羅輝,孫恒昌（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院,廣東 廣州 510630）

骨肉瘤（Osteosarcoma）是兒童和青少年最常見(jiàn)的原發(fā)性的惡性骨腫瘤[1-2]。盡管骨肉瘤的治療方法如化療、新輔助化療、放療及免疫治療等取得長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是骨肉瘤患者的5年生存率依然處在較低水平。主要是由于大部分骨肉瘤會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]，有隨訪數(shù)據(jù)顯示，未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率約為70%，而發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率僅有30%[4]。骨肉瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制并不十分明確，且缺乏早期診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志。目前，其依然是青少年發(fā)生癌癥相關(guān)死亡的第二大因素。因此，對(duì)骨肉瘤患者預(yù)后進(jìn)行早期評(píng)估對(duì)骨肉瘤患者的預(yù)后以及治療顯得尤為重要。

鐵死亡（Ferroptosis）是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡形式之一，主要特點(diǎn)是鐵依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡[5]。研究證實(shí)鐵死亡參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性與腫瘤免疫等各個(gè)方面。Harris[6]等學(xué)者研究表明通過(guò)鐵死亡激活劑能夠促進(jìn)小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞的死亡。此外，也有越來(lái)越多的研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息分析構(gòu)建基于鐵死亡相關(guān)基因預(yù)后評(píng)估模型[7-10]。例如Huang X[10]等學(xué)者基于12個(gè)鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)建了急性髓細(xì)胞白血病的預(yù)后評(píng)估模型，其1年、3年、5年總體生存率ROC曲線(xiàn)下面積（AUC）均可達(dá)到0.8以上。然而，目前鐵死亡相關(guān)基因在骨肉瘤預(yù)后評(píng)估中的作用并不明確。

本文從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了骨肉瘤患者的組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)，探討鐵死亡相關(guān)基因?qū)τ诠侨饬龌颊哳A(yù)后評(píng)估的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源和處理 從公共數(shù)據(jù)庫(kù)（https://xenabrowser.net/datapages/）中下載88例骨肉瘤患者高通量測(cè)序基因表達(dá)數(shù)據(jù)（GDC-TARGET-OS，HTSeq-FPKM（n=88）），同時(shí)下載相關(guān)的臨床信息數(shù)據(jù)。用R語(yǔ)言軟件進(jìn)行表達(dá)基因名轉(zhuǎn)換以及整合臨床信息，刪除生存時(shí)間小于30天的樣本，最終獲得84例骨肉瘤患者數(shù)據(jù)。從數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.datjar.com:40013/bt2104/）中獲取鐵死亡相關(guān)的基因（Ferroptosis-related genes，F(xiàn)RGs，共259個(gè)基因），并提取骨肉瘤患者鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)信息。

1.2 獲取預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因 結(jié)合骨肉瘤患者鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)，用“survival”包對(duì)FRGs進(jìn)行單因素COX生存分析，以P＜0.05為條件篩選與骨肉瘤患者預(yù)后相關(guān)的FRGs。

1.3 預(yù)后模型構(gòu)建 將骨肉瘤患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)隨機(jī)抽取80%（n=67）為模型訓(xùn)練集，剩余的20%（n=17）為避免單因素COX分析篩選的預(yù)后相關(guān)FRG出現(xiàn)過(guò)度擬合，采用R軟件“glmet”包進(jìn)行進(jìn)一步的LASSO回歸分析，進(jìn)一步篩選預(yù)后基因。LASSO回歸中采用十則交叉驗(yàn)證確定λ值，選擇偏似然偏差最小的λ（Lamda.min）為最佳λ。用最終篩選的基因構(gòu)建預(yù)后模型，預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算公式如下：Riskscore=C1*Expr1+C2* Expr2+……Cn*Exprn（n代表基因個(gè)數(shù)，C表示LASSO回歸系數(shù)，Expr表示基因表達(dá)量）。根據(jù)上述公式計(jì)算出骨肉瘤患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分大于中位數(shù)的骨肉瘤患者為高風(fēng)險(xiǎn)組，小于中位數(shù)為低風(fēng)險(xiǎn)組。繪制患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的分布圖以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存時(shí)間的關(guān)系圖。同時(shí)比較納入模型的幾個(gè)鐵死亡相關(guān)基因在高低風(fēng)險(xiǎn)兩組間的表達(dá)水平。

