蘇 博，付春情，薛婉婷，韓旺旺，魯瞳彤，王海心，陳冠宇，姚沛琳，徐禮生

枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽的提取及其應(yīng)用

蘇 博，付春情，薛婉婷，韓旺旺，魯瞳彤，王海心，陳冠宇，姚沛琳，徐禮生

(宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，宿州 234000)

為了提取枯草芽孢桿菌抗菌肽以探索其對(duì)食品的防腐效果，選用枯草芽孢桿菌DZSY21、解淀粉芽孢桿菌FZB42和枯草芽孢桿菌OKB105 菌種發(fā)酵，然后將這3個(gè)菌種的發(fā)酵上清液分別與丙酮按1:2的體積比混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到3種菌的抗菌肽粗提物。對(duì)抗菌肽的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)可知3種菌的抗菌肽經(jīng)100 ℃加熱30 min后抑菌效果均有小幅度降低，但抑菌活性仍較強(qiáng)?？咕牡鞍酌阜€(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3種菌的抗菌肽對(duì)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都很敏感；應(yīng)用性試驗(yàn)中采用牛奶、蘋(píng)果、肉等作為食品模型，結(jié)果顯示經(jīng)枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽處理后的試驗(yàn)組品相均明顯好于對(duì)照組。表明枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽具有較好的防腐效果。

枯草芽孢桿菌；抗菌肽；分離提取；天然食品防腐劑；抑菌

枯草芽孢桿菌(，隸屬于芽孢桿菌屬，革蘭氏染色呈紫色?？莶菅挎邨U菌對(duì)人體及動(dòng)植物沒(méi)有危害，是廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)、動(dòng)物飼料、植物病害和生物防治中的有益菌，在微生物益生制劑方面的發(fā)展?jié)摿薮骩1]。

抗菌肽被人類(lèi)首次發(fā)現(xiàn)是在20世紀(jì)80年代初，它由生物體產(chǎn)生，是一種可以有效抑制或殺滅細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、病毒和腫瘤細(xì)胞的小分子多肽類(lèi)物質(zhì)，具有良好的熱穩(wěn)定性、高效廣譜抗菌活性、強(qiáng)堿性等特點(diǎn)，還具有抗感染等生物活性[2-4]?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要分為抗菌蛋白和抗菌脂肽兩大類(lèi)，其中抗菌脂肽分為Surfactin、Iturin和Fengycin 3種[5-6]。田秋月等[7]從枯草芽孢桿菌S21發(fā)酵菌液中純化出兩種抗菌脂肽，并通過(guò)質(zhì)譜鑒定出其組成成分。鄒秋霞等[8]對(duì)枯草芽孢桿菌YN145進(jìn)行分離鑒定，試驗(yàn)表明其抗菌物質(zhì)能耐高溫、耐酸堿。

因?yàn)榭咕牟灰资辜?xì)菌產(chǎn)生耐藥性，且不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留，所以近年來(lái)在畜牧業(yè)中將其作為抗生素替代物的研究逐漸增多[9-12]。張靜等報(bào)道，育肥豬日糧中添加100或200 mg·kg-1抗菌肽菌絲霉素（)可有效增強(qiáng)其免疫指標(biāo)、腸道形態(tài)、抗氧化性，表現(xiàn)出良好的抗生素替代潛力[13]。張煒等發(fā)現(xiàn)菌肽BSN-3可在短時(shí)間內(nèi)殺滅大腸桿菌及在不同條件下保存抗菌肽BSN-37藥效活性可持續(xù)7.5 h，顯示抗菌肽BSN-37具有替代抗生素成為新抗菌藥物的潛力[14]?？咕脑谑称贩矫婢哂袕V泛的應(yīng)用前景，是一種新型天然食品防腐劑，具有高效殺菌、安全、抑菌機(jī)制獨(dú)特、不易殘留、易被人體消化吸收并且無(wú)毒副作用等特點(diǎn)，提高了食品的安全性。它對(duì)食源性致病菌有抑制作用，因此可以應(yīng)用于果蔬保鮮和食品包裝等方面[15-18]?？咕倪€可應(yīng)用于美容化妝品和抗腫瘤治療等領(lǐng)域，但是抗菌肽在來(lái)源、安全性、活體和體內(nèi)穩(wěn)定性方面仍存在問(wèn)題，需要進(jìn)行更深層次的研究[19]。

