程景顥 李 謠 沈銘浩 楊智茹 張偉健 張 凱 王 濤 張國松,2* 尹紹武*

(1. 南京師范大學海洋科學與工程學院, 江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術工程研究中心, 南京 210023;2. 菏澤學院, 山東省“十三五”高校生理生化及應用重點實驗室, 菏澤 274015)

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)隸屬于鲇形目、鲿科、黃顙魚屬, 廣泛分布于我國長江、黃河、松花江及珠江等水系[1], 因其肉質(zhì)細嫩、蛋白豐富和肌間刺少等優(yōu)點受到廣大消費者青睞。據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計, 2019和2020年黃顙魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量均超過5×108kg, 年均增幅為5.31%[2]。瓦氏黃顙魚(P. vachelli)俗稱江黃顙魚、硬角黃辣丁、郎絲, 與黃顙魚同為一屬, 具有生長周期短、食性雜和適溫性廣等優(yōu)點[3]。本研究團隊以二代選育的瓦氏黃顙魚為父本、三代選育的黃顙魚為母本, 獲得雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”(GS-02-001-2018), 其生長速度和成活率均高于母本黃顙魚, 且抗病力強, 與父本瓦氏黃顙魚相比, 可食用部分多, 更耐運輸[4], 受到廣大養(yǎng)殖戶和消費者的喜愛, 目前已成為我國重要的優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖水產(chǎn)品種, 具有推動黃顙魚產(chǎn)業(yè)升級的潛力[5]。

水體中的溶解氧是影響水生生物生存的一個重要生態(tài)因子[6], 低溶解氧對于魚類而言是一種常見的現(xiàn)象。魚類呼吸作用所吸收的一部分氧元素在生物體中轉(zhuǎn)化為活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS),少量的ROS參與細胞信號通路, 調(diào)控不同的細胞活性和基因表達, 而在低氧或恢復過程中ROS過量產(chǎn)生, 致使魚類產(chǎn)生氧化應激反應[7]。如在雜交黃顙魚的低氧脅迫研究中, Pei等[8]發(fā)現(xiàn)肝臟組織抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)和氧化應激參數(shù)(MDA)顯著上調(diào), 同樣在多種硬骨魚類如暗紋東方鲀(Takifugu fasciatus)[9]、團頭魴(Megalobrama amblycephala)[10]、葛氏鱸塘鱧(Perccottus glenii)[11]和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[12]等, 在低氧脅迫下均激活抗氧化系統(tǒng)抵抗過量產(chǎn)生的ROS和氧化應激損傷。

盡管魚類可通過一些急性應激反應來應對水體短期缺氧, 以維持其正常生理活動, 但是水體的嚴重低氧往往引起魚類瞬間大量窒息死亡。研究表明, 魚類大腦和心肌細胞在低氧狀態(tài)下的凋亡,是導致“泛塘”的主要原因之一[13]。 然而, 目前關于魚類低氧脅迫誘導細胞凋亡的分子調(diào)控機制研究仍處于初步階段。王鵬飛等[14]通過對鱖(Siniperca chuatsi)肝臟轉(zhuǎn)錄組測序分析, 發(fā)現(xiàn)該魚在低氧脅迫下bax和caspase8等促凋亡基因上調(diào); 在長期低氧脅迫中, 鯉(Cyprinus carpio)[15]肝臟中bcl-2基因表達量顯著上調(diào); 丁晨雨等[16]發(fā)現(xiàn)低氧脅迫可誘導鰱(Hypophthalmichthys molitrix)心肌細胞發(fā)生凋亡。

腸道是魚類消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所和器官,大量微生物寄居其中。微生物菌群可以調(diào)控上百個基因的表達, 參與促使腸道細胞增殖、提高吸收能力和調(diào)節(jié)免疫應答等[17], 其組成變化與環(huán)境因子及宿主個體間關系密切, 當環(huán)境應激作用于魚類個體時, 常常伴隨著腸道環(huán)境的改變, 影響微生物數(shù)量和結構, 進而影響宿主的健康[18]。已有研究報道,日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)[19]、花鱸(Lateolabrax Maculatus)[20]和瓦氏黃顙魚[21]等水生動物在低氧脅迫下腸道組織結構受損, 腸道微生物多樣性顯著下降, 致病菌數(shù)量顯著增加。