1.4 預(yù)后模型的預(yù)測(cè)效果驗(yàn)證 分別采用R軟件的“survival”包和“survivalROC”包對(duì)高低風(fēng)險(xiǎn)兩組進(jìn)行K-M生存分析以及ROC曲線(xiàn)分析，計(jì)算1年、3年、5年總體生存率，對(duì)模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)采用驗(yàn)證集數(shù)據(jù)做K-M生存分析和ROC曲線(xiàn)分析，評(píng)估預(yù)后模型效果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用R3.5.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用單因素COX分析篩選預(yù)后因子；分別采用“glmnet”“survival”“survivalROC”等R包進(jìn)行LASSO回歸分析、生存分析、及時(shí)間依賴(lài)的ROC曲線(xiàn)繪制。生存資料單因素及多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型。當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵鐵死亡相關(guān)基因的篩選 經(jīng)過(guò)單因素COX生存分析篩選，共有11個(gè)基因與骨肉瘤的總體生存率相關(guān)（P＜0.05）（見(jiàn)表1）。他們分別是MUC1、VEGFA、MAP3K5、HILPDA、G6PD、ARNTL、SCD、BNIP3、PML、SOCS1、CBS。

表1 單因素COX生存分析篩選出的與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)基因

2.2 LASSO回歸分析進(jìn)一步篩選預(yù)后相關(guān)關(guān)鍵基因 根據(jù)上述單因素COX分析篩選P＜0.05的11個(gè)基因（見(jiàn)表1）及訓(xùn)練集樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行LASSO回歸分析，采用交叉驗(yàn)證迭代分析，結(jié)果顯示當(dāng)變量個(gè)數(shù)為9時(shí)，模型的均方誤差最?。é?0.032）（見(jiàn)圖1AB）。構(gòu)建基于9個(gè)鐵死亡相關(guān)基因的骨肉瘤預(yù)后評(píng)估模型：Risk score=（1.496）*CBS表達(dá)量+（0.456）*MUC1表達(dá)量+（0.096）*VEGFA表達(dá)量+（0.483）*HILPDA表達(dá)量+（-0.226）*SOCS1表達(dá)量+（-0.263）*PML表達(dá)量+（-0.504）*MAP3K5表達(dá)量+（-1.288）*G6PD表達(dá)量+（-2.40）*ARNTL表達(dá)量。

2.3 預(yù)后模型的預(yù)測(cè)效果 根據(jù)上一步得到的模型計(jì)算訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)值（Risk score），按風(fēng)險(xiǎn)值的中位數(shù)（-5.51）為界，將訓(xùn)練集數(shù)據(jù)分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，同時(shí)繪制兩組患者的生存狀態(tài)分布圖、基因表達(dá)熱圖（見(jiàn)圖2A）。訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中，1年、3年、5年總體生存率的ROC曲線(xiàn)下面積AUC分別為0.928、0.964、0.947（見(jiàn)圖2B）。生存分析顯示高風(fēng)險(xiǎn)組（risk score＞-5.51）骨肉瘤患者總體生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組（risk score＜-5.51）（P＜0.01）（圖2C）。而在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中，預(yù)后模型1年、3年、5年總體生存率的ROC曲線(xiàn)下面積（AUC）比訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中要低，但是AUC也都分別達(dá)到0.937、0.855、0.896（見(jiàn)圖3A-C）。且在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中生存分析也顯示高風(fēng)險(xiǎn)組的生存率明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組（P＜0.01）。說(shuō)明鐵死亡相關(guān)的預(yù)后模型對(duì)骨肉瘤患者預(yù)后的預(yù)測(cè)效果較好。

