張圣平，鄧 瓊，張 穎，張建文，梁 輝，王 鑄

(南方醫(yī)科大學附屬深圳龍華醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518109)

腎結(jié)石在中國成年人中很常見，大約每17名成年人中就有1人遭受尿路結(jié)石困擾[1]，其中草酸鈣結(jié)石占尿路結(jié)石發(fā)病率的65%以上[2]。草酸鈣晶體造成腎小管上皮細胞適應(yīng)性改變并表達多種調(diào)節(jié)大分子，從而影響草酸鈣結(jié)晶的粘附、聚集和生長，在腎結(jié)石的形成過程中起重要作用[3]。草酸鈣結(jié)石晶體的形成造成了腎小管上皮細胞蛋白組和轉(zhuǎn)錄組表達譜的改變[4-5]，對腎臟功能存在顯著的影響。但是這些研究未能揭示蛋白組和轉(zhuǎn)錄組表達水平不一致的差異基因表達譜及其在腎結(jié)石形成和腎小管損傷過程中參與的調(diào)控通路。

本研究首次采用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組關(guān)聯(lián)分析探討草酸鈣結(jié)石晶體對人近曲腎小管上皮細胞的影響，重點分析了轉(zhuǎn)錄組與蛋白組差異表達基因，初步探討差異表達基因在草酸鈣結(jié)石造成的腎損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料本研究采用的人近曲腎小管上皮細胞HK-2(目錄號SCSP-511)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(https://www.cellbank.org.cn/)。本研究中使用的草酸鈣結(jié)石樣本來自深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，標本使用符合醫(yī)學倫理相關(guān)規(guī)定，且征得患者的知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品制備 人近曲腎小管上皮細胞HK-2采用K-SFM(Invitrogen，17005-042)培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中包含兩個組分:基礎(chǔ)培養(yǎng)液1瓶(貨號10724-011)+生長因子2管(貨號37000-015)，在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2、飽和濕度的環(huán)境下恒溫培養(yǎng)。

草酸鈣結(jié)石樣品經(jīng)過無菌水沖洗、UV照射并充分干燥后研磨成粉末，經(jīng)過結(jié)石成分分析確認[一水草酸鈣(calcium oxalate monohydrate，COM)含量>99%]后使用K-SFM培養(yǎng)基配制成濃度為100 μg/ mL的草酸鈣結(jié)石晶體懸浮液。按照1×105個/孔的密度將HK-2細胞接種到6孔板，在細胞密度達到70%～80%的匯合度時加入配制好的草酸鈣晶體懸浮液，以加入等量K-SFM培養(yǎng)基作為對照組，培養(yǎng)48 h后用于下一步實驗研究。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組與蛋白組關(guān)聯(lián)分析 將制備好的樣本分別由Macrogen(www.macrogencn.com)完成轉(zhuǎn)錄組測序分析，由美吉生物(www.majorprotein.com)完成蛋白組分析。采用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)將差異蛋白注釋為3個大類，即生物進程、細胞組成、分子功能。采用KEGG Mapper(http://www.kegg.jp/kegg/mapper.html)進行通路富集分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)錄組定量結(jié)果通過差異分析得到各個比較組中轉(zhuǎn)錄組相對表達量log2FC和差異統(tǒng)計學檢驗P值。由于轉(zhuǎn)錄組差異分析數(shù)據(jù)量較大，為了進一步降低假陽性率，對P值做了BH校驗。當log2FC>1且校驗后的P<0.05時，為顯著差異表達上調(diào)轉(zhuǎn)錄本；log2FC<-1且校驗后的P<0.05時，為顯著差異表達下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。蛋白質(zhì)組定量結(jié)果通過差異分析得到各個比較組中蛋白相對表達量比值和差異統(tǒng)計學檢驗P值。由于差異表達蛋白數(shù)據(jù)量相對轉(zhuǎn)錄組較小，這里不需要對P值做進一步的錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)校驗。當比值>1.2且P<0.05時，為顯著差異表達上調(diào)蛋白；比值< 1/1.2且P<0.05時，為顯著差異表達下調(diào)蛋白。

1.2.3實驗組與對照組差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 將篩選出的差異表達基因集合導(dǎo)入STRING(http://string-db.org/)。除了從實驗數(shù)據(jù)和各種數(shù)據(jù)庫中挖掘數(shù)據(jù)外，還從染色體臨近、基因融合、系統(tǒng)進化和基于芯片數(shù)據(jù)的基因共表達等方面進行綜合打分(0.4～1.0分)，從而預(yù)測出蛋白分子間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點代表一個蛋白分子，連線表示蛋白之間的相互作用關(guān)系，連線越寬表示得分越高，連線越窄表示得分越低，本研究選擇默認得分最小值0.4為中等得分。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組與蛋白組定量比較分析本項目通過轉(zhuǎn)錄組與蛋白組定量研究分別定量到57 833個轉(zhuǎn)錄本和6 407個蛋白。通過比較轉(zhuǎn)錄組與蛋白組的定量情況，我們發(fā)現(xiàn)有6 144個基因在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組水平都定量。蛋白組與轉(zhuǎn)錄組差異分析結(jié)果表明，在蛋白水平有464個分子發(fā)生顯著下調(diào)，有699個分子發(fā)生顯著上調(diào)表達；在轉(zhuǎn)錄組水平，有11個分子下調(diào)表達，有14個分子上調(diào)表達(圖1A)。采用以轉(zhuǎn)錄本ID為標準的韋恩圖分析表明，有681個蛋白發(fā)生了上調(diào)，455個蛋白發(fā)生下調(diào)表達(圖1B)。

