張 森，檀 立，汪章勛，張立新，李 淼，檀根甲

丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的生物活性研究

張 森，檀 立，汪章勛，張立新，李 淼，檀根甲*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，合肥 230036)

丙硫菌唑是目前廣泛應(yīng)用的三唑類廣譜殺菌劑。為了明確其對(duì)水稻紋枯病菌的生物活性，采用生物測(cè)定的方法研究了丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的抑菌活性，應(yīng)用生理生化和分子生物學(xué)方法研究了丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的可溶性蛋白合成、麥角甾醇合成、 DNA 合成、菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化程度、菌絲細(xì)胞膜通透性以及水稻防御酶活性的影響。通過(guò)田間藥效試驗(yàn)研究了其防治紋枯病效果及對(duì)水稻的安全性。結(jié)果表明，丙硫菌唑?qū)?4株水稻紋枯病菌有較高的抑菌活性，平均EC50值為（1.062 9 ± 0.795 9）mg·L-1。沒(méi)有出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性群體，可以釆用菌株的平均EC50值作為水稻紋枯病菌對(duì)丙硫菌唑的敏感性基線。丙硫菌唑?qū)е虏【溄晴薮己拷档?，菌絲細(xì)胞滲透壓、菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化程度升高，DNA含量和可溶性蛋白含量隨降低。丙硫菌唑使POD、CAT、SOD和PAL 4個(gè)植物基礎(chǔ)防御酶活性升高，具有一定誘導(dǎo)抗病性。田間試驗(yàn)結(jié)果顯示4.8×105mg·L-1丙硫菌唑懸浮劑，每畝施用劑量為25、30和35 mL時(shí)，對(duì)水稻紋枯病的防治效果分別達(dá)90.40%、96.29%和98.17%，與對(duì)照試劑噻呋酰胺的防效相當(dāng)，且對(duì)水稻生長(zhǎng)安全。

丙硫菌唑；水稻紋枯病；生物活性；作用機(jī)制

由立枯絲核菌()引起的水稻紋枯病在我國(guó)發(fā)生嚴(yán)重，在缺少高抗紋枯病水稻品種時(shí)，農(nóng)業(yè)防治效果不明顯，而生物防治速效性低，易受環(huán)境因素影響。目前防治水稻紋枯病主要依賴于化學(xué)藥劑，但井岡霉素、噻呋酰胺等藥劑的使用會(huì)導(dǎo)致紋枯病菌產(chǎn)生抗藥性[1-2]。因此，從環(huán)境、食品安全的角度來(lái)看，探尋新的替代殺菌劑防治紋枯病將是今后的發(fā)展方向。丙硫菌唑（Prothioneazole）是由美國(guó)拜耳公司研發(fā)，并于2004 年在美國(guó)上市的三唑類廣譜殺菌劑，該類殺菌劑殺菌活性高，作用范圍廣，與環(huán)境相容性好，是目前廣泛應(yīng)用的一類殺菌劑[3]。丙硫菌唑?qū)π←満陀衩椎群瘫究谱魑锍Ｒ?jiàn)病害均有較好的防治效果[4-5]，但對(duì)水稻紋枯病菌的作用效果和作用機(jī)理尚鮮見(jiàn)系統(tǒng)研究。蛋白質(zhì)是水稻紋枯病菌的組成成分之一，若蛋白質(zhì)合成受到抑制，則可能影響能量代謝的某一部分，從而抑制菌絲的生長(zhǎng)。丙二醛是紋枯病菌菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，丙二醛含量增加會(huì)導(dǎo)致病原菌菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞病原菌菌體穩(wěn)定性。DNA 是水稻紋枯病菌的遺傳物質(zhì)，若DNA 含量減少，則削弱了病菌繁衍能力，降低了水稻紋枯病菌的數(shù)量，從而遏止了水稻紋枯病的發(fā)展。

紋枯病菌菌絲的電解質(zhì)相對(duì)外滲率反映出菌絲細(xì)胞膜的通透性，從而驗(yàn)證丙硫菌唑?qū)z細(xì)胞膜的影響。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成部分，能夠維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性、生物調(diào)控和三維結(jié)構(gòu)。構(gòu)成真菌細(xì)胞膜的甾醇是C-4去甲基麥角甾醇。病菌合成麥角甾醇的能力受到抑制，可導(dǎo)致真菌細(xì)胞的破裂和死亡。為了明確其對(duì)水稻紋枯病菌的生物活性，采用生物測(cè)定的方法研究了丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的抑菌活性，通過(guò)田間藥效試驗(yàn)研究了其防治紋枯病效果及對(duì)水稻的安全性；應(yīng)用生理生化和分子生物學(xué)方法研究了丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的可溶性蛋白合成、麥角甾醇合成、 DNA 合成、菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化程度、菌絲細(xì)胞膜通透性以及水稻防御酶活性的影響。研究旨在明確丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的作用機(jī)制，為水稻安全綠色生產(chǎn)和科學(xué)使用化學(xué)農(nóng)藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試水稻品種