2.4 預(yù)后基因在高低風(fēng)險(xiǎn)兩組間的差異表達(dá)分析 根據(jù)模型計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)值，將骨肉瘤患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，分別計(jì)算兩組患者之間9個(gè)預(yù)后因子的基因表達(dá)量差異。結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)組中CBS、HILPDA、VEGFA、MUC1基因的表達(dá)量顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)組（P＜0.05）。而SOCS1、PML、ARNTL、G6PD、MAP3K5在高風(fēng)險(xiǎn)組的表達(dá)量則顯著降低（P＜0.05）（見(jiàn)圖4）。

3 討論

惡性骨腫瘤具有病情變化快、病死率高等特點(diǎn)[11]。骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多步驟和多因素的過(guò)程，其中涉及廣泛的分子異常和腫瘤異質(zhì)性[12]。由于惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、耐藥，致殘率高、死亡率高，骨肉瘤的預(yù)后極差。盡管人們已經(jīng)嘗試了很多新的治療藥物和方法，但骨肉瘤的治療效果并不理想，患者5年生存率仍然較低[13]。目前骨肉瘤的治療前景并不樂(lè)觀，而預(yù)后情況的預(yù)測(cè)，能有效地掌握疾病的發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)臨床用藥具有一定的指導(dǎo)作用。自從2012年鐵死亡的概念被提出以來(lái)，其在腫瘤及非腫瘤疾病中的作用越來(lái)越受到關(guān)注，其在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及治療等方面也有報(bào)道。

本文從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了骨肉瘤患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并且提取出259個(gè)FRGs的表達(dá)數(shù)據(jù)。采用單因素COX對(duì)現(xiàn)有患者的生存數(shù)據(jù)分析，篩選出11個(gè)與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)的FRGs。進(jìn)一步用LASSO回歸篩選，最終獲得9個(gè)FRGs用于骨肉瘤患者預(yù)后模型構(gòu)建。該預(yù)測(cè)模型經(jīng)過(guò)訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在預(yù)測(cè)骨肉瘤患者1年、3年、5年生存率中具有較高的AUC值，與Liu[13]等學(xué)者構(gòu)建的基于5個(gè)缺氧相關(guān)基因的骨肉瘤預(yù)后模型的AUC相當(dāng)，而與Huang[14]等學(xué)者基于m6A相關(guān)基因構(gòu)建的預(yù)后模型相比，本模型AUC明顯更大，提示本模型具有比其他模型更好的預(yù)后預(yù)測(cè)能力。

本研究中建立的預(yù)后模型主要是由9個(gè)（PML、MAP3K5、ARNTL、CBS、HILPDA、VEGFA、MUC1、SOCS1、G6PD）鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)成。其中PML（promyelocytic leukemia protein）是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，最早發(fā)現(xiàn)于急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL），在維持基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，PML的缺失會(huì)導(dǎo)致ROS水平增加[16]。PML還是一種促凋亡的基因，在非小細(xì)胞肺癌中，可被基于順鉑的全身化療間接抑制[17]。此外，PML在骨肉瘤細(xì)胞株中是抑制基因，已被證明與癌蛋白MDM2相互作用，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[18]。MAP3K5（又稱(chēng)為ASK1）是絲裂原活化蛋白激酶，屬于激酶（MAP3K）家族的成員之一，參與癌癥、神經(jīng)退行性變、炎癥和糖尿病的發(fā)病機(jī)制[19]。據(jù)報(bào)道[20-21]，在MAP3K5通路激活后能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的死亡。ARNTL是細(xì)胞晝夜節(jié)律的調(diào)控分子，作為生物鐘基因調(diào)節(jié)著癌癥的發(fā)生發(fā)展和化療的耐受性。晝夜節(jié)律的失調(diào)讓心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病和腫瘤細(xì)胞發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加[22]。據(jù)報(bào)道[23]，在乳腺癌和惡性血液病中檢測(cè)到AENTL啟動(dòng)子的高甲基化，進(jìn)一步加強(qiáng)了惡性細(xì)胞晝夜節(jié)律的紊亂。而本文研究結(jié)果中，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的PML、MAP3K5、ARNTL幾個(gè)基因的表達(dá)量均顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組患者，這與前人的研究結(jié)果相符合。上述基因的表達(dá)上調(diào)，提示骨肉瘤患者預(yù)后較好。

