李愛華，許秀環(huán)，李金柱，蒲 堯，吳 楚*

施加硒肥條件下的印度梨形孢接種對香榧幼苗根系發(fā)育、氣體交換及其葉片硒累積的影響

李愛華1，許秀環(huán)1，李金柱1，蒲 堯2，吳 楚2*

(1. 湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，武漢 430075；2. 長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，荊州 434025)

近些年來香榧果實在干果市場非常受到人們的喜愛，如何提高其果實產(chǎn)量，促進(jìn)其果實品質(zhì)尤其微量元素的強(qiáng)化是當(dāng)前香榧栽培上需要解決的問題。微量元素硒是硒蛋白必需的元素，它與多種人體疾病有關(guān)。采用盆栽的方式，施加礦物硒粉，并對香榧幼苗接種根內(nèi)生真菌印度梨形孢。結(jié)果表明，印度梨形孢可以侵染香榧幼苗的根系(侵染率為22.34%)，并使其總根長、總根表面積和總根體積以及二級根上一級根的數(shù)量，分別增加12.69%、16.26%、20.81%和10.93%，但對其特定根長和根組織密度沒有顯著影響。香榧幼苗接種印度梨形孢可顯著提高凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度以及蒸騰速率，分別增加92.92%、6.16倍、47.67%和2.36倍，同時顯著提高光能利用效率（88.62%）而降低水分利用效率（84.28%）。接種顯著地促進(jìn)了香榧幼苗總生物量的累積（36.94%）以及葉片總硒含量（1.68倍）?；谟《壤嫘捂呖纱龠M(jìn)植物營養(yǎng)吸收的特性，該根內(nèi)生真菌可以用香榧硒的生物強(qiáng)化，以提高香榧果實的品質(zhì)。

硒；香榧；印度梨形孢；生物強(qiáng)化

硒（Se）是維持人體健康的重要微量元素，因為它是一些重要蛋白（即硒蛋白）的組成成分，如谷胱甘肽過氧化物酶1（glutathione peroxidase 1，GPX1）、碘化甲腺氨酸脫碘酶1 （iodothyronine deiodinase 1）、硫氧還原蛋白還原酶（thioredoxin reductase），這些含有硒元素的蛋白統(tǒng)稱為硒蛋白。在人體中，硒蛋白具有多種功能[1]。因此，硒的攝入不足將引起多種人體疾病。在我國，最著名的硒攝入不足引起的疾病就是克山病?？松讲〉陌l(fā)生與GPX1的活性較低有關(guān)[2]，另一種與硒攝入不足有關(guān)的疾病是卡斯欽-貝克?。↘aschin–Beck disease）[3-4]。在我國，卡斯欽-貝克病的地理分布與硒攝入不足的分布帶密切吻合，該分布帶包括西藏、青海以及四川一部分[5]。硒的攝入不足還與其他人體疾病有關(guān)，如癌癥[6-7]、關(guān)節(jié)炎[8]、肌肉疾病[9]和心血管病[10]。因此，硒的充足攝入和實行食品的硒強(qiáng)化對于維持人體健康至關(guān)重要[11]。

硒的生物強(qiáng)化可通過在食品原料生產(chǎn)過程中硒的富集而實現(xiàn)，如土壤中施加硒肥和葉面噴施硒肥。通過這些方式，可以生產(chǎn)出富硒的谷物[12]、水果[13- 14]、蔬菜[15-16]、茶葉[17-18]以及蘑菇[19-20]。堅果為人們常食用的休閑食品，也可以作為烘焙食品的原料，通過堅果的硒生物強(qiáng)化無疑可以增加硒的攝入量。然而，目前人們對堅果的硒生物強(qiáng)化研究得很少，僅對巴西堅果（）內(nèi)的硒分布進(jìn)行過分析[21]。近些年來，香榧（）果實作為休閑食品在我國越來越受到人們的青睞，對新品種選育及其產(chǎn)量研究尤受重視[22-24]，其果實的硒生物強(qiáng)化可以提高其品質(zhì)，然而，人們對此尚未予以特別的關(guān)注。

