武文一 吉 紅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 楊凌 712100)

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中, 越冬饑餓對(duì)于魚(yú)類(lèi)而言是一個(gè)自然存在的重大挑戰(zhàn), 其實(shí)質(zhì)是長(zhǎng)期的不進(jìn)食和低溫的雙重脅迫[1]。為了應(yīng)對(duì)季節(jié)變化、產(chǎn)卵遷徙、繁殖及惡劣環(huán)境條件造成的饑餓挑戰(zhàn), 魚(yú)類(lèi)進(jìn)化出了一套精準(zhǔn)的內(nèi)環(huán)境系統(tǒng), 包括激素的分泌,與能量平衡維持相關(guān)的基因的表達(dá)及相對(duì)應(yīng)酶的產(chǎn)生[2]。有研究指出, 饑餓對(duì)魚(yú)體的形態(tài)學(xué)指標(biāo)、機(jī)體組成成分、血清生化參數(shù)、能量利用、生理調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)乃至相關(guān)代謝酶的調(diào)節(jié)等方面會(huì)產(chǎn)生顯著的影響[3]。也有學(xué)者開(kāi)展了常溫情況下草魚(yú)機(jī)體蛋白質(zhì)和脂肪對(duì)饑餓脅迫(<60d)的響應(yīng)的研究[4], 但是對(duì)于草魚(yú)越冬饑餓脅迫(>16周)下, 機(jī)體糖類(lèi)、脂類(lèi)和蛋白代謝對(duì)越冬饑餓脅迫響應(yīng)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

多條中間代謝途徑參與了魚(yú)體儲(chǔ)存能量物質(zhì)在饑餓期間動(dòng)員的過(guò)程[5]。一些研究評(píng)估了魚(yú)類(lèi)機(jī)體血清代謝物, 如葡萄糖、游離脂肪酸和甘油三酯等含量, 進(jìn)而推斷機(jī)體適應(yīng)饑餓的生理生化進(jìn)程[6]。研究發(fā)現(xiàn), 在饑餓期間不同物種血漿代謝物水平的變化是不同的, 如西伯利亞鱘(Acipenser baerii)饑餓期間血糖水平下降[7], 而真鯛(Pagrus major)饑餓期間的血糖水平保持穩(wěn)定[8]。饑餓導(dǎo)致大西洋鱈(Gadus morhua)血漿游離脂肪酸顯著減少[9], 大口黑鱸(Dicentrarchus labrax)血漿游離脂肪酸則顯著增加[10]。這些血漿代謝物譜的差異可能與魚(yú)類(lèi)種類(lèi)、年齡、身體狀況和饑餓持續(xù)時(shí)間有關(guān)。

饑餓會(huì)動(dòng)員魚(yú)體儲(chǔ)存的能量物質(zhì), 如糖原、脂肪和蛋白[11]。據(jù)報(bào)道, 在饑餓的最初階段, 許多魚(yú)類(lèi)的肝糖原大量減少, 但大多數(shù)魚(yú)類(lèi)的肝糖原沉積并沒(méi)有完全耗盡, 表明存在一種使機(jī)體保持一定量的糖原以備動(dòng)員的保護(hù)策略[12], 這一策略可能與來(lái)自氨基酸和甘油的生糖作用維持肝糖異生有關(guān)。相對(duì)于肝糖原, 肌糖原在肌肉中含量較少, 在饑餓過(guò)程中甚至可以消耗殆盡[13]。脂質(zhì)是一種重要的能量來(lái)源, 在魚(yú)體內(nèi)有大量累積[14]。饑餓期間, 一般只有當(dāng)糖原和脂質(zhì)幾乎耗盡時(shí), 蛋白質(zhì)才會(huì)被動(dòng)員起來(lái)。但是有些魚(yú)類(lèi)在饑餓期間一直利用脂肪作為主要能量物質(zhì)來(lái)源, 而有些魚(yú)類(lèi)在饑餓期間最初動(dòng)員肌肉蛋白質(zhì)而后動(dòng)員脂肪[15]。魚(yú)類(lèi)在饑餓期間利用其能量?jī)?chǔ)備(如糖原、脂肪和蛋白質(zhì))的策略可能與物種特異性有關(guān)。越冬饑餓期間, 草魚(yú)機(jī)體能量平衡受到重大挑戰(zhàn), 作為細(xì)胞“能量傳感器”,AMP活化蛋白激酶(AMPK)可以感知能量狀態(tài), 并根據(jù)代謝需要調(diào)節(jié)代謝途徑[16]。前期研究表明, 饑餓能夠改變機(jī)體能量狀態(tài)從而激活A(yù)MPK[17]。越冬饑餓期間, AMPK不同亞型的轉(zhuǎn)錄水平也有著不同的變化趨勢(shì)。這說(shuō)明AMPK在越冬饑餓過(guò)程中通過(guò)激活下游代謝途徑起著核心調(diào)節(jié)作用, 但AMPK是具體如何激活和調(diào)整下游糖脂蛋白代謝相關(guān)基因的分子反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄水平層面上研究依然欠缺報(bào)道。