A：不同比較組中蛋白(左)與轉(zhuǎn)錄本(右)定量火山圖；B：差異表達蛋白與差異表達轉(zhuǎn)錄本比較分析韋恩圖。

2.2 轉(zhuǎn)錄組與蛋白組差異蛋白的功能富集分析通過轉(zhuǎn)錄組與蛋白組定量比較分析將蛋白或轉(zhuǎn)錄本分為多種不同類型的表達情況，每種表達情況可以對應(yīng)一種調(diào)控關(guān)系。差異蛋白的KEGG和GO富集分析結(jié)果表明：在蛋白組下調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異這個集合中纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，初級膽汁酸生物合成以及DNA的非同源末端鏈接為最顯著的KEEG通路(圖2A)；在蛋白組上調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異的集合中維生素B6代謝，硫中繼系統(tǒng)以及糖胺聚糖生物合成為最顯著的KEEG通路(圖2B)。GO分析結(jié)果表明，在蛋白組下調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異的集合中線粒體衍生囊泡與腺嘌呤跨膜轉(zhuǎn)運體活性富集指數(shù)最高(圖3A)；在蛋白組上調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異snRNA的細胞核輸出以及中心粒周圍異染色質(zhì)組裝具有最高的富集指數(shù)(圖3B)。

A：蛋白組下調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異組；B：蛋白組上調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異組。

A：蛋白組下調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異組；B：蛋白組上調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異組。

2.3 差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析STRING分析顯示在草酸鈣晶體處理后HK-2細胞差異表達基因MYH9、MYH14、MYH1、MYL12A、ACTB、ARPC1A、ARPC2、ANXA2、CFL1、PRDX1及PRDX2之間具有最為密切的相互作用(圖4)。其相互作用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點為39，邊數(shù)34，平均節(jié)點度1.74，平均局部聚類系數(shù)為0.39，預(yù)期邊數(shù)為9，PPI富集P<0.001。

圖4 差異表達蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

3 討 論

腎結(jié)石的形成是一個異常復(fù)雜的過程，經(jīng)典的結(jié)石形成機制包括晶核形成、尿液過飽和、晶體成長、晶體聚集等一連串的生物化學過程[6-7]。越來越多的研究關(guān)注到腎結(jié)石晶體對腎小管細胞造成的病理以及基因表達層面的損傷[8]，結(jié)石晶體與腎臟細胞之間的相互作用研究對揭示結(jié)石起源及其造成的腎功能損害具有重要意義。

本研究通過構(gòu)建結(jié)石晶體與近曲腎小管上皮細胞相互作用模型，采用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組關(guān)聯(lián)分析的方法，揭示了結(jié)石晶體對HK-2細胞蛋白組以及轉(zhuǎn)錄組的改變。發(fā)現(xiàn)了蛋白組和轉(zhuǎn)錄組差異表達的基因集合，差異表達基因主要集中在蛋白組改變-轉(zhuǎn)錄組無差異的集合，表明差異基因蛋白表達水平調(diào)控很可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)[5, 9-10]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)蛋白組上調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異的基因681個，蛋白組下調(diào)-轉(zhuǎn)錄組無差異的基因455個。GO功能富集分析顯示，差異基因主要涉及線粒體衍生囊泡、腺嘌呤跨膜轉(zhuǎn)運、snRNA的細胞核輸出以及中心粒周圍異染色質(zhì)組裝等功能。證據(jù)表明腎小管上皮細胞線粒體功能障礙與草酸鈣晶體形成、聚集以及Randall斑塊的形成有關(guān)，是腎結(jié)石形成的重要機制[11]。KEEG富集分析顯示差異表達基因主要影響纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，維生素B6代謝、硫中繼系統(tǒng)以及糖胺聚糖生物合成和DNA非同源末端鏈接等信號通路。研究發(fā)現(xiàn)維生素B6作為丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的輔助因子，可通過減少肝臟中草酸的生成來減少草酸的排泄，與腎結(jié)石的形成密切相關(guān)[12]。有研究表明乙醛酸和二羧酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，檸檬酸循環(huán)4種代謝途徑都與腎結(jié)石密切相關(guān)[13-14]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路可能為蛋白質(zhì)/氨基酸代謝在腎結(jié)石形成中的作用提供新的見解，其確切作用及機制有待進一步研究。運用STRING構(gòu)建差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)后，發(fā)現(xiàn)ACTB、MYH9、MYH14、CFL1等11個關(guān)鍵節(jié)點基因。ACTB和CFL1參與細胞運動、結(jié)構(gòu)、完整性和細胞間信號傳導(dǎo)，在細胞骨架以及細胞形狀維持中發(fā)揮重要作用[15]；研究發(fā)現(xiàn)MYH9、MYH10以及MYH14與腎小球濾過功能密切相關(guān)，賦予腎單位片段特異性膜轉(zhuǎn)運特性[16]。由此可見草酸鈣晶體對近曲腎小管上皮細胞功能和形態(tài)具有顯著影響。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組與蛋白組關(guān)聯(lián)分析揭示草酸鈣結(jié)石晶體對人腎近曲小管上皮細胞基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)了腎結(jié)石形成過程中可能涉及的關(guān)鍵通路及關(guān)鍵基因，為腎結(jié)石形成機制的闡明及防治策略研究提供了新線索。本研究采用高通量技術(shù)以及生物信息學分析，研究方法存在一定局限性，相關(guān)基因及通路還需要細胞實驗及臨床樣本進一步驗證。