本研究依據(jù)抑菌能力的強(qiáng)弱，選用解淀粉芽孢桿菌FZB42作陽(yáng)性對(duì)照和枯草芽孢桿菌OKB105作陰性對(duì)照來(lái)研究枯草芽孢桿菌DZSY21及離心上清液對(duì)細(xì)菌體外平板抑制試驗(yàn)，觀察抑菌圈直徑大小；對(duì)枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽粗提物進(jìn)行提取，并檢測(cè)其抗菌活性；對(duì)DZSY21抗菌肽熱穩(wěn)定性和蛋白酶穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定；最后將其應(yīng)用到牛奶、水果和肉的防腐保鮮研究，為食品防腐劑與保鮮劑的研究開(kāi)發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種 試驗(yàn)菌：枯草芽孢桿菌DZSY21（DZSY21），解淀粉芽孢桿菌FZB42（FZB42），枯草芽孢桿菌OKB105（OKB105）。

指示菌（致病菌）：金黃色葡萄球菌（）和大腸桿菌（）。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 用1 000 mL蒸餾水配制好培養(yǎng)基后再用NaOH調(diào)pH，121℃滅菌20 min。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉15～20 g；pH 7.2～ 7.4。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨10 g，硫酸鎂0.24 g，二水合磷酸二氫鈉2 g，十二水合磷酸氫二鈉8 g；pH 7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，硫酸鎂0.048 g，硫酸錳0.02 g，氯化鈣0.1 g，二水合磷酸二氫鈉0.2 g，十二水合磷酸氫二鈉0.8 g；pH 7.4。

培養(yǎng)條件：將試驗(yàn)菌與指示菌涂布于固體NA培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落在固體NA培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.1.3 主要試劑和儀器 主要試劑：丙酮購(gòu)置于上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶和木瓜蛋白酶購(gòu)置于源葉生物；75%酒精購(gòu)置于宿州眾望消毒藥業(yè)有限公司；95%酒精購(gòu)置于安徽安特食品股份有限公司；胰蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、硫酸鎂等其他化學(xué)試劑均購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：WT-ZNO型超凈工作臺(tái)（鄭州中旺實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；智能生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；AL104電子天平（梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司）；GI100T立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；CH2118K微電腦電磁爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）；H1850臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；冰箱（青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌DZSY21及其上清液的體外平板抑菌試驗(yàn) （1）菌液活化：活化3種試驗(yàn)菌，將活化后的3種菌取10 mL分別接種至已滅菌的100 mL種子培養(yǎng)基中，置于28 ℃，180 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng)18 h。

（2）發(fā)酵上清液的制備：從種子培養(yǎng)基中按10%的接種量接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液5 000 r·min-1離心30 min，留上清液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

（3）平板抑菌試驗(yàn)：參考文獻(xiàn)[20]中的方法進(jìn)行。采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌，先往已滅菌且烘干的培養(yǎng)皿中加入1 mL600= 0.3的指示菌，再傾注20 mL已冷卻至50 ℃左右的固體NA培養(yǎng)基，混合均勻后水平靜置至凝固。選用直徑為6 mm的打孔器打孔，每板3個(gè)孔，每孔進(jìn)行10 s火焰封底，冷卻后在孔里分別加入50 μL的3種試驗(yàn)菌。將平板置于4 ℃冰箱中擴(kuò)散2 h，再放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。做3組平行試驗(yàn)并重復(fù)3次，抑菌圈測(cè)量值取平均值。

（4）發(fā)酵上清液抑菌試驗(yàn)：與1.2.1（3）操作方法相同，只是將3種試驗(yàn)菌換作3種試驗(yàn)菌發(fā)酵上清液注入孔中，做3組平行試驗(yàn)并重復(fù)3次，抑菌圈測(cè)量值取平均值。