草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)作為我國(guó)主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)淡水魚(yú)之一, 其產(chǎn)量居2019年中國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量榜首, 達(dá)553.3×107kg[18]。草魚(yú)在養(yǎng)殖過(guò)程中周期性經(jīng)歷越冬饑餓脅迫, 在我國(guó)的北方地區(qū)尤其如此。以往的研究多針對(duì)草魚(yú)常溫饑餓期間生理生化狀態(tài)進(jìn)行探討, 而越冬饑餓期間草魚(yú)的相關(guān)研究尚未報(bào)道。鑒于此, 為探討草魚(yú)應(yīng)對(duì)0、1、2、4、8、12和16周的越冬饑餓脅迫, 測(cè)定了肌肉常規(guī)成分、血清能量代謝物、組織糖原、甘油三酯含量及AMPK通路下糖脂蛋白代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平, 旨在為闡明越冬饑餓期間草魚(yú)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的潛在機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚(yú)取自西北農(nóng)林科技大學(xué)安康水產(chǎn)試驗(yàn)示范站室外培育池塘, 選擇同一批次養(yǎng)成的商品規(guī)格魚(yú), 挑選大小整齊和健壯的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,實(shí)驗(yàn)魚(yú)體重(1053.33±16.11) g。同時(shí)在室外培育水泥池中馴化2周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn), 馴化期間每日正常投喂商品飼料(粗蛋白28%和粗脂肪6%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件和方法

實(shí)驗(yàn)在室外培育水泥池中進(jìn)行(4 m×4 m×1 m),選取8個(gè)實(shí)驗(yàn)池, 中間用隔網(wǎng)隔開(kāi), 上面架設(shè)遮陽(yáng)網(wǎng),水深控制0.50 m左右, 水容量8 m3左右。經(jīng)過(guò)2周投飼馴化后, 停食1d進(jìn)行分組; 隨機(jī)分為7組, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)15尾魚(yú)。當(dāng)水溫自然下降到草魚(yú)停止攝食(水溫15℃)時(shí), 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始, 實(shí)驗(yàn)期間水溫最低為4℃, 當(dāng)水溫自然升高到草魚(yú)開(kāi)始重新覓食(水溫15℃)時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束, 時(shí)間從2017年11月10日至2018年3月3日, 此過(guò)程即為越冬饑餓期。溫度變化見(jiàn)圖 1。實(shí)驗(yàn)共計(jì)7組, 分別為饑餓0(week 0)、1(week 1)、2(week 2)、4(week 4)、8(week 8)、12(week 12)和16周(week 16)。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣后井水, 流水環(huán)境, 每2周清污。每日監(jiān)測(cè)水溫和水質(zhì),并觀察實(shí)驗(yàn)魚(yú)體健康狀況和死亡狀況。實(shí)驗(yàn)用水pH 7.8—8.2, 溶解氧5—6 mg/L, 氨氮<0.1 mg/L, 亞硝酸鹽<0.01 mg/L, 硫化物<0.05 mg/L。

圖1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水溫的變化Fig. 1 The water temperatures during the experiment倒三角為越冬饑餓期間采樣時(shí)間點(diǎn)The inverted triangles are the sampling times during overwinter starvation