目前, 國內(nèi)外學者對魚類腸道組織的環(huán)境脅迫研究逐漸重視, 而雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道組織在低氧脅迫下的研究未見報道。鑒于近年來全國各地養(yǎng)殖戶對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”的需求擴大,了解其在低氧脅迫下的生理響應機制有助于推動黃顙魚產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展。本文以雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”為研究對象, 探討低氧脅迫對該魚腸道的氧化應激、組織形態(tài)、細胞凋亡及腸道微生物組成的影響, 初步揭示低氧脅迫下雜交黃顙魚的腸道組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機制, 有助于更好地了解雜交黃顙魚腸道的低氧響應機制, 可為后續(xù)開展魚類耐低氧新品種選育提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”取自江蘇省南京市水產(chǎn)科學研究所, 飼養(yǎng)條件為: 水溫(27±1.0) ℃,pH 7.5—8.0, 以人工配合飼料投喂幼魚, 每天喂食兩次。挑選180尾無傷無病、體質(zhì)健壯的雜交黃顙魚(15.5±1.3) g隨機平均分配于6個玻璃缸中(30尾/缸, 100 L), 在水流量5 L/min, 溶解氧濃度(Dissolved Oxygen, DO)6.8 mg/L條件下馴養(yǎng)14d, 正式實驗前禁食24h。

1.2 實驗設計與方法

實驗設置對照組(7.0±0.5) mg/L和低氧組(1.0±0.1) mg/L, 每個處理組設3個重復, 實驗過程中使用溶氧測定儀(LDO101, 上海鑫嵩公司)檢測水體中DO值。對照組: 玻璃缸水體中始終充入空氣將DO維持在(7.0±0.5) mg/L, 持續(xù)96h; 低氧組: 直接充入氮氣25—30min使DO由(7.0±0.5)降至(1.0±0.1) mg/L,之后調(diào)節(jié)氮氣充入量維持72h, 在低氧脅迫72h后停止充入氮氣, 并充入30min空氣使DO恢復至(7.0±0.5) mg/L, 維持24h[22]。在實驗0、24h、48h、72h和恢復溶氧24h(記為H0、H24、H48、H72和R24),每個時間點對照組和低氧組分別解剖12尾魚(每個缸隨機選取4尾魚)取中腸組織, 其中9尾魚用于獲取3個生物學重復樣本, 經(jīng)液氮處理后放置–80℃保存, 用于后續(xù)酶活、凋亡相關基因表達及腸道微生物的測定; 另外3尾魚的中腸保存于4%多聚甲醛固定液中, 備用于切片檢測。

1.3 腸道酶活性檢測

稱取0.1 g腸組織放入1.5 mL離心管中, 離心管置于冰盒中, 按照重量(g)﹕體積(mL)=1﹕9的比例加入0.9 mL的生理鹽水, 冰水浴條件下進行機械勻漿,將所得到的組織勻漿液分裝保存于–20℃冰箱。腸組織的蛋白濃度(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性, 丙二醛(MDA)和脂質(zhì)過氧化物(LPO)的含量測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行操作。

1.4 腸道組織蘇木精-伊紅(HE)染色切片

用4%多聚甲醛對腸組織進行固定, 以防止細胞死亡后的自融或分解, 固定成功后進行流水沖洗,隨后使用不同濃度的酒精(75%、85%和95%)進行脫水處理, 再將組織放置在石蠟的透明劑二甲苯中透明, 將組織放入融蠟箱中保溫, 待石蠟完全浸沒組織塊進行包埋處理。接著對石蠟切片脫蠟水化,并進行蘇木素和伊紅染色。最后脫水封片, 并將切片置于顯微鏡下觀察。