1.2.2 抗菌肽粗提物制備及抑菌檢測(cè) （1）丙酮沉淀：參考文獻(xiàn)[21]中的方法，用孔徑為0.22 μm的水系濾膜對(duì)10 mL發(fā)酵上清液進(jìn)行抽濾。將丙酮和發(fā)酵上清液置于冰浴中預(yù)冷，再按發(fā)酵上清液:丙酮=1:2的體積比向發(fā)酵上清液中加入丙酮，冰浴中溫和攪拌10 min，再用低溫離心機(jī)于4 ℃，5 000 r·min-1離心30 min，所得上清液即抗菌肽溶液。丙酮沉淀物用10 mL無(wú)菌水溶解后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，將丙酮沉淀物與上清液作對(duì)比，空白對(duì)照為無(wú)菌水，測(cè)量抑菌圈直徑。做3組平行試驗(yàn)并重復(fù)3次，測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮：將離心后所得的上清液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，用無(wú)菌水將蒸發(fā)濃縮后所得溶液定容至10 mL，以保證每個(gè)菌種的上清液蒸發(fā)濃縮程度相同。用所得濃縮2倍的溶液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，設(shè)置3組平行試驗(yàn)并重復(fù)3次，取抑菌圈直徑平均值。

（3）抗菌肽梯度稀釋?zhuān)簩⑺脻饪s溶液用無(wú)菌水稀釋2、4、8、16、32、64和128倍后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，設(shè)置3組平行試驗(yàn)并重復(fù)3次，測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.3 抗菌肽穩(wěn)定性測(cè)定 （1）熱穩(wěn)定性：將100 mL的抗菌肽溶液分別置于4、20、40、60、80、100 和121 ℃條件下處理30 min后，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)量抑菌圈大小以檢測(cè)在不同溫度下處理后抗菌肽的抑菌活性。試驗(yàn)平行重復(fù)3次后，測(cè)量抑菌圈直徑取平均值。

（2）蛋白酶穩(wěn)定性：用無(wú)菌水分別配制胰蛋白酶和木瓜蛋白酶溶液（濃度為10 mg·mL-1），用900 μL的抗菌肽溶液與100 μL的蛋白酶液混合，置于37 ℃水浴鍋中水浴4 h后再在100 ℃下加熱10 min滅掉酶活。對(duì)照組分為2組，對(duì)照組1為不加蛋白酶液的抗菌肽溶液在37 ℃處理4 h后再經(jīng)100 ℃加熱10 min，對(duì)照組2為不加蛋白酶液的抗菌肽只在37 ℃水浴4 h不經(jīng)100 ℃加熱。處理后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，平行并重復(fù)3次取平均值，通過(guò)抑菌圈大小檢測(cè)經(jīng)蛋白酶處理后抗菌肽的抑菌活性。

1.2.4 應(yīng)用性試驗(yàn) （1）牛奶防腐試驗(yàn)：參考文獻(xiàn)[21]中的方法，將瓶裝新鮮日期的純牛奶在超凈臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌操作加入到已滅菌的試管中，每管15 mL，再向每支試管中加入300 μL的大腸桿菌菌液。試管編號(hào)為0—7號(hào)，0號(hào)為空白對(duì)照，不加枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽溶液；1—7號(hào)為試驗(yàn)組，按照編號(hào)順序分別加入100、200、300、400、500、600 和700 μL抗菌肽溶液。振蕩混勻后置于37 ℃下培養(yǎng)，每天觀察記錄牛奶變質(zhì)情況。平行并重復(fù)3次觀察腐敗的程度。將腐敗程度分為3個(gè)等次，即完全腐敗、一般腐敗和無(wú)腐敗，觀察7 d后進(jìn)行腐敗程度統(tǒng)計(jì)。

（2）蘋(píng)果防腐試驗(yàn)：參考文獻(xiàn)[21]中的方法，用75%乙醇為蘋(píng)果表面消毒后，用打孔器在其表面打出直徑6 mm、深10 mm的傷口，在傷口處加入150 μL稀釋倍數(shù)為2、4、8和16的枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽溶液，對(duì)照組為無(wú)菌水[22]。37 ℃條件下觀察并記錄蘋(píng)果傷口處病斑出現(xiàn)情況。平行并重復(fù)3次觀察腐敗的程度，統(tǒng)計(jì)方法如上。

（3）豬肉抑菌試驗(yàn)：將新鮮豬肉平均切分2份，每份約100 g，分別放在枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽溶液和無(wú)菌水中浸泡15 min，撈出瀝干后置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，室溫條件下放置，每天觀察記錄豬肉腐壞情況。平行并重復(fù)3次觀察腐敗程度，統(tǒng)計(jì)方法如上。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌DZSY21及其上清液的體外平板抑菌試驗(yàn)