徽兩優(yōu)996號(hào)，武運(yùn)粳31，安徽春澤種業(yè)有限公司提供。

1.2 供試菌株

94株水稻紋枯病菌（），由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供，是從安徽省15個(gè)縣市采集回來(lái)的病樣分離鑒定所得。

1.3 供試殺菌劑

98%丙硫菌唑原藥（用于室內(nèi)毒力測(cè)定），安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司；4.8×105mg·L-1丙硫菌唑懸浮劑(用于田間藥效試驗(yàn))，安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司；43%井崗霉素粗粉，上海農(nóng)樂(lè)生物制品股份有限公司；2.4×105mg·L-1噻呋酰胺懸浮液，日本日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。

1.4 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌株的敏感性測(cè)定

稱取丙硫菌唑原藥0.02 g，先用8 mL無(wú)水乙醇溶解，然后用蒸餾水定容到50 mL，配制成濃度為400 mg·L-1的母液。然后再用蒸餾水配制成不同濃度的的丙硫菌唑溶液備用。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定水稻紋枯病菌的毒力[6]。在無(wú)菌條件下，將配制好的濃度為5、10、20、40和80 mg·L-1的丙硫菌唑溶液各5 mL，分別加入到 45 mL PDA培養(yǎng)基中，混勻后分別倒3個(gè)平板。將平板培養(yǎng)3 d的紋枯病菌用無(wú)菌的5 mm的打孔器制成菌餅，接種于培養(yǎng)皿中央，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d。設(shè)置3次重復(fù)，以無(wú)菌水作為對(duì)照。2 d后用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑大小，對(duì)菌絲形態(tài)顯微鏡觀察，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用軟件DPS計(jì)算出EC50值。

用Excel軟件構(gòu)建94株紋枯菌株的敏感性分布圖，再根據(jù)EC50值的范圍，將其從高到低分為不同的濃度區(qū)間，統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)間內(nèi)的菌株數(shù)量，計(jì)算相應(yīng)的區(qū)間頻率。以EC50值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的頻率為縱坐標(biāo)，繪制頻率分布圖，并通過(guò)DPS軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。若繪制的頻率分布圖呈正態(tài)或擬正態(tài)分布，可將所有菌株對(duì)供試藥劑的EC50平均值作為水稻紋枯病菌對(duì)其的敏感基線。

1.5 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌蛋白質(zhì)合成的影響

將水稻紋枯病菌接種在含有不同濃度丙硫菌唑的 PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng) 4 d。將刮下的不同藥劑濃度處理菌絲各稱量 0.2 g加入到2 mL離心管，加入直經(jīng)5 mm和2 mm鋼珠各1個(gè)，再加入1.5 mL pH 7.0 磷酸鹽緩沖液，在冷凍混合球磨儀下研磨至糊狀，轉(zhuǎn)移到 10 mL離心管中并定容到10 mL，離心 15 min（4 ℃，4 000 r·min-1），吸取上清液備用。取上一步提取的各濃度藥劑處理的上清液即粗蛋白質(zhì)液 1 mL 加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，靜置反應(yīng) 2 min后，在595 nm條件下利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度[7-8]與牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較[7-8]。

1.6 丙硫菌唑?qū)Σ≡z脂質(zhì)過(guò)氧化程度影響

通過(guò)測(cè)定病原菌菌絲研磨液的 MDA 含量來(lái)了解丙硫菌唑?qū)Σ≡z脂質(zhì)過(guò)氧化程度影響，MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定。將病原菌接種至 PD 培養(yǎng)液中，于 28 ℃以 160 r·min-1搖培 3 d。將丙硫菌唑梯度濃度接種至 PD 培養(yǎng)基中，于 28 ℃以 200 r·min-1搖培 12 h，多次抽濾處理后收集菌絲。取0.05 g 菌絲，向其中加入 0.05 mol·L-1的Tris-HCl 溶液 2 mL，用冷凍混合球磨儀磨成勻漿，并將勻漿在4 ℃下12 000 r·min-1離心 20 min。吸取上清 1 mL 于新的2 mL離心管中，再加入0.5%硫代巴比妥酸 1 mL，放于沸水中 30 min，立即冰浴冷卻至0 ℃，再以0 ℃、4 000 r·min-1離心 10 min。使用紫外分光光度計(jì)分別于 450 nm、532 nm 和600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值）[7-8]。

