清除作用的中藥還有很多。尋找合適的中藥及其提取物對生物被膜進行清除有很重要的研究意義。

5 展望

當在極端環(huán)境或抗生素作用下，細菌即通過群體感應、環(huán)二鳥苷酸等系統(tǒng)的調控，進行黏附聚集等過程，形成成熟BF以進行自我保護，導致耐藥性明顯增強，且不易被清除，給養(yǎng)殖業(yè)、食品行業(yè)及人類健康造成威脅。目前對于調控細菌BF形成的機制、如何清除BF等方面尚需深入研究。為了更好地控制BF造成的感染，可以把研究深入到分子水平，尋找更多能夠作用BF的抑制劑，并對抑制機制進行深入研究。聯(lián)合使用物理、生物化學、中藥等各種方法，從而徹底治療細菌BF感染性疾病，以及防止BF對食品加工行業(yè)造成污染事件的發(fā)生。