1.3 樣品采集

采樣程序經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)批準(zhǔn), 按照動(dòng)物福利和道德規(guī)范執(zhí)行。在各實(shí)驗(yàn)組饑餓處理結(jié)束時(shí), 所有魚(yú)用50 mg/L MS222麻醉后再對(duì)其進(jìn)行取樣。每個(gè)平行隨機(jī)抽取2尾魚(yú)尾靜脈采血, 4℃冰箱靜置2h, 4℃離心(3000 r/min,15min), 上層澄清透明淡黃色血清速凍于液氮中, 而后轉(zhuǎn)入?80℃冰箱保存, 用作血清代謝物含量指標(biāo)測(cè)定; 每個(gè)平行隨機(jī)抽取2尾魚(yú)在冰盤(pán)上解剖取內(nèi)臟團(tuán), 取部分肝胰臟、肌肉和腹腔脂肪組織速凍于液氮中, 后轉(zhuǎn)?80℃冰箱保存。隨后, 在上述分離組織中, 取背部?jī)蓚?cè)背鰭后肌肉, 去皮、切除紅肌后, 在?20℃冰箱保存, 用作肌肉常規(guī)成分組成分析。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

肌肉常規(guī)成分測(cè)定包括水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分, 采用AOAC(1995)方法[19]。肌肉水分采用冷凍干燥法測(cè)定, 粗蛋白質(zhì)的測(cè)定為凱氏定氮法, 粗脂肪采用索氏抽提法, 灰分采用馬福爐灰化法。

肝胰臟和肌肉中糖原(Glycogen)含量使用南京建成生物工程研究所試劑盒(貨號(hào)A043)測(cè)定, 蛋白質(zhì)濃度使用考馬斯亮藍(lán)染色法試劑盒(貨號(hào)A045)進(jìn)行測(cè)定。肝胰臟、肌肉、脂肪組織和血清中甘油三酯(TG)含量使用北京普利萊基因技術(shù)有限公司試劑盒(貨號(hào)E1013)進(jìn)行測(cè)定。血清中甘油(Glycerol)含量使用北京普利萊基因技術(shù)有限公司試劑盒(貨號(hào)E1002)進(jìn)行測(cè)定, 游離脂肪酸(Free fatty acids)和葡萄糖(Glucose)使用南京建成生物工程研究所試劑盒(貨號(hào)A042, 酶法; 貨號(hào): F006-1-1)測(cè)定。血清中的魚(yú)三磷酸腺苷(ATP)、魚(yú)二磷酸腺苷(ADP)和魚(yú)一磷酸腺苷(AMP)含量采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海滬峰化工有限公司, 上海市, 中國(guó))進(jìn)行測(cè)定(試劑盒的貨號(hào)分別是F3805-A, F3808-A和F3806-A)。

1.5 定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

實(shí)驗(yàn)所需引物序列及Gene Bank序列號(hào)見(jiàn)表 1。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū), 用RNAiso Plus(TaKaRa,Dalian, China)從草魚(yú)的肝胰臟、肌肉和脂肪組織中提取總RNA, 并用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)(NanoDrop 1000, Thermo Scientific, Wilmington,USA)在260和280 nm處測(cè)定RNA完整性。提取純化的總RNA經(jīng)無(wú)RNase和DNase處理, 以防止基因組DNA擴(kuò)增。使用PrimeScript??RT 試劑盒(TaKaRa, Dalian, China)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR采用CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules, CA, USA)。每20 μL反應(yīng)含有10 μL 2×SYBR?Premix ExTaq? Ⅱ (TaKaRa, Dalian,China), 7.8 μL滅菌雙蒸餾水(ddH2O), 1 μL 1﹕10稀釋cDNA, 10 mmol/L濃度的正向和反向引物0.6 μL。RT-qPCR程序包括95℃下3min的初始激活步驟, 隨后38個(gè)95℃ 15s反應(yīng)、60℃下30s反應(yīng)和65℃下5s反應(yīng)的循環(huán)。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)參基因。PCR后, 通過(guò)熔融曲線分析證實(shí)了這些反應(yīng)產(chǎn)生的單一產(chǎn)物。如前所述, 根據(jù)公式Ct法(2–??Ct)用于計(jì)算基因表達(dá)值[20]。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab. 1 Real time quantitative PCR primer sequence

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(19.0版, Chicago, IL, USA)的單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的方式表示。P<0.05為差異顯著。柱狀圖采用Prism 7 軟件(Graph Pad Software Inc., San Diego, USA)進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同越冬饑餓時(shí)間對(duì)草魚(yú)肌肉常規(guī)成分的影響