胱硫醚β合酶基因（cystathionine-beta-synthase，CBS）是編碼胱硫醚-β-合成酶的基因，它參與同型半胱氨酸的轉(zhuǎn)硫途徑的第一步反應(yīng)，將同型半胱氨酸不可逆的轉(zhuǎn)化為半胱氨酸和α酮丁酸。有研究顯示抑制CBS能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，從而影響腫瘤的預(yù)后及治療效果[24]。MUC1是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，一般情況下在胰腺、乳腺、肺和胃腸道等上皮細(xì)胞的頂端表面低水平表達(dá)[25]。MUC1表達(dá)量上調(diào)，除了影響腫瘤侵襲以及不良預(yù)后外，還與腫瘤血管生成和化療藥物的耐藥性相關(guān)[26]。研究發(fā)現(xiàn)[25]，MUC1/xCT信號(hào)通路可抑制鐵死亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。VEGFA是一種介導(dǎo)血管生成的因子，黏附于血管內(nèi)皮上，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖以及增加血管通透性，在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用[27]。VEGFA基因上調(diào)，影響著骨肉瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，測(cè)量VEGFA的循環(huán)水平對(duì)于評(píng)估預(yù)后有一定的價(jià)值意義[26]。HILPDA（hypoxia-inducible lipid droplet-associated）在細(xì)胞限制氧氣供應(yīng)時(shí)，通過(guò)代謝重編程調(diào)節(jié)脂解，使每個(gè)消耗氧氣的分子產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）的比例更高，以減少活性氧的生成[28-29]。在腫瘤細(xì)胞中，HILPDA基因的過(guò)表達(dá)，通常預(yù)示患者預(yù)后不良[30]。本研究中，上述基因的過(guò)量表達(dá)均提示著患者的預(yù)后質(zhì)量極差，治療后的總體生存率也顯著降低。

細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子1（Suppressor Of Cytokine Signaling-1，SOCS1）是SOCS家族的一員，在DNA損傷部位中連接P53，通過(guò)介導(dǎo)P53信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡。SOCS1基因隨著DNA甲基化介導(dǎo)的沉默，在人類(lèi)癌癥中的表達(dá)量減少[31]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是磷酸戊糖途徑的限速酶，生成的NADPH對(duì)維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和還原生物合成至關(guān)重要，癌細(xì)胞NADPH的生成和糖酵解都依賴(lài)于G6PD，在腎細(xì)胞癌[32]、膀胱癌[33]、胃癌[34]等多種人類(lèi)癌癥中都觀察到G6PD活性的升高。除此之外，異常激活G6PD還可引起ROS升高，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)和分化失控[35]。G6PD基因的過(guò)表達(dá)，密切聯(lián)系著惡性腫瘤患者的病情進(jìn)展，已經(jīng)作為患者預(yù)后不良的指標(biāo)[34]。本研究發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組中SOCS1和G6PD的表達(dá)量顯著降低，根據(jù)前人研究提示前者與預(yù)后差相關(guān)，后者反而提示良好的預(yù)后，可能不同腫瘤中G6PD發(fā)揮的作用并不相同，值得進(jìn)一步研究。

本文也存在一些局限：構(gòu)建的預(yù)后評(píng)估模型訓(xùn)練數(shù)據(jù)病例數(shù)較少。其次，該模型缺乏其他患者人群數(shù)據(jù)的外部驗(yàn)證。因此，模型的外推性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究建立了基于9個(gè)鐵死亡相關(guān)基因的骨肉瘤預(yù)后評(píng)估模型，為骨肉瘤患者的個(gè)性化治療提供預(yù)測(cè)因子，研究的結(jié)果可能有助于骨肉瘤患者的預(yù)后評(píng)估，同時(shí)有助于發(fā)現(xiàn)骨肉瘤潛在的治療靶點(diǎn)。