楊海鶯，趙 凱，楊書林，高嘉星，牛興和，李 慧?

（1. 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，北京 102209；2. 中糧糧谷控股有限公司，北京 100020）

酵母菌在發(fā)酵谷物制品中扮演重要角色，影響制品的質(zhì)構(gòu)、香氣等。具體作用如下：①提供各種酶系，如蛋白酶、蔗糖酶、淀粉酶、脂肪酶等[1]，分解谷物中的麥芽糖、蛋白、糊精等，提升面團的加工性能。②分解單糖、雙糖、三糖[2]，產(chǎn)生CO2，影響谷物制品的外觀質(zhì)構(gòu)指標(biāo)，包括高徑比、比容、色度、切面氣孔、硬度、彈性等。③產(chǎn)生酯類、醇類等多種芳香物質(zhì)，賦予制品獨特香氣[3]。④營養(yǎng)方面，酵母菌提供氨基酸（Tyr、Lys）[4]、維生素[5]等，降低谷物中的植酸，提高谷物礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)的生物利用率。

商業(yè)酵母在我國發(fā)酵面制品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，實現(xiàn)了多種發(fā)酵面食的規(guī)?；５S著產(chǎn)業(yè)的成熟，發(fā)酵面制品的品類和質(zhì)量越來越趨于同質(zhì)化。我國不同地區(qū)的傳統(tǒng)天然發(fā)酵老面或面種，能夠為發(fā)酵谷物制品提供有特色的風(fēng)味、質(zhì)地。通過從我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中挖掘酵母菌資源，有助于改善產(chǎn)品感官品質(zhì)、提供獨有的發(fā)酵風(fēng)味、延緩面制品老化以及延長保質(zhì)期，形成具有豐富特色的蒸煮面食、烘焙制品、冷凍面團等差異化的谷物產(chǎn)品，滿足我國日益增長的消費者需求。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

商業(yè)酵母：安琪即發(fā)性活性干酵母；葡萄糖（分析純）：國藥集團；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、WL瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋公司；大麥麥芽：中糧麥芽（大連）有限公司；黃油：安佳；面粉、糖、鹽、雞蛋：市售；E×Taq酶、dNTPs Mixture、10×Buffer I：TaKaRa 公司；真菌 DNA 提取試劑盒：天根生化科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SMF-16醒發(fā)箱：新麥公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀：英國 SMS公司；WH-11生化培養(yǎng)箱：德國Wiggens公司；J-26S XPI高速冷凍離心機：美國貝克曼公司；ACB-4A1生物安全柜：新加坡ESCO公司；MULTISKAN SKY酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾公司；Ka7580和面機：美國kitchenAid公司；急速冷凍柜：科麥機械公司；JMTY體積測定儀：中儲糧；HP23-AW-40水分活度儀：瑞士 Rotronic；DLFU粉碎機：瑞士布勒公司；ZHWY-111C恒溫?fù)u床：上海智誠公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種分離

將樣品用無菌生理鹽水振蕩稀釋，選取合適的稀釋倍數(shù)，將稀釋液涂布于 WL瓊脂培養(yǎng)基（Wallerstein Laboratory agar medium），28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落于WL培養(yǎng)基平板上劃線純化 3次，經(jīng)鏡檢為純種后轉(zhuǎn)入酵母膏胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose, YPD）瓊脂培養(yǎng)基（酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L）待用。

1.3.2 菌種鑒定

將單株酵母菌接種在YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 rpm震蕩培養(yǎng)至菌液吸光值OD600達1.0以上。按照真菌DNA提取試劑盒說明書操作，提取酵母基因組后用超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。使用引物 ITS1（5?-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3?）和 ITS4（5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）PCR 擴增 ITS 基因序列。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 33.75 μL、10×Buffer 5 μL、dNTPs4 μL、引物各 2.5 μL、Taq 酶 0.25 μL、DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35個循環(huán)，再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)條帶為600 bp左右，之后送至北京新時代眾合科技有限公司進行測序。將獲得的有效序列與美國國立生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.3.3 菌株發(fā)酵性能測定