2.1.1細(xì)菌對(duì)峙試驗(yàn) 圖1是平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果，A圖和B圖分別是以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌。由圖1可看出，3種試驗(yàn)菌對(duì)大腸桿菌均有抑制作用，F(xiàn)ZB42對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，DZSY21和OKB105對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果不明顯。

A. 大腸桿菌； B. 金黃色葡萄球菌。

Figure 1 Bacterial dual-culture experiments

2.1.2 發(fā)酵上清液抑菌試驗(yàn) 圖2是發(fā)酵上清液抑菌試驗(yàn)結(jié)果，A圖和B圖的指示菌分別為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。表1是3個(gè)試驗(yàn)菌種對(duì)兩種指示菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑。結(jié)合圖2與表1中的數(shù)據(jù)可以看出，F(xiàn)ZB42發(fā)酵上清液的抑菌效果最好，DZSY21其次，OKB105效果最差。

A. 大腸桿菌； B. 金黃色葡萄球菌。

Figure 2 Fermentation supernatant bacteriostatic test

2.2 抗菌肽的分離與純化

2.2.1 丙酮沉淀 圖3以金黃色葡萄球菌為指示菌，3個(gè)試驗(yàn)菌種未經(jīng)超濾的丙酮沉淀上清液與沉淀物抑菌試驗(yàn)結(jié)果， A、B和C圖分別為菌種FZB42、DZSY21和OKB105，以無(wú)菌水作為對(duì)照。由表2 可知，在未經(jīng)過(guò)孔徑為0.22 μm的濾膜超濾的情況下，3個(gè)菌種中FZB42的抑菌效果最好，DZSY21其次，OKB105效果最差；經(jīng)過(guò)直徑為0.22 μm的濾膜超濾后，F(xiàn)ZB42和DZSY21的抑菌效果變差，而OKB105的抑菌效果無(wú)明顯變化。由數(shù)據(jù)推測(cè)可能是因?yàn)镕ZB42和DZSY21產(chǎn)生的抗菌肽分子量大于OKB105產(chǎn)生的抗菌肽分子量，在超濾過(guò)程中由于FZB42和DZSY21產(chǎn)生的部分抗菌肽未能通過(guò)濾膜而導(dǎo)致抗菌肽濃度降低，而OKB105產(chǎn)生的抗菌肽因分子量較小，能通過(guò)濾膜而導(dǎo)致其抗菌肽濃度提高，具體原因需根據(jù)這一現(xiàn)象進(jìn)行更深入的研究。

表1 發(fā)酵上清液抑菌試驗(yàn)抑菌圈直徑

注：*和**分別為0.05及0.01水平上的顯著性差異。下同。

2.2.2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮 將離心后所得的上清液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行蒸發(fā)濃縮后，抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。未超濾的情況下，F(xiàn)ZB42的抑菌效果最好，DZSY21其次，OKB105最差；超濾后OKB105的抑菌效果稍好于DZSY21，F(xiàn)ZB42的最好。

A. FZB42；B. DZSY21； C. OKB105。

Figure 3 Acetone precipitation supernatant and sediment inhibition experiment

表2 丙酮沉淀上清液與沉淀物抑菌試驗(yàn)的抑菌圈直徑

表 3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮試驗(yàn)中的抑菌圈直徑

2.2.3 抗菌肽梯度稀釋試驗(yàn) 圖4是抗菌肽梯度稀釋試驗(yàn)，A圖中指示菌為大腸桿菌，B圖為金黃色葡萄球菌。以抑菌效果最好的未經(jīng)超濾的FZB42為例，稀釋倍數(shù)為32時(shí)就沒(méi)有出現(xiàn)抑菌效果（表4），說(shuō)明抗菌肽的抑菌活性呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。

2.3 抗菌肽穩(wěn)定性測(cè)定

2.3.1 熱穩(wěn)定性 圖5是以大腸桿菌為指示菌的抗菌肽熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，A圖為FZB42，B圖為DZSY21，C圖為OKB105。由表5可以看出，抗菌肽在4～60 ℃之間活性無(wú)明顯變化，80～100 ℃時(shí)有所降低，121 ℃時(shí)喪失活性。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明3種抗菌肽熱穩(wěn)定性均較好，在涉及熱處理的食品加工過(guò)程中活性不易喪失，作為食品防腐劑的應(yīng)用價(jià)值較高。