1.5 腸道組織TUNEL切片檢測

將保存在4%多聚甲醛溶液中的腸組織進行常規(guī)石蠟包埋并切片, 石蠟切片脫蠟至水: 依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-酒精Ⅰ5min-酒精Ⅱ 5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。切片稍甩干后滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織, 37℃溫箱孵育20min。將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次, 每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液, 顯微鏡下控制顯色時間。細胞核經(jīng)蘇木素著色變藍,DAB顯出來的陽性凋亡細胞核為棕黃色。

1.6 腸道組織細胞凋亡相關基因的時序表達分析

采用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測凋亡相關基因(bax、bcl-2、p53和caspase 9)mRNA的表達情況。首先從課題組測得的轉(zhuǎn)錄組序列中獲取相關基因序列, 使用Premier 5.0軟件設計基因特異性上下游引物, 如表 1所示, 其中β-actin為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應的反應體系為正、反向引物各1 μL,Mix 10 μL, ddH2O 4 μL, 模板cDNA 4 μL, 總體積為20 μL。使用2–ΔΔCt公式計算基因的相對表達量。

表1 引物列表Tab. 1 Description of primers used in this study

1.7 腸道微生物分析

對照組和低氧組的腸道組織在取材完畢后置于–80℃冰箱中保存, 送至武漢菲沙基因公司進行測序。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。通過質(zhì)量初篩的原始序列按照Index和Barcode信息, 進行文庫和樣本劃分, 去噪或OTU(Operational Taxonomic Units)聚類。根據(jù)ASV/OTU在不同樣本中的分布, 評估每個樣本的物種豐度、Alpha多樣性水平。根據(jù)高通量測序結果, 預測各樣本的菌群代謝功能, 找出差異通路, 并獲得特定通路的物種組成。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用One-way analysis進行方差檢驗, 分析同一時間點對照組和低氧組表達模式的數(shù)據(jù)采用t-test檢驗統(tǒng)計差異, 當P-value<0.05時認為差異顯著(標為*),結果用平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結果

2.1 低氧脅迫和恢復對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道氧化應激的影響

雜交黃顙魚在低氧脅迫和恢復下腸道組織中的4種酶活性和MDA、LPO變化見圖 1。SOD和LDH酶活性在低氧脅迫下顯著升高, 在H72達到最大, 恢復溶氧24h后仍與對照組有顯著差異(P<0.05); CAT和GSH-Px酶活在H24出現(xiàn)顯著差異(P<0.05), 恢復溶氧過程中酶活性下降, 在R24與對照組無顯著差異(P>0.05); 在低氧脅迫下MDA和LPO較對照組均顯著上升(P<0.05), 并在H72達到峰值, 恢復氧含量后逐漸下降, R24仍與對照組有顯差(P<0.05)。

圖1 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道氧化應激指標變化Fig. 1 Effects of index activities related to oxidative stress in the intestine of hybrid yellow catfish “Huangyou-1”

2.2 低氧脅迫和恢復對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道組織結構的影響

如圖 2所示, H0中雜交黃顙魚的腸道組織具有正常的形態(tài)結構, 單層柱狀上皮細胞排列有序, 固有層緊密纖長, 杯狀細胞飽滿。脅迫開始后低氧組出現(xiàn)不同程度的損傷, H24杯狀細胞腫脹, H48腸黏膜出現(xiàn)壞死并有空泡結構, H72腸道組織空泡數(shù)量增多, 絨毛侵蝕情況進一步加劇, 恢復溶氧24h后,低氧引起的腸道組織生理變化并未得到改善, 腸絨毛出現(xiàn)糜爛。

圖2 低氧脅迫和恢復下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道組織形態(tài)Fig. 2 Intestinal tissue morphology of of hybrid yellow catfish“Huangyou-1” under acute hypoxia and reoxygenation conditionsa. H0; b. H24; c. H48; d. H72; e. R24; C. 柱狀細胞; G. 杯狀細胞;SG. 杯狀細胞腫脹; V. 空泡; N. 黏膜層壞死; E. 腸絨毛糜爛a. H0; b. H24; c. H48; d. H72; e. R24; C. columnar cells; G. goblet cells; SG. swelling of goblet cells; V. vacuoles in the lamina propria;N. necrosis in the mucosal layer; E. erosion of villi