1.3.2.1 麥汁培養(yǎng)基制備 將麥芽粉碎后，加入8倍質(zhì)量的65 ℃去離子水，在不斷攪拌下于65 ℃水浴中保溫60 min，冷卻后過濾，所得上清即為麥汁培養(yǎng)基。

1.3.2.2 發(fā)酵力 將酵母菌接種至麥汁培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)至菌液吸光值OD600達1.0以上。量取23.5 mL菌液與50 g面粉、7.5 g白砂糖混合均勻，揉制成面團，置于250 mL量筒中，按壓面團使量筒內(nèi)不留空隙，保證面團表面平整，置于35 ℃醒發(fā)箱中，每隔30 min記錄一次面團達到的量筒刻度數(shù)，記錄3 h內(nèi)面團體積的增加值。

1.3.2.3 耐高糖性能 將白砂糖添加至 YPD 液體培養(yǎng)基中，使其糖濃度分別為10%、20%、30%和 40%。將酵母菌接種至不同糖濃度的 YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 rpm搖床培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、2、4、6、9、24、26、30 h時取樣測定菌液吸光值OD600。

1.3.2.4 耐熱性 將酵母菌接種至 YPD液體培養(yǎng)基中，分別置于 28、37、40 ℃搖床培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、2、4、6、9、24、26、30 h時取樣測定菌液吸光值OD600。

1.3.4 酵母應(yīng)用實驗

1.3.4.1 饅頭制備方法 酵母菌用麥汁培養(yǎng)基培養(yǎng)至吸光值OD600達1.0～1.3。量取141 mL菌液與300 g面粉混合均勻，攪拌8～10 min，將面團分塊后成型，每塊約 130 g，置于 35 ℃醒發(fā)箱1.5 h后取出二次成型，再次醒發(fā)40 min后蒸制25 min即可。

1.3.4.2 吐司面包和冷凍面團制備方法 酵母菌用麥汁培養(yǎng)基培養(yǎng)至吸光值OD600達1.0～1.3，離心收集酵母泥沉淀，測定水分、活菌數(shù)量，置于4 ℃冷藏備用。

吐司面包和冷凍面團參照表1中的配方制備，用含同等數(shù)量級活菌的酵母泥替代商業(yè)酵母粉，并基于酵母泥的水分含量，減少配方中的水添加量。

表1 面包配方Table 1 Bread recipe g

吐司面包工藝為：配料稱重→攪打面團→靜置→切塊、搓圓→靜置→排氣整形→靜置→二次整形→醒發(fā)→烘烤。

冷凍面團工藝為：將面團二次整形結(jié)束后，置于速凍箱內(nèi)1.5 h，待面團中心溫度降至–12 ℃后，取出置于–20 ℃凍存。

1.3.5 發(fā)酵面制品性能測定

1.3.5.1 比容 熟制好的樣品冷卻1 h后，參照GB/T 21118—2007[6]方法測定比容。

1.3.5.2 高徑比 用游標(biāo)卡尺測量樣品的高度、直徑，高徑比即為高度與直徑的比值。

1.3.5.3 質(zhì)構(gòu)特性 參考文獻方法[7]并改進。熟制后的樣品放置冷卻1 h后，取兩片12.5 mm的樣品切片疊加，選用質(zhì)構(gòu)儀的P/36R柱形探頭。測試前速率：1.0 mm/s；測試中速率：1.0 mm/s；測試后速率：1.0 mm/s；測定間隔為5 s；壓縮率為50%；觸發(fā)類型設(shè)置為：Auto；起點感應(yīng)力：5 g。

1.3.5.4 感官評定 饅頭感官評分打分標(biāo)準(zhǔn)見表2[8]，面包感官評分打分標(biāo)準(zhǔn)參考 GB/T 35869—2018附錄A[9]。

表2 饅頭感官品評打分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring standard for sensory evaluation of steamed bread