不同越冬饑餓時(shí)間對(duì)草魚(yú)肌肉常規(guī)成分的影響見(jiàn)表 2。肌肉中水分和粗灰分含量隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05), 粗蛋白含量在越冬饑餓1周后顯著降低(P<0.05), 越冬饑餓1周時(shí)肌肉粗脂肪含量顯著上升(P<0.05), 隨后顯著下降(P<0.05)。

表2 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)肌肉常規(guī)成分的影響(%)Tab. 2 Effects of different overwinter starvation treatment on the proximate composition in the muscle of grass carp (%)

2.2 不同越冬饑餓時(shí)間對(duì)草魚(yú)血清代謝物含量變化的影響

如圖 2所示, 所有越冬饑餓處理組血清中葡萄糖含量隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低(P<0.05), 膽固醇含量在越冬饑餓第12周顯著降低(P<0.05), 血清蛋白在第4周開(kāi)始顯著降低后(P<0.05), 隨著越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng), 交替顯著上升后下降再上升至第16周。血清中甘油三酯和甘油含量隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低(P<0.05), 血清游離脂肪酸含量在第2周顯著升高后隨即顯著降低(P<0.05)。

圖2 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)血清代謝物含量變化的影響Fig. 2 Effects of different overwinter starvation treatments on metabolite levels content in serum of grass carp

2.3 不同越冬饑餓時(shí)間對(duì)草魚(yú)組織中糖原及TG含量變化的影響

如圖 3所示, 肝胰臟中糖原含量隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低(P<0.05), 而肌肉中糖原在越冬饑餓第2周顯著降低后(P<0.05)隨即到8—16周顯著升高, 與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。肝胰臟中甘油三酯含量在越冬饑餓4周后顯著下降(P<0.05), 在第12周含量最低; 腹腔脂肪組織甘油三酯含量在越冬饑餓1周后顯著下降(P<0.05), 第2周開(kāi)始甘油三酯含量無(wú)顯著差異變化(P>0.05); 而肌肉甘油三酯含量在越冬饑餓1周顯著上升而后顯著下降(P<0.05)。

圖3 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)各組織中糖原和TG含量變化的影響Fig. 3 Effects of different overwinter starvation treatments on glycogen and TG contents in tissues of grass carp

2.4 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)血清中能量分子含量的影響

如圖 4所示, 草魚(yú)血清中ATP含量隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低(P<0.05), ADP和AMP含量隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升而后下降(P<0.05), ADP+AMP/ATP比值隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05)后在第12周后顯著下降(P<0.05)。

圖4 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)血清中ATP、ADP、AMP含量和ADP+AMP/ATP比值的影響Fig. 4 Effects of different overwinter starvation treatments on ATP,ADP, AMP content and ADP+AMP/ATP in serum of grass carp

2.5 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)各組織中ampk α基因表達(dá)量的影響

如圖 5所示, 肝胰臟中ampk α1及ampk α2轉(zhuǎn)錄水平在越冬饑餓第1周最高, 顯著高于其他越冬饑餓處理組(P<0.05); 肌肉中ampk α1及ampk α2轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高(P<0.05), 脂肪組織中ampk α1及ampk α2轉(zhuǎn)錄水平第4周最高, 顯著高于其他越冬饑餓處理組(P<0.05)。

圖5 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)各組織中ampk α基因表達(dá)量的影響Fig. 5 Effects of different overwinter starvation treatments on ampk α gene expressions in tissues of grass carp

2.6 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)肝胰臟脂代謝和糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖 6所示, 脂肪分解基因atgl、hsl和cpt1α在越冬饑餓處理第1周和第2周轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組及其他處理組(P<0.05), 脂肪合成基因acc和fas轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05); 脂肪酸膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cd36基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05); 糖代謝核轉(zhuǎn)錄因子creb、foxo1和pgc1α轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05); 糖異生基因pepck和g6pase轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05); 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白glut2基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05); 糖酵解基因gk、pfk和pk轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升, 均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖6 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)肝胰臟脂代謝和糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of different overwinter starvation treatments on lipid and glucose related gene expressions in hepatopancreas of grass carp

2.7 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)肌肉脂代謝、糖代謝和蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖 7所示, 草魚(yú)肌肉脂代謝基因atgl、hsl、cpt1α和cd36轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05), 而acc和fas轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05); 糖代謝核轉(zhuǎn)錄因子creb、foxo1和pgc1α轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05); 糖異生基因pepck和g6pase轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05); 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白glut2基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05); 肌肉中蛋白代謝相關(guān)基因中,gldh基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05), 而igf-1、s6k和tor基因轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05)。

