劉光輝 徐一闖 魏曉雷 仲崇超 劉香元 羅 智,2

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 營養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室(海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室), 青島 266299)

抗生素因其在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和人類疾病治療的高效性, 在世界范圍內(nèi)被廣泛使用。然而抗生素的大量使用以及過期抗生素藥品的處理不當(dāng)?shù)? 增加了抗生素在各種環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn), 如地下水、地表水和沉積物[1,2]。四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines,TCs)是一類由鏈霉菌產(chǎn)生的廣譜類抗生素, 其成員包括金霉素(Chloretracyelin, CTC)、土霉素(Oxyeracyein, OTC)和四環(huán)素(Tetracycline, TC), 四環(huán)素是四環(huán)素類抗生素中最基本的化合物, 臨床研究中一般使用其鹽酸鹽形式。近些年來, 越來越多的報(bào)道證實(shí)了四環(huán)素在水生環(huán)境中的存在, 通過對我國北方地區(qū)市政污水中抗生素含量分析, 檢測到水體中四環(huán)素濃度為1114.27 ng/L[3]; 長江中游的洪湖及水系中被檢測到的四環(huán)素含量為1454.8和304.8 ng/L[4], 在韓國漢河中檢測出四環(huán)素抗生素為200 ng/L[5]。

相關(guān)研究表明, 相較于其他水體生物, 魚類對水體中藥物暴露敏感度較低[5,6], 這表明水生環(huán)境中藥物的存在可能會給魚類帶來慢性危害, 即使在環(huán)境暴露水平下也可能導(dǎo)致魚類遺傳和組織學(xué)的變化[7]。許多研究報(bào)告了水體中ng/L水平的四環(huán)素抗生素可能會導(dǎo)致魚類的分子和代謝紊亂[8], 包括增加魚類的體重, 改變腸道微生物種群結(jié)構(gòu), 增加肝臟甘油三酯含量[9], 抑制線粒體β氧化, 促進(jìn)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和甘油三酯的生成[10], 并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和機(jī)體活性氧(ROS, Reactive Oxygen Species)的產(chǎn)生[2]。即使長期暴露在低于環(huán)境濃度和水產(chǎn)養(yǎng)殖允許劑量的抗生素中, 魚體的抗氧化能力也會受到損傷并產(chǎn)生氧化應(yīng)激, 并降低線粒體β氧化能力、增加肝臟脂肪積累及脂質(zhì)過氧化[11]。因此, 詳細(xì)地了解這一類抗生素在環(huán)境相關(guān)暴露水平下的作用機(jī)制, 對預(yù)防因四環(huán)素導(dǎo)致的魚類生理功能紊亂是必要的。

羅非魚是世界范圍內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要魚類, 因其優(yōu)秀的生長性能、易于養(yǎng)殖及可得到的全基因組信息, 成為一種理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚12]。本研究通過使用吉富羅非魚(Oreochromis niloticus; 以下簡稱羅非魚)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? 旨在評估環(huán)境相關(guān)的四環(huán)素長期暴露對羅非魚生長和肝臟代謝的影響, 包括氧化應(yīng)激、脂肪代謝和肝臟的組織學(xué)改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

本實(shí)驗(yàn)中吉富羅非魚購自于赤壁市養(yǎng)殖場, 選用225尾健康良好、規(guī)格均一的羅非魚[均重:(5.38±0.01) g, 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤]隨機(jī)放養(yǎng)于9個玻璃缸中, 每個缸中25尾。設(shè)置3個四環(huán)素濃度: 0(對照)、400(低)和800(高) ng/L, 每個處理3個重復(fù), 將鹽酸四環(huán)素配制成實(shí)驗(yàn)濃度, 四環(huán)素的暴露濃度設(shè)置參考了中國和其他國家環(huán)境水域報(bào)告水平[3,4]?？紤]到四環(huán)素是一種可光降解化合物[1,9], 因而實(shí)驗(yàn)期間避光處理。羅非魚每天飽食投喂商品飼料2次[商品飼料中四環(huán)素含量為(32.62±1.07) ng/g], 每天換水2次, 每次換水后將四環(huán)素濃度調(diào)整為實(shí)驗(yàn)所需的濃度, 實(shí)驗(yàn)用水中四環(huán)素濃度未檢出。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行10周, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每缸取12尾羅非魚, 取羅非魚的肝臟組織, 羅非魚各項(xiàng)生長性能的計(jì)算方式如下:

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料鹽酸四環(huán)素(Tetracycline Hydro-chloride, 分析級)購自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。RNA提取(TRIzol)試劑盒購自于Invitrogen公司、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑購自于TaKaRa公司、無水乙醇、氯仿和異丙醇等為中國國藥分析純產(chǎn)品, 購自于中國國藥有限公司。甘油三酯(Triglyceride, TG)測定試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase, T-SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(Catalase, CAT)測定試劑盒、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)檢測試劑盒和總蛋白質(zhì)測定試劑盒購自于南京建成生物工程研究所有限公司, 四環(huán)素ELISA試劑盒購自于深圳容金科技有限公司。

基因表達(dá)分析參考文獻(xiàn)[13]方法, 羅非魚肝臟總RNA的提取按照說明書進(jìn)行, 通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測其質(zhì)量, 使用Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)測定其濃度和純度, 根據(jù)TaKaRa的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書, 合成第一鏈cDNA, 保存于–20℃。熒光定量引物見表 1, 選擇了6個管家基因(β-actin、B2m、Rpl7、Hprt、Ubce和18S RNA)檢測轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性[13]。使用(https://genorm.cmgg.be/)geNorm分析,Rpl7和β-actin的基因表達(dá)水平最為穩(wěn)定。因此, 將基因表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為Rpl7和βactin的幾何平均值, 通過2–ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。

表1 熒光定量引物Tab. 1 Primers used for real-time PCR

肝臟TG含量、抗氧化酶活性、脂代謝酶活性測定和四環(huán)素殘留檢測肝臟TG含量、MDA、T-SOD、CAT、T-AOC和蛋白質(zhì)濃度根據(jù)其商業(yè)分析試劑盒說明書測定, 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室方法測定6PGD (6-phosphogluconate dehydrogenase)、G6PD(Glucose 6-phosphate dehydrogenase)、ME (Malic enzyme)、ICDH (Isocitrate dehydrogenase)、FAS(Fatty acid synthase)和CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1)的活性[13]。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測肝臟四環(huán)素濃度。

油紅O染色、HE染色和透射電鏡觀察根據(jù)之前研究中描述的方法進(jìn)行油紅O染色和HE染色[13]。每個樣品選取十個視野使用 Image J進(jìn)行量化, 以收集油紅O染色中脂滴數(shù)目和HE染色中肝臟空泡相對面積的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。在武漢病毒所使用透射電鏡觀察肝臟線粒體形態(tài)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析, 以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示結(jié)果。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析前, 采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)評估不同處理的正態(tài)性。各處理組間顯著性使用單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗(yàn),P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異, 采用不同字母表示不同四環(huán)素處理組間差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 生長性能參數(shù)、四環(huán)素和脂肪積累

四環(huán)素暴露顯著影響羅非魚的生長性能參數(shù)和肝臟四環(huán)素含量。特定生長率、增重率和肝體比顯著高于對照組(Control組), 前兩者隨四環(huán)素暴露濃度增加而增加(表2)。四環(huán)素暴露顯著增加了羅非魚肝臟中四環(huán)素含量和甘油三酯含量, 且依賴四環(huán)素的暴露濃度(圖1a和1b)。

表2 不同四環(huán)素暴露水平對羅非魚生長性能的影響Tab. 2 The effects of different tetracycline exposure levels on growth performance of Tilapia

圖1 四環(huán)素暴露后羅非魚肝臟四環(huán)素濃度(a)和甘油三酯含量(b)的變化Fig. 1 The tilapia liver tetracycline concentration (a) and the triglyceride content (b) after tetracycline exposure

2.2 肝臟HE和油紅O染色

肝臟中空泡的數(shù)量隨四環(huán)素濃度增加而增加(圖2a), 并且, 四環(huán)素暴露增加了肝臟脂滴的數(shù)量(圖2b—d)。

2.3 脂肪代謝相關(guān)酶活性和基因表達(dá)