有益微生物，如叢枝菌根真菌、根內(nèi)生真菌、深色有隔真菌等，與植物根系共生，可以為植物提供多種利益，如促進(jìn)營養(yǎng)吸收與生長、提高抗逆性、促進(jìn)次生代謝物的合成。其促進(jìn)植物營養(yǎng)吸收的特性正好可以用來加強(qiáng)植物對硒的吸收，以實現(xiàn)硒的生物強(qiáng)化[25]。印度梨形孢（）為一種根內(nèi)生真菌，可以實現(xiàn)非活體營養(yǎng)繁殖[26]。它能與很多植物共生，可加強(qiáng)植物對營養(yǎng)吸收，促進(jìn)植物生長[26-28]。通過促進(jìn)基因的表達(dá)而增加擬南芥的冰凍耐性及其融化后的恢復(fù)[29]。擬南芥接種印度梨形孢后，其開花會提前，這主要是通過調(diào)節(jié)其光周期和赤霉素的生物合成途徑而實現(xiàn)的[30]。此外，印度梨形孢可以提高宿主的抗旱能力[31]與耐鹽性[32]，減少砷從西紅柿的根部向果實轉(zhuǎn)移[33]。印度梨形孢與小麥共生可以增強(qiáng)對其病原菌的抗性[34]。為了充分利用印度梨形孢的這些特性來加強(qiáng)香榧對硒的富集，本研究對其共生的效果及其在香榧葉片硒富集的促進(jìn)作用進(jìn)行研究，以期印度梨形孢可在香榧果實的生產(chǎn)上得以應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

年齡為7個月的香榧（cv. “Merrillii”）小苗從湖北林寶香榧產(chǎn)業(yè)開發(fā)股份有限公司（湖北省通山縣）獲得，栽植于自制的有機(jī)玻璃盒（30 cm× 20 cm× 10 cm），栽培基質(zhì)為園藝育苗基質(zhì)（每盒2 kg）。栽培基質(zhì)事先在高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌（20 min）。每個有機(jī)玻璃盒栽植3棵幼苗，共計60盆。然后將幼苗在溫室中培養(yǎng)（25 ℃，相對濕度85%，光照為自然光）。根據(jù)栽培基質(zhì)的水分含量進(jìn)行水分管理。待小苗移栽成活后（15 d），在每個有機(jī)玻璃盒的中央施加硒礦粉5 g（購自湖北硒金農(nóng)業(yè)科技有限公司，其硒含量為0.13%，其粒度為800目）。一周后，在30個有機(jī)玻璃盒中各施入10 mL印度梨形孢（, 以下簡稱為Piin）菌絲懸浮液（10 g·L-1）。該菌種由德國耶拿大學(xué)R. Oelmuller教授提供，接種后的管理同上。

1.2 印度梨形孢侵染檢測

根據(jù)以往對印度梨形孢侵染植物根系進(jìn)程的觀察，在印度梨形孢接種后18 d即可侵染根系。在本研究中，我們在印度梨形孢菌絲懸浮液施入20 d，隨機(jī)取5株香榧小苗的根系進(jìn)行印度梨形孢侵染檢測，按照Vahabi等[35]的方法采用臺酚藍(lán)（trypan blue, 0.01 mg·mL-1）進(jìn)行。

1.3 氣體交換的測定

在植株收獲之前進(jìn)行氣體交換測定。在每種處理隨機(jī)選取5盆材料，選取植株相同部位的健康葉片進(jìn)行氣體交換參數(shù)的測量。采用Li-6400便攜式光合光合儀（Li-Cor公司，USA），選擇在晴朗而陽光充足的上午9: 00—12: 00開始測定。測定前1 h，將植株置于在陽光下使其葉片充分活化。測定的光源采用Li-6400-02B 紅藍(lán)光光源（PPFD設(shè)置為 1 200 μmol?m-2?s-1），測定指標(biāo)主要包括凈光合速率（n）、蒸騰速率（r）、氣孔導(dǎo)度（Cond）以及胞間二氧化碳濃度（i）等相關(guān)參數(shù)。每組處理各記錄40組數(shù)據(jù)。光能利用效率計算為n/PPFD，水分利用效率計算為n/r。