圖7 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)肌肉脂代謝、糖代謝和蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 7 Effects of different overwinter starvation treatmens on lipid, glucose and protein related gene expressions in muscle of grass carp

2.8 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)脂肪組織脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖 8所示, 草魚(yú)脂肪組織脂代謝基因atgl、hsl、cpt1α和cd36轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05), 而acc和fas轉(zhuǎn)錄水平隨越冬饑餓時(shí)間延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05)。

圖8 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)脂肪組織脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 8 Effects of different overwinter starvation treatments on lipid related gene expressions in adipose tissue of grass carp

3 討論

3.1 不同越冬饑餓時(shí)間對(duì)草魚(yú)肌肉常規(guī)成分和血清代謝物含量的影響

魚(yú)類(lèi)在自然界生長(zhǎng)過(guò)程中, 經(jīng)常面臨饑餓這一種自然生理脅迫[21]。在饑餓脅迫下, 魚(yú)體僅能依靠自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗來(lái)維持機(jī)體能量代謝平衡[22]。本研究表明, 隨著越冬饑餓時(shí)間的增長(zhǎng), 肌肉中粗蛋白和粗灰分含量在第1周后顯著下降, 這是因?yàn)闄C(jī)體蛋白質(zhì)的動(dòng)員與礦物元素的動(dòng)員有直接關(guān)系[23];肌肉水分呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 可能與越冬饑餓效應(yīng)有關(guān),因?yàn)樗值纳仙彩悄芰縿?dòng)員的前提條件[24]; 肌肉粗脂肪含量在越冬饑餓第1周達(dá)到最高, 隨后降低。同時(shí)也觀察到肌肉中TG有類(lèi)似的趨勢(shì), 肌肉TG含量在越冬饑餓第1周達(dá)到最高, 這可能因?yàn)門(mén)G累積在肌肉中貯存為脂質(zhì)的原因[25]。有研究報(bào)道, 常溫饑餓14d草魚(yú)稚魚(yú)肌肉TG含量持續(xù)顯著下降, 與本研究結(jié)果不同的是并未在饑餓第1周達(dá)到最高值而后下降, 這可能與實(shí)驗(yàn)魚(yú)規(guī)格或者溫度變化不一致造成, 而且草魚(yú)稚魚(yú)可能缺乏能從別處調(diào)動(dòng)的脂肪進(jìn)入肌肉[8]。血清中的甘油和游離脂肪酸是TG分解產(chǎn)物, 隨著越冬饑餓時(shí)間的增長(zhǎng), 血清中TG的含量降低, 甘油和游離脂肪酸的含量也隨著顯著下降; 血清TP含量降低表明肝胰臟中蛋白質(zhì)分解和氨基酸代謝的增強(qiáng); GLU含量隨著越冬饑餓時(shí)間增長(zhǎng)顯著降低, 但未消失, 這可能是肝胰臟和肌肉一直維持糖原合成的重要表現(xiàn)[26], 本研究顯示肝胰臟和肌肉糖原含量顯著下降后呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài), 表明了這一觀點(diǎn), 這與其他作者研究結(jié)果類(lèi)似[10,27]。上述結(jié)果表明越冬饑餓1周內(nèi)草魚(yú)體內(nèi)可能發(fā)生肝胰臟和脂肪組織脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而增加了肌肉脂質(zhì)含量, 同時(shí)發(fā)現(xiàn)草魚(yú)越冬饑餓階段, 最先動(dòng)用的能量物質(zhì)是肌肉糖原, 其次才是肝糖原, 而對(duì)脂肪的動(dòng)員從第1周就開(kāi)始直到越冬饑餓結(jié)束, 但是具有一定的組織特異性, 優(yōu)先度分別是脂肪組織、肌肉和肝胰臟。肌肉蛋白在越冬饑餓第1周就開(kāi)始顯著下降, 與血清TP變化趨勢(shì)一致。這表明草魚(yú)肌肉蛋白在越冬饑餓第一周就進(jìn)行了動(dòng)員, 這與前人研究結(jié)果一致[4]。