MDA 濃度/(mmol·L-1) = 6.45 × (532﹣600) ﹣0.56450（1）

1.7 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病病菌DNA合成影響

水稻紋枯病菌菌絲的制備：將水稻紋枯病菌接種于系列濃度丙硫菌唑的 PDA 培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng) 3 d（28 ℃），將菌絲與培養(yǎng)基充分分離，60 ℃烘箱烘干菌絲備用。

DNA 的提取[7-8]：利用CTAB提取法提取菌絲中的DNA含量。

DNA濃度/(mg·L-1)=260÷(0.020×B) ×稀釋倍數(shù) （2）

式（2）中：B為比色皿的厚度；0.020為DNA含量為1 mg·L-1的溶液中的吸光度。

1.8 丙硫菌唑?qū)Σ【z細(xì)胞膜通透性的影響

在經(jīng)紫外滅菌20 min的操作臺(tái)中，將培養(yǎng)的菌株用已滅菌的打孔器打下大小相同，長(zhǎng)勢(shì)均勻的菌片（5 mm），每 90 mL PD培養(yǎng)液接種 5 片菌片，28 ℃、120 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng) 24 h，將不同濃度的丙硫菌唑溶液各10 mL加入后繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，漏斗上放置濾紙片過(guò)濾菌絲，每處理設(shè)3次重復(fù)，通風(fēng)櫥晾干菌絲備用。稱取晾干菌絲樣品0.2 g放入2 mL離心管中，放入真空干燥器，用抽氣機(jī)抽氣7 ～ 8 min以抽出細(xì)胞間隙中的空氣；加入大小鋼珠各1個(gè)（直徑5 和2 mm）和1.5 mL 無(wú)菌水，在冷凍混合球磨儀下研磨直至糊狀；轉(zhuǎn)入50 mL離心管定容到20 mL，靜置20 min，輕輕地?cái)噭?dòng)，然后使用電導(dǎo)儀測(cè)量電導(dǎo)率。測(cè)過(guò)電導(dǎo)率之后，再使用沸水加熱15 min，達(dá)到殺死病菌組織的目的，流水冷卻10 min，在室溫下測(cè)電導(dǎo)率，最終求得電解質(zhì)相對(duì)外滲率[9]。

電解質(zhì)相對(duì)外滲率/% = (處理電導(dǎo)率/煮沸電導(dǎo)率)×100 （3）

1.9 丙硫菌唑?qū)Σ【溄晴薮己铣傻挠绊?/h3>

水稻紋枯病菌在 PDA 培養(yǎng)基上活化 3 d，用直徑5 mm打孔器打取相同大小、長(zhǎng)勢(shì)均勻的菌塊接種于 90 mL PDB培養(yǎng)液中，每個(gè)處理6個(gè)菌塊，150 r·min-1，28 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d。加入系列濃度的丙硫菌唑，每個(gè)處理重復(fù) 3 次，設(shè)無(wú)菌水對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng) 2 d，放置濾紙片于漏斗上，完全濾去菌絲中的培養(yǎng)液，60 ℃下烘干菌絲備用。分別稱取不同藥劑濃度處理下的菌絲各 0.2 g 進(jìn)行皂化反應(yīng)[9]：將干燥的菌絲粉碎后放在50 mL離心管并加入 20 mL 乙醇溶液和10 mL 50% KOH 溶液，密封，劇烈振搖后在80 ℃下皂化120 min。第1個(gè)30 min內(nèi)，每10 min 搖 1 次，然后每30 min振搖 1 次。趁熱加入 10 mL水，用 5 mL 正己烷振搖提取 1 次，再加正己烷振搖提取 2 次，每次5 mL，合并正己烷液75 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到沉淀物質(zhì)，用適量異丙醇溶解所得沉淀后在 5 mL 離心管中定容，使用0.45 μm規(guī)格的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，0 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。在設(shè)定的色譜條件下，分別測(cè)定不同樣品中的麥角甾醇的峰面積，計(jì)算麥角甾醇在菌絲中的含量[8, 10]。