1.4 植物收獲與生物量測定

在印度梨形孢懸浮液接種10個月后，將香榧幼苗從容器中取出來，其根系用自來水清洗干凈后拿回實驗室。每組處理隨機(jī)取3株，其葉片用于測定葉綠素含量，剩余的植株用于測定生物量。測定生物量前，植株在60 ℃下烘干24 h，然后每株分成根、莖、葉3個部分，再采用分析天平稱重。

1.5 香榧幼苗根系的掃描

將各組所有洗凈的香榧幼苗根系采用WinRhizo根系掃描系統(tǒng)(Regent Instruments公司,加拿大魁北克)進(jìn)行掃描以獲得總根系長度、總根系表面積、總根系體積等參數(shù)。

1.6 二級根上的一級根數(shù)量及其特定根長與根組 織密度分析

按照Pregitzer 等[36]的方法對根系進(jìn)行分級，從每組處理中隨機(jī)取15根二級根。然后采用WinRhizo根系掃描系統(tǒng)進(jìn)行根系掃描，以獲得其根長和體積。對二級根上一級根的數(shù)量直接點(diǎn)數(shù)。之后在60 ℃下烘干24 h，再稱重。特定根長（specific root length）=根系長度/根重；根組織密度（root tissue density）= 根重/根體積。

1.7 葉綠素含量測定

葉綠素的含量和類胡蘿卜素含量采用乙醇法測定[37]。

1.8 硒含量測定

采用上述烘干后的香榧葉片測定硒含量。將干樣用高速電動粉碎機(jī)粉碎后備用，用于后期測定總硒（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，GB 5009.93—2017）和有機(jī)硒的含量，有機(jī)硒的含量測定采用的方法是氫化物原子熒光光譜法（DB36/T 1243—2020）[38]，采用的儀器為原子熒光光譜儀，產(chǎn)自中國北京吉田儀器公司，型號為AFS-8220。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS軟件（v. 21）分析處理。所有數(shù)據(jù)經(jīng)過ANOVA分析，其統(tǒng)計分析結(jié)果表達(dá)為mean ± SE。為了判斷兩個處理之間各個參數(shù)的差異是否顯著，用LSD進(jìn)行檢驗（< 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢在香榧根系中的定殖

從圖1中可以看出，印度梨形孢的孢子出現(xiàn)在根系皮層組織中，表明印度梨形孢可以侵染香榧的根系。其侵染率為22.34%。

2.2 在施加硒礦粉條件下印度梨形孢侵染對香榧幼苗根系的影響

在施加硒礦粉條件下，印度梨形孢在香榧幼苗根系的定殖對其根系的發(fā)育產(chǎn)生了一定影響（圖2 和表1）。印度梨形孢在香榧幼苗根系的定殖增加了幼苗根系的總根長度、總根表面積和總根體積，分別增加12.69%、16.26%和20.81%，但增加的幅度并不顯著（表1，> 0.05）。同時，其定殖使香榧幼苗根系的特定根長和根組織密度分別減少2.55%和0.22%，而使二級根上的一級根的數(shù)量增加10.93%，但減少和增加均不顯著（表1，> 0.05）。

箭頭所指為印度梨形孢的孢子（Bar =10 μm）。

Figure 1 Infection ofin the roots of

A. 印度梨形孢接種的根系；B. 無印度梨形孢接種的根系。圖片來自WinRhizo根系掃描儀，并使用Image Pro Plus （v. 6.0）處理。

Figure 2 Effect ofinoculation on root systems ofseedlings supplied with selenium fertilizer

表1 印度梨形孢接種對香榧幼苗根系構(gòu)型的影響

注：同一行中相同的英文小寫字母表示差異不顯著(> 0.05)。

圖3 施加硒肥條件下印度梨形孢侵染對香榧光合色素含量的影響

Figure 3 Effects ofinoculation on concentrations of photosynthesis pigments ofseedlings supplied with a selenium fertilizer

圖4 施加硒肥條件下印度梨形孢侵染對香榧幼苗凈光合速率（a）、氣孔導(dǎo)度（b）和胞間CO2濃度（c）的影響

Figure 4 Effects ofinoculation on net photosynthetic rates (a), stomatal conductance (b) and intercellular CO2concentrations (c) ofseedlings supplied with selenium fertilizer