2.3 低氧脅迫和恢復對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道細胞凋亡的影響

腸道組織TUNEL檢測結果TUNEL切片的檢測結果顯示, 低氧脅迫開始時雜交黃顙魚腸道組織細胞凋亡現(xiàn)象較少, 而在低氧組中均檢測到不同程度的細胞凋亡(圖3)。進一步統(tǒng)計分析顯示(表2),低氧可顯著促進腸道組織發(fā)生凋亡, 隨著低氧時間的延長, 各處理組之間的凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.05);R24的細胞凋亡指數(shù)與H48無顯著差異(P>0.05)。

表2 腸道組織凋亡指數(shù)Tab. 2 Apoptosis index of intestinal tissue

圖3 腸道組織Tunel切片檢測結果Fig. 3 Results of intestinal Tunel detectiona. H0; b. H24; c. H48; d. H72; e. R2；黑色箭頭代表凋亡細胞a. H0; b. H24; c. H48; d. H72; e. R24. Black arrows mean apoptotic cells

低氧脅迫和恢復下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”bax、bcl-2、caspase9和p53基因的時序表達分析在低氧脅迫下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道中bax和p53基因的表達量顯著升高, 在H72達到峰值, 恢復溶氧后表達量下降。bcl-2基因的表達量在低氧脅迫下不斷降低, 恢復溶氧后表達量上升, R24仍與對照組差異顯著(P<0.05)。caspase9基因的表達量在低氧脅迫下顯著升高, 恢復溶氧后表達量降低,R24仍與對照組有顯著差異(P<0.05; 圖 4)。

圖4 低氧脅迫和恢復下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”的腸道組織凋亡相關基因的表達模式Fig. 4 Temporal expression of apoptosis-related genes in the intestinal of hybrid yellow catfish “Huangyou-1” under acute hypoxia and reoxygenation conditions

2.4 低氧脅迫和恢復對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道微生物的影響

腸道微生物組間差異分析通過序列比對和注釋, 選取每個處理組在門(Phylum)水平上占比較大的物種, 生成相對豐度柱形圖(圖5), 以便直觀查看各處理組在門水平上相對豐度較高的物種及其比例。雜交黃顙魚腸道菌群相對豐度較大的主要集中在變形菌門(Proteobacteria)、厚壁桿菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。H72中變形菌門豐度較對照組明顯下降(由32.53%下降到8.89%), 厚壁菌門和擬桿菌門則明顯增多(由19.56%增加到42.38%, 由11.25%增加到32.58%)。且在H72的處理組中, 除擬桿菌門外, 厚壁菌門占據(jù)絕對優(yōu)勢。恢復溶氧后腸道菌群數(shù)量進一步豐富和增加, 這也表明低氧脅迫對雜交黃顙魚腸道微生物的組成具有重要影響。

圖5 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”門水平上腸道微生物菌群組成Fig. 5 Composition of intestinal microbial at phylum level of hybrid yellow catfish “Huangyou-1”

對各處理組的腸道微生物Alpha多樣性進行統(tǒng)計分析(圖6), 以Chao1和Observed species指數(shù)表征豐富度, 以Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性, 以Faith’s PD指數(shù)表征基于進化的多樣性, 以Pielou’s evenness指數(shù)表征均勻度, 以Good’s coverage指數(shù)表征覆蓋度。由圖6可知, Chao1和Observed species指數(shù)隨著低氧脅迫時間的延長而降低, R24 微生物菌群豐富度增加。Shannon指數(shù)在H48達到最低, R24指數(shù)有所增加, 同樣Simpson指數(shù)在R24較低氧組有所回升。Faith’s PD和Pielou’s evenness的指數(shù)均在H48達到最低。在低氧組中Good’s coverage指數(shù)較對照組均略微升高, 表明微生物的均勻度也進一步增加。

