李蕊（北京醫(yī)藥職工大學(xué)（中國(guó)北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司黨校）,北京 100079）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC/MS/MS）是一種具有極高準(zhǔn)確度和精密度的分析技術(shù)，但在臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)使用中仍存在許多挑戰(zhàn)和缺陷，如各種分析前因素的影響，以及由于基體效應(yīng)而引起的離子抑制和與穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)相關(guān)的問(wèn)題等。質(zhì)譜分析是目前典型的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜程序變得越來(lái)越自動(dòng)化，越來(lái)越多與質(zhì)譜分析相關(guān)的體外診斷商業(yè)化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用將顯著增加。

1 介紹

每年都有越來(lái)越多的高靈敏度、用戶體驗(yàn)良好的新型質(zhì)譜儀被推出，質(zhì)譜儀的更新升級(jí)是與時(shí)俱進(jìn)的。質(zhì)譜分析技術(shù)已成為基礎(chǔ)生物學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)的重要技術(shù)。隨著質(zhì)譜分析相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，比如：樣品制備方法、標(biāo)記試劑、穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑和肽合成技術(shù)等，直接導(dǎo)致了“蛋白質(zhì)組學(xué)”和“代謝組學(xué)”的快速發(fā)展。例如，最近有報(bào)道稱，BoxCar采集方法可以在100分鐘內(nèi)對(duì)10,000個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行單次蛋白質(zhì)組學(xué)分析[1]。近年來(lái)，先進(jìn)的儀器不僅用于基礎(chǔ)研究，也用于專門的臨床應(yīng)用。在臨床應(yīng)用情況下，樣品制備和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜被集成到一個(gè)系統(tǒng)中。此外，先進(jìn)的電離程序、操作系統(tǒng)、所需的試劑、校準(zhǔn)器、質(zhì)量控制樣品和隨時(shí)可用的溶劑，現(xiàn)在都可以擁有?，F(xiàn)有的幾種電離方法，如解吸電噴霧電離（Desorption Electro Spray Ionization，DESI）[2]、探針電噴霧電離（Probe Electro Spray Ionization，PESI）[3]和快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜（Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry，REIMS）[4]已用于術(shù)中快速病理診斷和生物標(biāo)本實(shí)時(shí)分析。隨著技術(shù)創(chuàng)新的發(fā)展，質(zhì)譜的臨床應(yīng)用將變得更加廣泛。

質(zhì)譜分析在各個(gè)領(lǐng)域都有應(yīng)用，包括新生兒先天代謝錯(cuò)誤篩查、法醫(yī)毒理學(xué)和治療藥物監(jiān)測(cè)等。質(zhì)譜分析在實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)中最成功的應(yīng)用是使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定微生物。事實(shí)上，臨床診斷微生物學(xué)已經(jīng)發(fā)生了革命性的轉(zhuǎn)變[5]，該技術(shù)在全球范圍內(nèi)得到越來(lái)越多的應(yīng)用?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于血液培養(yǎng)標(biāo)本中的細(xì)菌快速鑒定特別有用，與傳統(tǒng)方法相比，其分析時(shí)間可縮短1.5-2天，從而有助于縮短住院時(shí)間并改善總體預(yù)后。

相比之下，基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的常規(guī)臨床化學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用仍較緩慢，因此應(yīng)用只局限于大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)和參考實(shí)驗(yàn)室。許多挑戰(zhàn)和限制阻礙了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的廣泛使用。例如：與全自動(dòng)免疫分析平臺(tái)相比，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜涉及復(fù)雜的操作流程，這方面就限制了其發(fā)展。

2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在臨床化學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，免疫分析在臨床實(shí)驗(yàn)室被廣泛用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、多肽和激素。然而，免疫分析方法有一些局限性和缺點(diǎn)：如依賴于抗體特異性。在許多情況下，抗體的特異性不夠，可能導(dǎo)致密切相關(guān)的化合物之間發(fā)生交叉反應(yīng)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜就可以克服這一局限性，因此其在臨床化學(xué)中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。質(zhì)譜應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)的任務(wù)是加快質(zhì)譜在臨床實(shí)驗(yàn)室的實(shí)施，目的是幫助改善患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，并降低醫(yī)療保健成本。

3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在臨床應(yīng)用中的挑戰(zhàn)和缺陷

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是一種高度精確的分析技術(shù)，在臨床化學(xué)中越來(lái)越多地使用，但它在臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)使用中仍然存在一些挑戰(zhàn)和缺陷[6]，具體而言，各種分析前因素的影響、基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致的離子抑制、穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)問(wèn)題、自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的缺乏等。