Figure 5 Effects ofinoculation on transpiration rates (a), light use efficiency (b) and water use efficiency (c) ofseedlings supplied with selenium fertilizer

圖6 施加硒肥條件下印度梨形孢侵染對香榧生物量累積的影響

Figure 6 Effects ofinoculation on biomass accumulation ofseedlings supplied with selenium fertilizer

圖7 施加硒肥條件下印度梨形孢侵染對香榧葉片總硒含量的影響

Figure 7 Effect ofinoculation on total selenium concentrations in leaves ofseedlings supplied with selenium fertilizer

2.3 在施加硒礦粉的條件下印度梨形孢的孵育對氣體交換與生物量累積的影響

在施加硒礦粉的條件下，印度梨形孢的孵育對葉綠素含量和類胡蘿卜素含量以及總?cè)~綠素含量均沒有顯著的影響（圖3，> 0.05）。印度梨形孢侵染香榧幼苗根系使其凈光合速率增加92.92%，氣孔導(dǎo)度增加6.16倍，胞間CO2濃度增加47.67%，且均呈現(xiàn)顯著差異（圖4，< 0.05）。同時也顯著增加了其蒸騰速率（2.36倍）和光能利用效率（88.62%）（圖5（a）和（b），< 0.05），但水分利用效率降低84.28%，且其差異顯著（圖5（c），< 0.05）。其侵染則顯著增加香榧幼苗根莖葉和總生物量（圖6，< 0.05），總生物量增加36.94%。

2.4 在施加硒礦粉的條件下印度梨形孢侵染對香榧葉片硒累積的影響

印度梨形孢對香榧的侵染引起了硒累積的變化。如圖7所示，接種印度梨形孢的香榧葉片中總硒含量顯著高于未接種香榧（< 0.05），增加1.68倍。

3 討論

印度梨形孢可以侵染很多植物[39-42]，它也可以侵染香榧根系（圖1）。這種侵染增加了香榧幼苗根系的總長度、總表面積與總體積（表1），進(jìn)而改變了植物根系構(gòu)型（圖2）。這些試驗結(jié)果與印度梨形孢侵染對柏木幼苗根系的影響一致，但沒有象柏木那樣顯著[28]。此外，印度梨形孢侵染增加了香榧幼苗二級根上的一級根的數(shù)量（表1）。據(jù)此可以推測，隨著香榧幼苗的生長，接種印度梨形孢的香榧的根系構(gòu)型將比未接種的香榧根系構(gòu)型更復(fù)雜，這樣的根系統(tǒng)對土壤營養(yǎng)（如硒）的吸收更強(qiáng)。然而，印度梨形孢侵染對香榧幼苗根系的特定根長與根組織密度幾乎沒有任何影響（表1）。這些研究結(jié)果表明印度梨形孢侵染對香榧幼苗根系的組織結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響，香榧幼苗不需改變其碳的分配格局。

在磷缺乏條件下，印度梨形孢侵染杉木幼苗根系，可以促進(jìn)杉木幼苗根系對氮磷鉀的吸收，并改變其在根莖葉中的分配格局[27]。印度梨形孢侵染香榧也應(yīng)促進(jìn)其對營養(yǎng)的吸收并增強(qiáng)氮磷鉀在葉片中的分配，進(jìn)而促進(jìn)香榧幼苗的凈光合速率（圖4（a）），增加其生物量的累積（圖6）。印度梨形孢侵染香榧幼苗根系并沒有相助其葉片光合色素的含量（圖3），而其凈光合速率顯著增加（圖4（a）），這可能來源于兩個方面的原因。其一是印度梨形孢接種顯著增加了香榧幼苗葉片的胞間二氧化碳濃度（圖4（c））。胞間二氧化碳濃度的增加可以促進(jìn)二氧化碳在碳酸酐酶的作用下進(jìn)入葉綠體，進(jìn)而增加葉綠體內(nèi)可被利用的二氧化碳的濃度。其二，印度梨形孢可以改善植物光合作用過程的機(jī)制。印度梨形孢侵染接種柏木可以提高幾個葉綠素?zé)晒鈪?shù)，如v/m、P和L[28]。此外，印度梨形孢侵染香榧幼苗顯著增加了其光能利用效率（圖5（b）），顯著降低了其水分利用效率（圖5（c））。這兩個試驗結(jié)果與印度梨形孢侵染杉木幼苗造成的影響不同。印度梨形孢侵染杉木幼苗根系時，顯著提高其光能利用效率，但對水分利用效率沒有影響[27]。印度梨形孢侵染香榧會增大其水分的消耗（圖5（a）），因此在實際生產(chǎn)上，如果要進(jìn)行香榧接種印度梨形孢，應(yīng)加強(qiáng)水分的管理，尤其在干旱時期。