圖6 Alpha多樣性指數(shù)的分組箱線圖Fig. 6 Block boxplot of Alpha diversity index

低氧脅迫和恢復對腸道優(yōu)勢菌群變化的影響統(tǒng)計結果表明, 低氧脅迫影響了雜交黃顙魚腸道微生物菌群的變化, 具體體現(xiàn)在數(shù)量和種群豐富度上, 在屬水平上對優(yōu)勢群落的豐度進行統(tǒng)計(表3)。由表 3可知, 低氧造成厭氧致病菌的大量繁殖, 具體表現(xiàn)在葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和霍亂弧菌(Vibrio cholera)等致病菌數(shù)量的增加, 乳酸菌屬(Lactobacillus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等有益菌數(shù)量的減少。

表3 低氧脅迫下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道組織致病菌和益生菌的相對豐度Tab. 3 Relative abundance of pathogenic and probiotics bacteria in intestinal tissues of hybrid yellow catfish “Huangyou-1” under hypoxia stress (%)

腸道微生物功能預測基于腸道微生物測序結果對低氧脅迫下雜交黃顙魚的代謝通路進行統(tǒng)計和KEGG功能預測(圖7)。結果顯示, 腸道微生物在細胞進程(Cellular processes)、環(huán)境信息處理(Environmental information processing)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、人類疾病(Human diseases)、代謝(Metabolism)和生物體系統(tǒng)(Organismal systems)六大類代謝通路中均有分布,與代謝通路相關的微生物占大多數(shù), 與疾病相關的也占有一定比例。

圖7 腸道微生物的KEGG功能預測圖Fig. 7 KEGG function prediction of intestinal microbial

3 討論

3.1 低氧脅迫和恢復對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道氧化應激的影響

在魚類受到脅迫后, 體內(nèi)ROS含量會發(fā)生變化,尤其低氧脅迫導致的機體補償代謝加劇了氧化應激反應[23]。據(jù)報道, 當細胞中ROS的產(chǎn)生速率快于氧自由基的清除速率時, 生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)便會被激活[24], 如鯉[25]和青田田魚(Cyprinus carpio var qingtianensis)[26]的大腦和肝臟暴露在急性低氧下, LDH、SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著增加; 團頭魴幼體[27]在低氧脅迫過程中血清中

LDH和肝臟中GSH-Px、MDA含量均顯著增加。在本研究中發(fā)現(xiàn), 雜交黃顙魚在低氧脅迫下腸道組織的SOD、CAT和GSH-Px活性水平較對照組均顯著上升, 表明低氧脅迫使得雜交黃顙魚腸道內(nèi)抗氧化防御功能被激活, 以應對機體產(chǎn)生過量ROS引起的氧化損傷, 這與花鱸[28]的低氧脅迫研究結果一致。與對照組相比, LDH在低氧脅迫下顯著升高,表明雜交黃顙魚腸道中有氧利用得到限制導致ATP產(chǎn)生不足, 需通過無氧呼吸來彌補氧氣不足所帶來的機體能量供應緊缺, 這與李欣茹[9]對暗紋東方鲀在低氧脅迫下肝臟中LDH活力的研究結果相似。MDA和LPO被認為是反映生物體內(nèi)氧化應激水平的標志物[29], 兩者含量的變化能夠反映出機體和細胞的損傷程度。在本研究中發(fā)現(xiàn)MDA和LPO的含量在低氧脅迫下不斷升高, 表明雜交黃顙魚體內(nèi)的抗氧化物酶可能難以迅速清除大量脂質(zhì)過氧化物, 從而導致二者含量迅速增加, 類似結果在鯔幼魚(Mugil cephalus)[30]也有報道。