FAS的活性隨著四環(huán)素濃度增加而增加(圖3a),相對于Control組, 四環(huán)素暴露顯著上調(diào)了ME、G6PD、ICDH和6PGD的活性(圖3b—e), 而抑制了CPT1的活性(圖3f)。參與脂肪合成的基因和轉(zhuǎn)錄因子(fas、scd、accα、srebp1和pparγ)隨著四環(huán)素濃度增加而增加, 相反的, 與脂肪分解相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子(atgl、hsl、cpt1和pparα)因四環(huán)素濃度增加而降低(圖3g)。

2.4 肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察

相較于Control組, 四環(huán)素暴露導(dǎo)致肝臟線粒體形態(tài)發(fā)生變化, 形態(tài)不規(guī)整, 線粒體嵴模糊(圖4)。

圖4 四環(huán)素對羅非魚肝臟線粒體形狀的影響Fig. 4 Effect of Tetracycline on the shape of tilapia liver mitochondria

2.5 抗氧化能力和MDA水平

與Control組相比, 四環(huán)素暴露降低T-SOD和CAT的活性, 總抗氧化能力(T-AOC)顯著降低(圖5a—c), MDA水平隨著四環(huán)素濃度增加而增加(圖5d)。

3 討論

抗生素在畜牧養(yǎng)殖、疾病防治和漁業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用, 隨著抗生素的使用增加, 抗生素長期暴露所產(chǎn)生的后果成為人們關(guān)注的對象。在生命的早期接觸抗生素后, 會改變機(jī)體腸道微生物群的組成, 影響機(jī)體的功能代謝, 包括促進(jìn)體重增加或者生長遲緩, 并且亞治療劑量的抗生素會增加小鼠的總脂肪量[14]。本研究結(jié)果表明, 環(huán)境相關(guān)水平的四環(huán)素暴露顯著增加了羅非魚的增重率, 并且呈濃度依賴性, 相關(guān)的研究也報(bào)道了長期的四環(huán)素暴露會增加斑馬魚(Danio rerio)體重[9], 這與本研究相一致。

四環(huán)素具有誘導(dǎo)脂肪變性的潛力, 并且作為一種抗菌藥物, 也有報(bào)道稱四環(huán)素能夠誘導(dǎo)肝損傷(DILI, Drug Induced Liver Injury)[15]。由于四環(huán)素的廣泛使用, 在各種水生環(huán)境檢測到不同濃度的四環(huán)素, 魚類作為長期接觸四環(huán)素的對象, 需要詳細(xì)了解四環(huán)素抗生素對魚類肝臟生理功能的影響及機(jī)制。肝臟是魚體重要的脂質(zhì)代謝和解毒器官, 首先檢測了羅非魚肝臟中甘油三酯含量及四環(huán)素濃度, 結(jié)果表明, 肝臟甘油三酯含量和四環(huán)素濃度隨四環(huán)素暴露濃度增加而增加(圖1a和1b)。同時(shí), HE和油紅O染色結(jié)果也表明四環(huán)素可以促進(jìn)肝臟中脂肪的增加, 這與甘油三酯的增加是一致的(圖2a和2b)。

圖2 四環(huán)素對羅非魚肝臟組織學(xué)和組織化學(xué)的影響Fig. 2 The effects of tetracycline on liver histology and histochemistry of Tilapiaa. 肝組織學(xué)(HE); b. 組織化學(xué)(油紅O染色); c和d. HE染色中空泡的相對面積和油紅O染色中的脂滴的數(shù)目; 肝細(xì)胞(he); 液泡(va); 脂滴(LD)a. liver histology (HE); b. histochemistry (Oil red O staining); c and d. the relative area of vacuoles in HE staining and the number of lipid droplets in oil red O staining. Hepatocytes (he); Vacuole (va); Lipid droplets (LD)