如前所述，很多有益微生物可用來進(jìn)行農(nóng)作物的營養(yǎng)強(qiáng)化。這種強(qiáng)化作用是基于有益微生物可促進(jìn)植物對營養(yǎng)的吸收與利用。印度梨形孢侵染樹木會促進(jìn)養(yǎng)分吸收[27]。因而，印度梨形孢可以用來進(jìn)行香榧對硒的生物強(qiáng)化。這種想法得到了證實，即香榧幼苗接種印度梨形孢可以顯著促進(jìn)其葉片總硒的累積（圖7）。這一結(jié)果與茶樹（cv. “Chuyeqi”）接種細(xì)菌sp. WT00C所取得的結(jié)果一致[18]。目前人們對有益微生物強(qiáng)化微量元素累積的機(jī)理還不十分清楚。初步研究表明，小白菜接種印度梨形孢可改變小白菜有關(guān)硒累積的轉(zhuǎn)錄組變化（蒲堯等未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。在香榧接種印度梨形孢后，其硒累積的機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。蛋白組和代謝組的研究可以很好地揭示印度梨形孢接種對香榧硒吸收和累積的影響，后期我們將對此進(jìn)行深入研究。

總之，印度梨形孢接種香榧幼苗可以增大其凈光合速率，促進(jìn)生物量累積，也促進(jìn)總硒在其葉片中的累積，因此，根內(nèi)生真菌印度梨形孢可以用于香榧果實硒的生物強(qiáng)化。

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Effects ofinoculation on root development, growth and selenium accumulation in leaves ofseedlings supplied with selenium fertilizer

LI Aihua1, XU Xiuhuan1, LI Jinzhu1, PU Yao2, WU Chu2

(1. Hubei Institute of Forestry, Wuhan 430075; 2. College of Horticulture & Gardening, Yangtze University, Jingzhou 434025)

In recent years, fruits ofenjoy great popularity, now, how to increase fruit yield and improve fruit quality, especially the concentrations of micronutrients in fruits are essential forcultivation. Selenium is the essential element for the biosynthesis of selenoproteins, and lack of it is related to some human diseases. In the present study,seedlings were planted in plastic pots, powder of selenium rock was applied in the cultivation substrate, and root endophytic funguswas inoculated withseedlings. The results showed the fungus could infect the roots ofseedlings, and the inoculation increased the total root length, surface areas, root volumes and the numbers of the first-order roots on the second-order roots by 12.69%, 16.26%, 20.81% and 10.93%, respectively. However, the inoculation did not affect the specific root length and root tissue densities ofseedling roots. The inoculation significantly increased the net photosynthesis rates, stomatal conductance, intercellular CO2concentrations and transpiration rates by 92.92%, 6.16 times, 47.67% and 2.36 times, respectively. And the inoculation significantly increased the light use efficiency (88.62%) and reduced the water use efficiency (84.28%). Compared with non-inoculated seedlings, inoculated seedlings showed significantly higher total biomass accumulation and total selenium concentrations in the leaves by 36.94% and 1.68 times, correspondingly. The result suggested that the root endophytic fungusmight be used in cultivation offor selenium biofortification in the fruits.

selenium;;; biofortification

S791.53

A

1672-352X (2022)05-0735-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20221111.020

2022-11-14 11:09:15

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20221111.1118.040.html

2021-12-15

湖北省林業(yè)科技支撐重點(diǎn)項目 (2016-LYKJ01)資助。

李愛華，研究員。E-mail：935284663@qq.com

吳 楚，博士，教授。E-mail：wuchu08@yangtzeu.edu.cn