1.3.5.5 水分活度 將樣品整片用粉碎機粉碎，用水分活度儀測定水分活度。

1.3.5.6 冷凍面團活力 冷凍面團每周取一次樣，于4 ℃過夜解凍后，置于37 ℃醒發(fā)箱內(nèi)，待面團體積膨脹至2倍大時取出，記錄醒發(fā)時間。將醒發(fā)好的面團置于烤箱內(nèi)烘熟，冷卻1 h后按1.3.5.1的方法測定比容。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗做3次重復(fù)，用Excel軟件計算標(biāo)準(zhǔn)偏差并作圖，用 SPSS16.0 數(shù)據(jù)處理軟件進行方差等數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的分離及鑒定

2.1.1 菌種的分離篩選

從不同省市采集的傳統(tǒng)老面、天然面種樣品中分離獲得了 65株菌株，其中來源于老面的有45株，來源于天然面種的有20株。菌落呈乳白色，表面光滑，形狀為圓形或橢圓形。

2.1.2 菌種鑒定

將菌株的測序結(jié)果在 NCBI 中使用 BLAST進行同源性比較，結(jié)果分離的65株菌均與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同源性最高，均為釀酒酵母。

2.2 菌株發(fā)酵性能評估

2.2.1 發(fā)酵力

不同酵母在面團中的發(fā)酵力對比如表3所示。

表3 酵母面團不同發(fā)酵時間的體積Table 3 Volume of yeast dough at different fermentation times mL

續(xù)表3

發(fā)酵力是衡量面制品用酵母質(zhì)量的最重要指標(biāo)。酵母發(fā)酵力體現(xiàn)在適當(dāng)?shù)男寻l(fā)溫度下，按一定配方配制的面團在規(guī)定時間內(nèi)經(jīng)酵母發(fā)酵產(chǎn)生的CO2氣體的量[10]，通?？捎擅鎴F的體積變化率來表征。以商業(yè)酵母為對照，不同酵母菌制備的面團，均隨發(fā)酵時間的延長，體積逐漸增加。相比初始體積，能夠使體積膨脹到2倍以上的酵母發(fā)酵力較強。

2.2.2 耐受性

從分離自天然面種的20株酵母菌株中，篩選到可使含糖面團體積在3 h發(fā)酵到2倍以上的8株酵母，驗證其耐糖性和耐熱性。

如圖1所示，優(yōu)選的8株酵母均能耐受30%的糖濃度，但在40%糖濃度中吸光值OD600低于空白對照，說明酵母菌不能耐受40%的糖濃度。谷物用酵母主要分為用于含糖量在 15%～30%的高糖面團的耐高糖酵母，以及用于含糖量小于7%的面團的低糖酵母[11]。前者用于面包等烘焙甜品，后者多用于饅頭、餃子、包點等蒸煮類面制品。本研究篩選出的耐高糖的酵母，均可以在30%糖濃度的體系中正常生長，可保證其在高糖烘焙制品制作過程中保持良好的發(fā)酵特性。

圖1 天然面種來源酵母菌株耐糖性Fig 1 Sugar tolerance of yeast strains from natural flour species

如圖2所示，優(yōu)選的8株酵母在37、40 ℃可正常生長，耐熱性好。傳統(tǒng)釀酒酵母的最適生長溫度為25～33 ℃ ，一般不超過36 ℃[12]。本研究篩選出的酵母能夠適應(yīng)更廣的生長溫度，便于活化和擴大培養(yǎng)，有利于開發(fā)制備高溫噴粉菌劑。

圖2 天然面種來源酵母菌株耐熱性Fig 2 Heat tolerance of yeast strains from natural flour species

2.3 饅頭應(yīng)用性能評估

2.3.1 比容

從來源于老面的45株酵母中，篩選可使面團體積在3 h發(fā)酵到2倍的34株酵母進行饅頭應(yīng)用實驗。經(jīng)過比容測定，有32株酵母制備的饅頭樣品滿足國標(biāo)要求的比容≥1.7 mL/g，其中 Y80、Y88、Y89和Y147最佳，以Y147最為突出。