葡萄糖是許多組織的必需能源物質(zhì)[28], 因此,草魚(yú)在饑餓期間必須維持血糖穩(wěn)態(tài)。饑餓脅迫下的血糖水平變化很大。越冬饑餓7d后, 草魚(yú)的血糖水平顯著下降, 結(jié)果與大口黑鱸(Dicentrarchus labrax)變化一致[29], 這是由于在能量匱乏期間葡萄糖動(dòng)員進(jìn)行了供能。此外, 為了在長(zhǎng)期饑餓期間滿足代謝要求并保持穩(wěn)定的葡萄糖水平, 還可能激活糖原分解或從頭合成葡萄糖(糖異生)[30]。糖原作為維持饑餓期間血糖的來(lái)源具有物種特異性[28,31—33]。在本研究中, 肌糖原首先被動(dòng)員, 越冬饑餓第4周肝糖原才被動(dòng)員, 這表明, 草魚(yú)在越冬饑餓期間, 肌糖原首先被用作維持葡萄糖水平, 這與大多數(shù)魚(yú)類(lèi)類(lèi)似[7]。肝糖原在饑餓期是保守的, 在越冬饑餓第4周才觀察到顯著的下降, 這意味著肝胰臟中的糖原消耗比肌肉中的糖原少, 盡管肝糖原含量要遠(yuǎn)高于肌糖原。但是在越冬饑餓第8周之后, 肌糖原出現(xiàn)緩慢回升直到正常水平, 肝糖原含量則一直下降, 表明肌糖原作為草魚(yú)越冬饑餓期間主要供能物質(zhì)作用要強(qiáng)于肝糖原。因此, 草魚(yú)的肝胰臟和肌肉對(duì)越冬饑餓的反應(yīng)策略是不同的。脂肪作為能量密度最高的能源物質(zhì)[31], 在魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)期饑餓過(guò)程中, 起主要供能作用[3]。本研究表明在越冬饑餓期間, 脂肪組織首先動(dòng)員, 其次是肌肉和肝胰臟, 而作為機(jī)體重要的運(yùn)動(dòng)器官, 肌肉在越冬饑餓第1周粗脂肪含量和TG含量顯著上升, 表明肌肉是機(jī)體消耗能源的主要部位[34]。肝胰臟中TG含量在越冬饑餓第4周變化趨勢(shì)與肝糖原一致, 表明作為機(jī)體能量動(dòng)員中轉(zhuǎn)站, 也在發(fā)揮著維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)作用。血清中TG和TCHO含量, 與魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)狀況密切相關(guān)[35], 其代謝產(chǎn)物如甘油、游離脂肪酸和脂蛋白的含量通常被用來(lái)推斷饑餓期間的脂質(zhì)動(dòng)員。隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng), 血清中TP和TG含量顯著下降, 甘油和游離脂肪酸含量顯著上升, 表明脂質(zhì)動(dòng)員水平在持續(xù)運(yùn)行中。

3.2 不同越冬饑餓時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)各組織中AMPK α基因及其下游相關(guān)脂代謝、糖代謝和蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