A. 大腸桿菌；B. 金黃色葡萄球菌。

Figure 4 Antimicrobial peptide gradient dilution experiment

2.3.2 蛋白酶穩(wěn)定性 圖6是抗菌肽蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，以金黃色葡萄球菌為指示菌，圖A、B和C中抗菌肽分別為FZB42、DZSY21和OKB105。由表6中的數(shù)據(jù)可以得出，3個(gè)菌種對(duì)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都很敏感，F(xiàn)ZB42抗菌肽和DZSY21抗菌肽對(duì)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的敏感程度相當(dāng)，OKB105抗菌肽對(duì)胰蛋白酶的敏感程度相較于木瓜蛋白酶更高一點(diǎn)。

表4 抗菌肽梯度稀釋試驗(yàn)抑菌圈直徑

A. FZB42；B. DZSY21；C. OKB105。

Figure 5 Antimicrobial peptide thermal stability experiment

表5 抗菌肽熱穩(wěn)定性試驗(yàn)抑菌圈直徑

A. FZB42抗菌肽；B. DZSY21抗菌肽； C. OKB105抗菌肽。

Figure 6 Antibacterial peptide protease stability experiment

表6 抗菌肽蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn)抑菌圈直徑

圖7 枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽牛奶防腐試驗(yàn)

Figure 7DZSY21 antibacterial peptide applied in milk preservation experiment

2.4 應(yīng)用性試驗(yàn)

2.4.1 牛奶防腐試驗(yàn) 枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽牛奶防腐試驗(yàn)結(jié)果（圖7）顯示，在37 ℃條件下放置7 d后，空白組中的牛奶已經(jīng)明顯變質(zhì)即完全腐敗，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，分層后的液體為淡黃色，打開(kāi)試管塞能聞到一股奶制品特有的酸味。1、2和3號(hào)試管由于加入的抗菌肽較少，也出現(xiàn)了變質(zhì)即一般腐敗，但變質(zhì)程度隨著抗菌肽添加量的增加而降低，且后面的試管中牛奶未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，打開(kāi)試管塞后無(wú)異味，幾乎未變質(zhì)即無(wú)腐敗。

2.4.2 蘋(píng)果防腐試驗(yàn) 枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽蘋(píng)果防腐試驗(yàn)結(jié)果（圖8）顯示，枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽溶液經(jīng)過(guò)梯度稀釋后在蘋(píng)果上打孔進(jìn)行防腐試驗(yàn)。圖8中從左至右為空白組和稀釋倍數(shù)分別為2、4、8和16倍的試驗(yàn)組，可以看出，稀釋2倍后打孔的蘋(píng)果品相良好，無(wú)病斑，稀釋4、8和16倍后打孔的蘋(píng)果上出現(xiàn)的病斑隨著稀釋倍數(shù)的增加而擴(kuò)大，空白組的病斑直徑最大。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽的抑菌效果較好，有較強(qiáng)的抑菌活性。

圖8 枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽蘋(píng)果防腐試驗(yàn)

Figure 8 Apple antiseptic experiment ofDZSY21 antibacterial peptide

圖9 枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽鮮豬肉防腐試驗(yàn)

Figure 9 Antibacterial experiment ofDZSY21 antibacterial peptide in fresh pork

2.4.3 鮮豬肉防腐試驗(yàn) 圖9為枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽鮮豬肉防腐試驗(yàn)結(jié)果。圖9（a）為無(wú)菌水浸泡處理的對(duì)照組，圖9（b）為抗菌肽處理的試驗(yàn)組?？梢钥闯?，在室溫條件下放置3 d后，對(duì)照組顏色明顯變深，表面出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)并伴有惡臭，出現(xiàn)完全腐敗的現(xiàn)象；而試驗(yàn)組品相相對(duì)較好，無(wú)明顯腐壞現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

在試驗(yàn)中，與陽(yáng)性對(duì)照FZB42抗菌肽相比，DZSY21抗菌肽抑菌效果稍弱，與陰性對(duì)照OKB105相比，DZSY21抑菌效果較好。在以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌的抑菌試驗(yàn)中，3種試驗(yàn)菌對(duì)大腸桿菌的抑制效果均明顯好于金黃色葡萄球菌。在發(fā)酵上清液抑菌試驗(yàn)中，3種試驗(yàn)菌對(duì)指示菌均有抑制作用且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌的抑制作用。表明枯草芽孢桿菌DZSY21對(duì)致病菌均有抑制作用。