2.3.2 高徑比

酵母菌的產(chǎn)氣能力有差異，會對饅頭醒發(fā)熟制后的形態(tài)產(chǎn)生不同的影響。以高徑比來評估饅頭的體積膨脹程度[13]。如表4所示，以商業(yè)酵母（A）為對照，有 5株酵母饅頭的高徑比不如商業(yè)酵母，其余29株均優(yōu)于商業(yè)酵母，其中以Y71、Y97和Y100為最佳。

表4 不同酵母饅頭的比容和高徑比Table 4 Specific volume and high diameter ratio of steamed buns made of different yeast

2.3.3 感官評分

評分小于70分判定為差，70～79分為一般，80～89分為良好，大于90分為優(yōu)。

如表5所示，商業(yè)酵母（A）制備的饅頭和5種酵母饅頭 Y89、Y94、Y97、Y146和 Y147均在80分以上，達到了良好的標(biāo)準(zhǔn)。

表5 不同酵母饅頭的感官評分Table 5 Sensory evaluation scores of steamed buns made of different yeast 分

續(xù)表5

2.3.4 質(zhì)構(gòu)

硬度值、彈性值反映樣品的口感品質(zhì)，硬度數(shù)值越大，樣品吃起來就越硬，缺乏彈性、綿軟、爽口的感覺；彈性數(shù)值越大，樣品吃起來柔軟又筋道、爽口不黏牙。不同樣品的硬度、彈性指標(biāo)對比見表6。

表6 不同酵母饅頭的硬度和彈性Table 6 Hardness and elasticity of steamed buns made of different yeast

續(xù)表6

由表6可知，與商業(yè)酵母（A）相比， Y146和Y147具有較低的硬度，口感柔軟細(xì)膩。此外，Y80、Y88和Y102也具有相對低的硬度。

通過表6可知，商業(yè)酵母（A）制備的饅頭樣品在第一次壓縮后能夠再恢復(fù)90%的程度，其他受試的酵母有43株的彈性均優(yōu)于商業(yè)酵母，其中Y88、Y89可達到95%左右。

2.3.5 綜合評估

綜合不同酵母制備饅頭的質(zhì)量指標(biāo)，優(yōu)選出5株適合用于蒸煮類面制品的酵母菌株，分別為Y88、Y89、Y97、Y146 和 Y147。

2.4 吐司面包應(yīng)用性能評估

將來源于烘焙用天然面種的8株耐高糖、耐熱酵母進行吐司面包應(yīng)用驗證。以商業(yè)酵母為對照，評估不同酵母對吐司水分、質(zhì)構(gòu)、切面外觀的影響。

2.4.1 水分活度

由表7可知，面包放置過程中，不同酵母菌對吐司面粉水分活度影響不大。

表7 不同酵母菌對吐司面包保質(zhì)期內(nèi)水分活度的影響Table 7 Effects of different yeasts on water activity of toast during shelf life

2.4.2 質(zhì)構(gòu)

由表8～9可知，面包放置過程中，分離自天然面種的酵母制備的吐司面包普遍硬度低于商業(yè)酵母面包。Y220酵母面包硬度、咀嚼性較高。Y199、Y222面包的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)與商業(yè)酵母較接近。

表8 酵母Y199、Y204、Y209、Y214制備吐司面包保質(zhì)期內(nèi)全質(zhì)構(gòu)分析Table 8 Full texture analysis of toast bread made of yeasts Y199, Y204, Y209 and Y214 during shelf life

表9 酵母Y210、Y212、Y220、Y222吐司面包保質(zhì)期內(nèi)全質(zhì)構(gòu)分析Table 9 Full texture analysis of toast bread made of yeasts Y210, Y212, Y220 and Y222 during shelf life

2.4.3 感官評價

由表10～11可知，Y214樣品面包彈性、放置兩天紋理撕裂性表現(xiàn)最優(yōu)。Y204面包切片的紋理拉絲性、切面氣孔均勻性最優(yōu)。Y212面包紋理拉絲性、切片氣孔均勻程度、放置兩天撕裂性表現(xiàn)均最優(yōu)，Y210面包的彈性最優(yōu)。