本團(tuán)隊(duì)前期研究表明, 越冬饑餓會(huì)顯著改變草魚(yú)機(jī)體肝胰臟、肌肉和脂肪組織ampk的表達(dá)水平[36]。為了闡明其在越冬饑餓期間能量調(diào)控潛在機(jī)制, 本研究系統(tǒng)地分析了血清及肝胰臟、肌肉、脂肪組織代謝產(chǎn)物的同時(shí), 對(duì)ampk基因及其相關(guān)聯(lián)的參與中間代謝反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄水平也進(jìn)行了檢測(cè), 圖 9對(duì)上述轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果進(jìn)行了過(guò)程示意。隨著越冬饑餓時(shí)間的延長(zhǎng), 血清中ADP+AMP/ATP比值顯著上升, 肝胰臟、肌肉和脂肪組織ampk的表達(dá)水平均表現(xiàn)了上升的趨勢(shì), 隨后變化不一, 表明越冬饑餓激活了ampk基因表達(dá)[37—39]。在肝胰臟和肌肉中,隨著越冬饑餓的進(jìn)行,ampk基因激活糖酵解相關(guān)基因pfk, 同時(shí)加速了gk和pk的轉(zhuǎn)錄水平的提高, 促進(jìn)了糖酵解[40]。在肝胰臟和脂肪組織中,ampk基因可直接磷酸化并促進(jìn)atgl基因表達(dá)[41], 進(jìn)而促進(jìn)脂解,加速下游脂解基因hsl的表達(dá), 同時(shí)磷酸化并促進(jìn)acc基因表達(dá), 抑制其活性[42], 降低了乙酰CoA轉(zhuǎn)變成丙酰CoA, 間接降低了丙酰CoA對(duì)cpt-1α基因表達(dá)的抑制, 加速了脂肪酸的β-氧化[43,44], 同時(shí)抑制acc下游基因fas的表達(dá), 降低脂質(zhì)合成[45]。ampk還能夠直接激活cd36的表達(dá)水平[46], 促進(jìn)胞外游離脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[47], 進(jìn)而促進(jìn)了脂肪酸的β-氧化。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(creb), 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(pgc-1α), 叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(foxo1)是ampk調(diào)控糖異生關(guān)鍵限速酶g6pase和pepck的重要轉(zhuǎn)錄因子,ampk經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白2降低creb的轉(zhuǎn)錄水平, 同時(shí)降低pgc-1α和foxo1的表達(dá), 進(jìn)而降低g6pase和pepck的生成, 降低糖異生。同時(shí),ampk對(duì)抑制glut2的表達(dá)也有報(bào)道[48], 進(jìn)一步降低糖異生的發(fā)生。在肌肉中, 激活的ampk可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分解, 維持機(jī)體能量代謝平衡。ampk與tor之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系,ampk基因表達(dá)水平提高后抑制tor表達(dá), 進(jìn)而抑制s6k表達(dá), 降低蛋白質(zhì)合成, 這與前人報(bào)道相類(lèi)似[49]。然而, 以上結(jié)果僅僅依賴(lài)于基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)是具有局限性的。這些基因最終的功能需要轉(zhuǎn)錄翻譯后并進(jìn)行重要修飾, 因此與AMPK通路相關(guān)的糖脂蛋白代謝基因的功能需要進(jìn)一步的研究。

圖9 越冬饑餓處理下草魚(yú)能量代謝示意圖: 基于AMPK及其下游通路相關(guān)基因Fig. 9 Energy metabolism of grass carp under overwintering starvation treatment: based on the AMPK and its downstream pathway related genes乙酰輔酶A. Acetyl-CoA; 丙二酰輔酶A. Malonyl-CoA; 脂肪酸. FA; 三酰基甘油酯. TAG; 二?；视王? DAG; 單酰基甘油酯. MG; 葡萄糖. Glucose; 丙酮酸. Pyroracemic acid; 草酰乙酸. Oxaloacetate; 磷酸烯醇丙酮酸. Phosphoenolpyruvate; 葡萄糖-6-磷酸. Glucose-6-phosphate; 甘油. Glycerol; 脂質(zhì)攝取. Lipid uptake; 脂肪酸β-氧化. Fatty acids β-oxidation; 糖酵解. Glycolysis; 糖異生. Gluconeogenesis;蛋白質(zhì)降解, Protein degradation

4 結(jié)論

綜上所述, 越冬饑餓對(duì)草魚(yú)的糖、脂、蛋白代謝有顯著影響。肌糖原和肝糖原的持續(xù)消耗, 及糖酵解和糖異生的相互運(yùn)行, 有助于維持草魚(yú)在越冬饑餓期間的血糖水平; 通過(guò)促進(jìn)脂肪、蛋白質(zhì)分解和脂肪酸β-氧化過(guò)程, 及抑制脂肪酸合成來(lái)維持能量平衡。此外, 草魚(yú)在動(dòng)員能量方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)先次序、敏感性和組織特異性。其中, 通過(guò)激活A(yù)MPK通路及促進(jìn)或抑制其下游相關(guān)基因表達(dá), 增強(qiáng)能量供應(yīng)降低能量消耗, 促使越冬饑餓期間機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)的維持。本研究提供的信息可用于制定有效的草魚(yú)越冬前后投喂策略, 針對(duì)草魚(yú)期間能量物質(zhì)代謝情況, 可在越冬前后投喂飼料中適當(dāng)調(diào)整脂肪作為最重要的供能物質(zhì), 同時(shí)推動(dòng)草魚(yú)在越冬養(yǎng)殖期間管理者做出更加適當(dāng)?shù)臎Q策, 以期改善草魚(yú)越冬前后的存生產(chǎn)效率。