在丙酮沉淀上清液與沉淀物抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)FZB42的沉淀物也有較強(qiáng)抑菌活性，可能是丙酮沉淀其他雜蛋白的過(guò)程中沉淀了一部分抗菌肽或者沉淀中含有其他抗菌成分，但因沉淀物中含有較多雜蛋白，故只保留上清液進(jìn)行后續(xù)純化。將上清液用直徑為0.22 μm的濾膜超濾后，發(fā)現(xiàn)FZB42和DZSY21的抗菌肽濃度降低，而OKB105的抗菌肽濃度不變，推測(cè)是因?yàn)樵诔瑸V過(guò)程中部分FZB42和DZSY21的抗菌肽未能全部通過(guò)濾膜，OKB105的抗菌肽因分子量較小故全部通過(guò)了濾膜，但具體原因需深入對(duì)分子量進(jìn)行研究。

3個(gè)菌種產(chǎn)生的抗菌肽均有良好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)100 ℃加熱30 min后抗菌效果僅有小幅度降低，但仍具有良好的抑菌活性，因此推測(cè)作為防腐劑在食品熱加工處理過(guò)程中活性不易喪失。在蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn)中，3種抗菌肽對(duì)胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都很敏感。相較于木瓜蛋白酶，對(duì)胰蛋白酶的敏感程度更高，因此作為防腐劑在日常生活中比較穩(wěn)定。在牛奶防腐試驗(yàn)中，37 ℃放置7 d后，空白對(duì)照組的牛奶已明顯變質(zhì)，出現(xiàn)分層現(xiàn)象并伴有酸味，而添加了枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽的試驗(yàn)組除添加量較少的幾組外，幾乎未出現(xiàn)腐壞現(xiàn)象。在蘋(píng)果、鮮豬肉等食品防腐試驗(yàn)中，經(jīng)枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽處理后的試驗(yàn)組品相均明顯好于對(duì)照組，表明該抗菌肽具有良好的防腐效果。

通過(guò)陰陽(yáng)對(duì)照細(xì)菌體外抑菌試驗(yàn)、抗菌肽抑菌試驗(yàn)以及穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌DZSY21抗菌肽作為天然食品防腐劑，具有良好的熱穩(wěn)定性和抑菌活性，應(yīng)用前景廣泛，但要通過(guò)進(jìn)行臨床試驗(yàn)以進(jìn)一步研究DZSY21抗菌肽應(yīng)用于食品中是否對(duì)人體安全無(wú)毒。

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Extraction and application ofDZSY21 antimicrobial peptide

SU Bo, FU Chunqing, XUE Wanting, HAN Wangwang, LU Tongtong, WANG Haixin, CHEN Guanyu, YAO Peilin, XU Lisheng

(School of Biological and Food Engineering, Suzhou University, Suzhou 234000)

In order to extract antimicrobial peptides fromand explore its anti-corrosion effect on food, three strains ofDZSY21,FZB42 andOKB105 were selected for fermentation in this experiment, and then the fermentation supernatants of the three strains were mixed with acetone at a volume ratio of 1:2. The crude extracts of antimicrobial peptides from three strains were obtained by rotary evaporation concentration. According to the thermal stability test of the antimicrobial peptides, the antibacterial effects of the antibacterial peptides from the three bacteria were all slightly reduced after heating at 100 ℃ for 30 min, but the anti- bacterial activities still kept strong. The antimicrobial peptides of the three strains were sensitive to trypsin and papain. Milk, apple, meat and other food models were used in the application experiment, and the results showed that the experimental group was significantly better than the control group after treated withDZSY21 antimicrobial peptide, indicating thatDZSY21 antimicrobial peptide has better antiseptic effect.

; antibacterial peptide; isolation and extraction; natural food preservative; bacteriostasis

TS202.3

A

1672-352X (2022)05-0848-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20221111.001

2022-11-14 11:27:41

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20221111.1100.002.html

2021-09-19

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202110379019，S202010379070），安徽省自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2020A0729），產(chǎn)學(xué)合作協(xié)同育人項(xiàng)目（202002033001，202002161034）和宿州學(xué)院科研平臺(tái)開(kāi)放課題（2019ykf29，2020ykf22）共同資助。

蘇博，助理研究員。E-mail：subowsm31415@163.com