Lushchak等[31]認為魚類在低氧條件下可提高自身抗氧化能力, 從而為應對復氧后的再次氧化應激做準備, 在本研究中可以發(fā)現(xiàn)雜交黃顙魚的抗氧化防御系統(tǒng)在低氧24h就已全部啟動, 這也進一步印證了上述觀點。在恢復溶氧過程中抗氧化酶(SOD)、能量代謝酶(LDH)活性和氧化應激參數(shù)(MDA、LPO)含量略有下降, 但是較對照組仍有顯差, 表明氧化應激在氧氣恢復過程中也同樣存在, 這可能是由于氧濃度的恢復使細胞進行大量有氧呼吸產(chǎn)生過量ROS導致; 值得注意的是, CAT和GSH-Px的活性在恢復溶氧24h后與對照組并無顯著差異, 這可能是因為魚體內(nèi)的超氧自由基經(jīng)SOD先還原為過氧化氫, GSH-Px與CAT之間存在代償互補效應, 可以將過氧化氫轉(zhuǎn)化成水, 彼此之間削弱活性[32]。上述研究結果證實了低氧和恢復均會對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”造成氧化損傷, 而抗氧化防御系統(tǒng)的激活可以保護細胞并減少氧化應激對魚體帶來的損傷。

3.2 低氧脅迫和恢復對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道細胞凋亡和組織結構的影響

研究表明, 魚類在低氧下不僅會產(chǎn)生過量的ROS導致氧化應激反應, 還會引起細胞發(fā)生凋亡[33], 本研究采用TUNEL染色法對雜交黃顙魚腸道組織進行觀察, 結果顯示, 低氧脅迫加重了腸組織細胞的凋亡現(xiàn)象, 且隨著低氧時間的延長, 凋亡細胞數(shù)目也在增加, 與團頭魴[10]和鰱[16]的心肌細胞在低氧脅迫下的研究結果相似。

低氧脅迫下雜交黃顙魚腸道中caspase9基因的表達量較對照組顯著增加, 推測可能是細胞色素C通過凋亡小體來激活下游的Caspase家族,caspase9的激活使胞膜內(nèi)陷, 通過促使胞內(nèi)蛋白降解,誘導細胞發(fā)生凋亡[34]。p53是一種腫瘤抑制基因,在本研究中p53的表達量在低氧脅迫下不斷增加,并在H72達到最高, 表明p53在低氧條件下對細胞凋亡信號具有一定的促進作用。有研究認為,bcl-2和bax是魚類細胞凋亡過程中起著關鍵調(diào)控作用的兩個基因, 二者的比值在一定程度上決定了細胞的發(fā)展方向[35]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn), 雜交黃顙魚腸道中bax和bcl-2的表達量隨著低氧時間的延長分別上升和下降,bcl-2/bax的值逐漸減小, 顯著促進了腸道細胞的凋亡?；謴腿苎鹾骲ax的表達量減少, 而bcl-2的表達量增加, 這可能是由于在細胞中形成了穩(wěn)定的bcl-2/bax異源二聚體, “中和”了bax/bax同源二聚體誘導細胞凋亡的作用[36]。此外, 恢復溶氧24h后bax、bcl-2和caspase9的表達量與對照組仍有顯著差異, 這可能是因為恢復過程中氧氣的重新導入會使得魚體產(chǎn)生氧化應激現(xiàn)象, 而這種氧化應激程度過強時, 機體同樣會自發(fā)啟動細胞凋亡程序。

研究報道, 高溫[37]、攝食[38]和細菌感染[39]等常常引起魚類腸上皮組織和細胞結構發(fā)生功能性變化, 在本研究中我們通過HE染色切片觀察發(fā)現(xiàn), 低氧脅迫下雜交黃顙魚腸道組織中的杯狀細胞數(shù)量顯著減少、空泡數(shù)量增多, 且隨著低氧時間的延長,腸絨毛排列雜亂, 出現(xiàn)糜爛現(xiàn)象, 在恢復溶氧后, 低氧引起的腸道組織生理變化并未得到改善; 表明低氧亦可改變雜交黃顙魚腸道正常的組織形態(tài), 此結果與大口黑鱸(Micropterus salmoides)[40]和日本沼蝦[41]的低氧脅迫研究結果一致。