3.1 分析前因素的影響 體外診斷儀器的質(zhì)素保證以多種方式進(jìn)行。膽紅素、血紅蛋白和乳糜的干擾也要用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢查。當(dāng)抗體的使用包括在樣品制備的第一步，如1α，25-二羥基維生素D的測(cè)量[7]，類風(fēng)濕因子對(duì)分析物的特定抗體的影響必須排除。抗體常用于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)，以量化低豐度多肽。

目前臨床化學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用的采血管主要用于比色分析和免疫分析，不適合用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜。因此，當(dāng)使用這些試管進(jìn)行基于質(zhì)譜的分析時(shí)，可能獲得的結(jié)果并不準(zhǔn)確。

其次，靜脈穿刺和血清分離之間的時(shí)間間隔對(duì)血清肽譜有顯著影響。在血清生物標(biāo)志物的探索中，考慮儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存周期的影響是非常重要的。從事臨床質(zhì)譜分析的人員必須考慮到從樣品采集到分析的一系列操作對(duì)檢測(cè)結(jié)果有很大的影響。

3.2 樣品制備對(duì)降低基質(zhì)效應(yīng)的作用 在組分極其復(fù)雜的生物樣品中，為了準(zhǔn)確測(cè)量目標(biāo)分析物，需要適當(dāng)?shù)臉悠分苽??！盎|(zhì)效應(yīng)”是指共洗脫物質(zhì)的存在對(duì)離子源區(qū)域內(nèi)分析物的聚簇和電離過(guò)程產(chǎn)生的整體影響[8]。一般來(lái)說(shuō)，適當(dāng)?shù)臉悠分苽浜蜕V分離可以緩解基質(zhì)效應(yīng)。此外，由于粗樣品直接注入設(shè)備，樣品制備不足不僅縮短了液相色譜柱的壽命，還增加了設(shè)備停機(jī)的風(fēng)險(xiǎn)?；|(zhì)效應(yīng)可以通過(guò)柱后用t片將目標(biāo)分析液從高效液相色譜柱注入淋洗液來(lái)確認(rèn)[9]。磷脂是影響基質(zhì)效應(yīng)最顯著的因素之一，其洗脫模式可以通過(guò)前驅(qū)體離子掃描在質(zhì)譜圖中184m/z處峰位來(lái)進(jìn)行確定。通過(guò)對(duì)四種樣品制備方法：蛋白沉淀法（PP）、液-液萃取法（LLE）、固相萃取法（SPE）和支撐液萃取法（SLE）的比較，液相色譜分離使用了反相分配系統(tǒng)的色譜柱，該系統(tǒng)根據(jù)脂溶性分離分析物。在指定的洗脫時(shí)間，使用蛋白沉淀法和固相萃取法檢測(cè)到較強(qiáng)的離子抑制，而液-液萃取法的離子抑制最小。

固相萃取并不能有效地去除基質(zhì)效應(yīng)，這很可能是因?yàn)楣滔噍腿≈鸵合嗌V柱采用了相同的反相分離模式。為了有效的前處理，固相萃取必須采用不同于液相色譜柱的分離模式，如離子交換和混合模式。固相萃取中，磷脂柱里通過(guò)填充氧化鋯二氧化硅涂層來(lái)有效地去除磷脂的影響[10]。液-液萃取的離子抑制最弱，因?yàn)樗姆蛛x是基于極性，而不是相反的相位分布模式。由于固液萃取與液-液萃取的分離模式相同，有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)。然而，液-液萃取不適合大規(guī)模研究，因?yàn)檫@種技術(shù)不是自動(dòng)化的。另一方面，固相萃取，固液萃取可以很容易地自動(dòng)化。自動(dòng)化樣品制備使取樣程序一致。最終，包括數(shù)據(jù)分析和接口的完全自動(dòng)化將是進(jìn)一步加快液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。

基質(zhì)效應(yīng)的程度因電離模式的不同而有不同程度的影響。離子抑制在電噴霧電離正極模式下表現(xiàn)較好，而在電噴霧電離、大氣壓化學(xué)電離和大氣壓光電離下表現(xiàn)較差。最近有報(bào)道稱，一種新的商用大氣壓電離源UniSprayTM（Waters，USA）與電噴霧電離相比，根據(jù)目標(biāo)分析物的不同，略微降低了基質(zhì)效應(yīng)[11]。