為了研究四環(huán)素誘導(dǎo)羅非魚肝臟脂肪積累的機(jī)制, 檢測和分析了脂肪代謝相關(guān)酶的活性和基因表達(dá)(圖3), 參與脂肪代謝的基因受到固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1(Sterol regulatory element-binding protein,Srebp1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator activated receptor γ,Pparγ)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome proliferator activated receptor α,Pparα)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控, 四環(huán)素顯著上調(diào)了srebp1和pparγ的基因表達(dá)水平,srebp1和pparγ參與了脂質(zhì)生成和脂質(zhì)儲存的調(diào)控,并且會優(yōu)先調(diào)節(jié)參與甘油三酯合成基因的轉(zhuǎn)錄[16]。脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase,Fas)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(Stearoyl-CoA desaturase,Scd)和乙酰輔酶A羧化酶α(Acetyl-CoA carboxylase α,Accα)是srebp1和pparγ下游的靶基因,fas、accα和scd的轉(zhuǎn)錄活性隨四環(huán)素暴露濃度增加而增加, 這與相關(guān)的報(bào)道相一致[17]。脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triacylglyceride lipase ,Atgl)和激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,Hsl)催化脂質(zhì)分解, 將甘油三酯轉(zhuǎn)化為二?；视?Diacylglycerol)和單酰基甘油(Monoacylglycerol)[13],pparα在脂質(zhì)分解以及線粒體β氧化中發(fā)揮重要作用, 能誘導(dǎo)cpt1的基因表達(dá)[18], 在本研究中, 四環(huán)素通過降低pparα、atgl、hsl和cpt1的表達(dá), 抑制了羅非魚肝臟脂質(zhì)分解。6PGD、G6PD、ME、ICDH和FAS在脂肪生成過程中扮演非常重要的角色, 四環(huán)素顯著增加了6PGD、G6PD、ME、ICDH和FAS的酶活性(圖3b—e), 提高了FAS的mRNA水平(圖3a), 這有利于脂肪生成, CPT1是線粒體脂肪酸β氧化的主要調(diào)節(jié)酶和限速酶, 其轉(zhuǎn)錄表達(dá)和酶活性受到四環(huán)素的抑制(圖3f)。已有的研究報(bào)道了四環(huán)素暴露會影響肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)[17], 包括上調(diào)脂肪酸攝取相關(guān)基因、抑制脂肪酸β氧化進(jìn)程和脂肪酸轉(zhuǎn)出[10], 這與我們的研究結(jié)果相一致。在本研究中, 四環(huán)素誘導(dǎo)的羅非魚肝臟脂肪沉積可歸因于脂肪生成的增加和脂肪分解的降低。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是四環(huán)素誘導(dǎo)肝臟脂肪積累的可能機(jī)制[19]。SOD和CAT是抗氧化防御的第一道防線, SOD催化轉(zhuǎn)化為H2O2, 而后CAT催化H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[20]。本研究結(jié)果顯示, 四環(huán)素顯著降低T-SOD和CAT的活性, 總抗氧化能力(T-AOC)被顯著性抑制(圖5a—c), 表明機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)被破壞, 研究報(bào)道了高水平的四環(huán)素能夠誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生[2]。因此,在本研究中, 四環(huán)素暴露可能通過對抗氧化能力的削弱和ROS的誘導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激, 進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體形狀異常和損傷(圖4), 線粒體β氧化受阻可能與此有關(guān)。此外, 抗氧化能力的降低也導(dǎo)致MDA水平上升(圖5d), MDA是機(jī)體中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物, 脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物。最近的研究表明高糖喂食增加了黃顙魚肝臟中MDA的水平和黃顙魚的生長性能[13]。增加的MDA含量和增加的生長性能與我們的結(jié)果相一致。此外其他研究也報(bào)道了在MDA增加的時(shí)候,魚類體重出現(xiàn)了無差異和下降的趨勢[21,22], MDA和體重之間的聯(lián)系還需要進(jìn)一步的研究。

圖5 四環(huán)素對羅非魚肝臟抗氧化能力的影響Fig. 5 The effect of tetracycline on the antioxidant capacity of tilapia liver

本研究以吉富羅非魚為模型, 評估了環(huán)境相關(guān)的四環(huán)素長期暴露對羅非魚生長性能和肝臟脂質(zhì)代謝的影響。環(huán)境相關(guān)四環(huán)素暴露會增加羅非魚的體重, 這可能是早期接觸四環(huán)素的結(jié)果。此外,四環(huán)素長期暴露會導(dǎo)致羅非魚肝臟組織空泡和脂滴數(shù)目增加, 并引起羅非魚肝臟產(chǎn)生氧化應(yīng)激和脂肪積累, 進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過氧化增加。本研究結(jié)果表明, 長期暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的四環(huán)素中, 會增加魚類氧化應(yīng)激的風(fēng)險(xiǎn), 影響肝臟正常的脂肪代謝, 損害肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和正常生理功能。