3.3 低氧脅迫和恢復對雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道微生物的影響

腸道是魚類體內(nèi)重要的消化吸收器官, 生存著結構復雜且數(shù)量龐大的微生物菌群, 這些微生物菌群不僅與其營養(yǎng)代謝、免疫防御和能量傳遞有著密切聯(lián)系, 還在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用, 它們與宿主的健康生長息息相關[42]。有研究認為, 放線菌的豐度代表著腸道的健康狀況, 放線菌豐度越高說明腸道健康狀況越好[43], 在H72的處理組中放線菌的數(shù)量顯著低于對照組, 并且通過HE切片也可觀察出H72中的腸道組織受損嚴重, 這也進一步印證了上述觀點。腸道微生物豐度柱形圖顯示雜交黃顙魚腸道核心菌群是變形菌門, 此結論印證了Harris[44]提出的水生動物存在固有的腸道微生物群落的觀點。此外, 在門水平上腸道菌群組成差異較大, 說明低氧影響了雜交黃顙魚腸道菌群的數(shù)量和結構。通過Alpha多樣性分組箱線圖, 我們發(fā)現(xiàn)在低氧脅迫過程中, 雜交黃顙魚腸道中的Shannon和Simpson指數(shù)較對照組下降, 也說明了其微生物豐富度隨著低氧時間的延長而降低。

水生動物在不同的水體環(huán)境下會產(chǎn)生應激反應, 進而使腸道內(nèi)環(huán)境平衡受到?jīng)_擊, 宿主的正常防御系統(tǒng)被破壞, 致病菌會轉(zhuǎn)移、定植甚至侵襲魚體組織器官[45]。Suo等[46]對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)研究發(fā)現(xiàn), 長期暴露在亞致死濃度的硫化物水體中, 腸道組織結構受損, 梭桿菌數(shù)量顯著增多。Kan等[47]發(fā)現(xiàn)五氯苯酚脅迫使得金魚(Carassius auratus)腸道內(nèi)大量積累這種物質(zhì), 導致其腸道內(nèi)菌群數(shù)量發(fā)生改變。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)隨著低氧時間的延長一些厭氧菌得到大量繁殖, 其中不乏有致病菌(葡萄球菌、鏈球菌)的侵入及益生菌群(乳酸菌、雙歧桿菌)數(shù)量的降低, 這與日本沼蝦[19]和瓦氏黃顙魚[21]的研究結果一致。通過繪制低氧脅迫下樣本的KEGG功能預測圖, 發(fā)現(xiàn)腸道微生物主營代謝功能, 但是在細胞進程和生物體系統(tǒng)等方面同樣發(fā)揮著獨特的功能, 值得注意的是, 在本次功能預測中, 與疾病相關的微生物也占有一定比例,說明低氧脅迫下雜交黃顙魚的免疫防御系統(tǒng)會遭到損害, 從側(cè)面揭示了低氧、腸道微生物和宿主免疫之間的復雜關系。

4 結論

綜上所述, 低氧和恢復會誘導雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)、能量相關酶(LDH)活性和應激指標(MDA和LPO)含量顯著升高, 凋亡指數(shù)及凋亡相關基因(bax、p53和caspase9)表達量顯著升高,bcl-2基因的表達量則減少, 表明隨著低氧時間的延長, 雜交黃顙魚的腸道氧化應激損傷逐漸加大, 恢復溶氧后這種現(xiàn)象仍然存在, 這可能是腸道產(chǎn)生細胞凋亡的誘因之一。此外, 隨著低氧時間的延長, 黏膜層壞死、空泡和絨毛侵蝕等腸道組織結構受損現(xiàn)象逐漸加劇, 葡萄球菌和鏈球菌等厭氧菌數(shù)量增多, 使腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞, 進而影響腸道功能。本研究結果為闡明低氧和恢復下雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”腸道組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)控機制提供理論依據(jù)。