3.3 穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物 內(nèi)標(biāo)物是十分必要的，可以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)和糾正樣品制備步驟中潛在的變化。一般將2H、13C、15N和18O標(biāo)記的化合物用作內(nèi)標(biāo)物，雖然2H標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的洗脫時(shí)間比反相分離的目標(biāo)分析物略快，但仍需要仔細(xì)注意磷脂和其他化合物引起的基質(zhì)效應(yīng)。另一方面，13C、15N和18O標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物可能比2H標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物更有用，因?yàn)樗鼈兊南疵摃r(shí)間幾乎接近目標(biāo)分析物。值得注意的是，1H-2H交換是否會(huì)發(fā)生，取決于標(biāo)記的位置的不同，導(dǎo)致的內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)也不同[12]。因此，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物在臨床質(zhì)譜分析中是不可或缺的，但2H標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物在大多數(shù)潛在的分析物中并不廣泛可用。

3.4 校準(zhǔn)器和血清認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 校準(zhǔn)器作為原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為目標(biāo)分析物濃度的參考，使用有缺陷的校準(zhǔn)器會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果?！都~約時(shí)報(bào)》2009年1月7日的一篇文章震驚了LC/MS/MS協(xié)會(huì)：Quest（美國(guó)著名的私人醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室之一）的一位發(fā)言人承認(rèn)，由于校準(zhǔn)器的問(wèn)題，一些錯(cuò)誤的1α，25-二羥基維生素D結(jié)果已經(jīng)被報(bào)道出來(lái)。盡管人們普遍認(rèn)為，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)量的實(shí)驗(yàn)室間差異與免疫分析相比要小很多，但根據(jù)FDA在2016年5月舉行的研討會(huì)上由美國(guó)病理學(xué)家學(xué)院（CAP）提出的關(guān)于1α，25-二羥基維生素D的調(diào)查結(jié)果顯示，情況并不是這樣的。如果使用通用校準(zhǔn)器，實(shí)驗(yàn)室間的差異可能會(huì)得到改善[13]?？紤]到他們提交給國(guó)際質(zhì)量評(píng)估計(jì)劃的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)室間的一致性較差，卡特和瓊斯試圖說(shuō)明使用一個(gè)共同的標(biāo)準(zhǔn)是否可以減少這種不一致性[14]。

雖然校準(zhǔn)器的基質(zhì)與真實(shí)樣品的基質(zhì)相同是可取的，但當(dāng)目標(biāo)分析物是內(nèi)源性化合物時(shí)，這種方法就不太可取。在沒(méi)有真正空白的情況下，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜成功定量生物樣品中的內(nèi)源分析物是十分具有挑戰(zhàn)性的。一種方法是對(duì)血清樣品進(jìn)行預(yù)處理，盡可能多地去除特定的內(nèi)源性分析物；另一種方法是使用2H標(biāo)記化合物作為生成校準(zhǔn)曲線的替代分析物。

牛血清白蛋白（BSA）溶液（4%-7%）常被用作基質(zhì)替代品，但BSA溶液中可能含有與目標(biāo)分析物的結(jié)合蛋白，應(yīng)予以注意。1α，25-二羥基維生素D值偏差較大可能是牛血清白蛋白中維生素D結(jié)合蛋白污染物造成的[14]。市售重組人血清白蛋白（HSA）不含可檢測(cè)到的1α，25-二羥基維生素D，可以用作基質(zhì)。因此在檢測(cè)中重要的是，不僅要注意用于校準(zhǔn)器的基質(zhì)類型，而且要注意標(biāo)準(zhǔn)材料本身的純度。

3.5 數(shù)據(jù)分析和儀表控制軟件 目前最新的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)，可以定義峰檢測(cè)方法，設(shè)置允許自動(dòng)峰檢測(cè)?，F(xiàn)有的質(zhì)譜儀器采用了幾種不同的峰檢測(cè)算法，但對(duì)于其有效性，需要檢查自動(dòng)得到的結(jié)果與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜專家手動(dòng)得到的結(jié)果是否一致。為了使液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)更適用于常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室分析需要全面的自動(dòng)化，包括自動(dòng)樣品制備、復(fù)雜的數(shù)據(jù)審查軟件，以及與實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)的數(shù)據(jù)平臺(tái)接口。質(zhì)譜分析平臺(tái)制造商使用了易于操作的分析物進(jìn)行他們的標(biāo)準(zhǔn)性能測(cè)試，以確保儀器的功能。

4 總結(jié)

目前，質(zhì)譜分析大多是實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的，勞動(dòng)密集，并需要相當(dāng)多的具有專業(yè)知識(shí)的工作人員來(lái)進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證。隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜程序變得越來(lái)越自動(dòng)化，越來(lái)越多與質(zhì)譜相關(guān)的體外診斷商業(yè)化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用將顯著加快。