表10 酵母Y199、Y204、Y209、Y214吐司面包感官評分排序Table 10 Sensory score ranking of toast bread made of yeasts Y199, Y204, Y209 and Y214

表11 酵母Y210、Y212、Y220、Y222吐司面包感官評分排序Table 11 Sensory score ranking of toast bread made of yeasts Y210, Y212, Y220 and Y222

2.4.4 綜合評估

綜合不同酵母吐司面包的質(zhì)量指標(biāo)，優(yōu)選出4株適合用于烘焙類面制品的酵母菌株，分別為Y204、Y210、Y212 和 Y214。

2.5 冷凍面團活力評估

從優(yōu)選的4株適合用于烘焙類面制品的酵母菌株中，挑選使含糖面團發(fā)酵3 h后體積較大、發(fā)酵力強的 2株酵母 Y204、Y214，進行冷凍面團應(yīng)用驗證。

以酵母 Y214、Y204、商業(yè)酵母為發(fā)酵劑制備餐包冷凍面團，速凍后置于–20 ℃凍存，定期監(jiān)測冷凍面團的發(fā)酵活力，評估面團醒發(fā)烘烤后的比容。

冷凍面團隨著凍存時間的延長，其醒發(fā)、烘烤后的比容有降低的趨勢，直至無法醒發(fā)膨脹至正常體積，活力喪失，這些現(xiàn)象主要是酵母活力下降導(dǎo)致的[14]，一方面低活力酵母的活細(xì)胞數(shù)減少，產(chǎn)氣力降低，不能維持面團正常的醒發(fā)體積；另一方面，酵母細(xì)胞膜冷凍損傷后，釋放出的還原性物質(zhì)（例如谷胱甘肽）會弱化面筋，從而減弱面團的持氣力[15]。選擇活力較高的抗凍酵母品種是維持冷凍面團品質(zhì)的關(guān)鍵。由表12可知，與商業(yè)酵母對比，Y204、Y214酵母的抗凍性較強，制作的冷凍面團凍存35天依然能正常醒發(fā)。且Y204、Y214制備的冷凍面團餐包的比容和挺立度均優(yōu)于商業(yè)酵母。其中Y214酵母的抗凍性最優(yōu)。

表12 酵母冷凍面團存放期內(nèi)比容變化Table 12 Specific volume change of yeast frozen dough during storage

3 結(jié)論

本研究從我國不同省市的老面、天然面種中分離得到65株酵母菌株。在以饅頭為代表的蒸煮類發(fā)酵制品的應(yīng)用中，通過分析比容、高徑比、質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)以及結(jié)合感官品評結(jié)果優(yōu)選出 Y88、Y89、Y97、Y146和 Y147五株酵母。在以吐司面包為代表的烘焙類發(fā)酵制品的應(yīng)用中，通過分析水分、質(zhì)構(gòu)、感官品評結(jié)果優(yōu)選出Y204、Y210、Y212和Y214四株酵母。其中Y204、Y214的抗凍性強，能夠使冷凍面團的活力維持28天以上。

可結(jié)合各種酵母的不同特色進行復(fù)配，發(fā)揮各自最大的優(yōu)勢，開發(fā)特色酵母發(fā)酵劑，為消費者提供差異化的烘焙和蒸煮面制品。此外，延長冷凍面團活力的抗凍酵母的發(fā)掘有助于提升冷凍面團穩(wěn)定性，是冷凍面團技術(shù)體系中不可或缺的重要部分，該技術(shù)使面團制作環(huán)節(jié)與成品熟制售賣環(huán)節(jié)獨立開來，在強化產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量的同時擴大供應(yīng)范圍。本研究篩選的抗凍性強的酵母具有在冷凍面團中應(yīng)用的潛力，對于加工符合我國文化特點的冷凍面制品、推動我國發(fā)酵面食工業(yè)化進程、滿足消費者多樣化需求具有重要意義。