1.10 丙硫菌唑?qū)λ痉烙富钚缘挠绊?/h3>

以不同藥劑濃度處理下第1、第3和第7 天的水稻葉片為材料，采用分光光度計(jì)法測(cè)定噴施藥劑后不同時(shí)間點(diǎn)的水稻組織內(nèi)的防御酶活性的變化，設(shè)無(wú)菌水為陽(yáng)性對(duì)照，100 mg·L-1的井崗霉素為對(duì)照藥劑，比較丙硫菌唑與對(duì)照藥劑之間以及其不同濃度間的差異，初步了解防御酶活性與丙硫菌唑之間的關(guān)系。

將水稻種子用0.5%的KMnO4溶液浸泡12 h，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗2～3次，將種子放在濕潤(rùn)的墊有無(wú)菌紗布的培養(yǎng)皿中黑暗培養(yǎng)2 d，待種子冒出白芽后放于口徑21 cm、高13 cm的裝有營(yíng)養(yǎng)土與基質(zhì)土等量混合的培養(yǎng)種植盆中，等到水稻苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)用于下一步試驗(yàn)。

試驗(yàn)設(shè)置7個(gè)處理組，每個(gè)處理25 株稻苗，設(shè)3次重復(fù)。處理 1、2、3、4和5分別為0.5、1、2、4和8 mg·L-1的丙硫菌唑，處理6為無(wú)菌水，處理7為井崗霉素100 mg·L-1。7個(gè)處理溶液對(duì)水稻植株進(jìn)行均勻的噴施，分別取在處理后1、3和7 d的水稻植株相同部位的葉片，用于CAT、POD、SOD和PAL活性的測(cè)定[11]。

取上述樣品 0.2 g 于液氮預(yù)冷的2 mL離心管中，加入 1.5 mL 0.05 mol·L-1（pH=7.8）PBS 和適量 1%（）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），加入大小鋼珠各一個(gè)（5 和2 mm），在冷凍混合球磨儀下研磨直至勻漿后，4 ℃低溫 8 000 r·min-1離心 20 min 后，取 1 mL 上清液于新的離心管中 4 ℃冰箱保存，上清液即為酶提取液。

1.11 丙硫菌唑防治水稻紋枯病田間效果

試驗(yàn)在廬江縣萬(wàn)山鎮(zhèn)永橋村劉傳應(yīng)戶水稻田中進(jìn)行。本試驗(yàn)田前茬為早稻，本茬水稻2018年6月30日播種，7月30日拋栽，每畝大田用種量7.5 kg。水稻品種為武運(yùn)粳31，試驗(yàn)藥劑為4.8×105mg·L-1丙硫菌唑懸浮劑，劑量每畝分別為25、30和35 mL。對(duì)照藥劑為2.4×105mg·L-1噻呋酰胺懸浮劑，劑量為每畝20 mL，設(shè)清水對(duì)照。小區(qū)面積30 m2；重復(fù)4次。水稻分蘗末期至幼穗分化期第一次施藥，孕穗期第二次施藥。使用容量為每畝30 L，均勻噴霧。第2次施藥后7和14 d，進(jìn)行藥效調(diào)查。采取對(duì)角線取樣法，每小區(qū)取樣5點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查相連5叢，每小區(qū)調(diào)查25叢，記錄總株數(shù)、病株數(shù)，并按9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查分級(jí)，計(jì)算病株率、病情指數(shù)和防治效果，評(píng)價(jià)推薦劑量下對(duì)水稻的安全性。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的毒力及菌株的敏感性

結(jié)果表明，不同濃度殺菌劑對(duì)94株水稻紋枯病菌的毒力有明顯差異。EC50值最大值與最小值相差34.21倍，其中菌株AHGD1對(duì)丙硫菌唑的敏感性較強(qiáng)，EC50值為 0.136 5 mg·L-1。菌株AHFT6對(duì)丙硫菌唑的敏感性較差， EC50值為 4.669 2 mg·L-1(圖1)。這些菌株的平均EC50值為（1.062 9 ± 0.795 9）mg·L-1。94株水稻紋枯病菌對(duì)丙硫菌唑的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線，接近正態(tài)分布?？梢钥闯鏊鶞y(cè)菌株對(duì)丙硫菌唑的EC50值分布主要集中在0.5～1 mg·L-1這一區(qū)間內(nèi)。沒(méi)有出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性群體，因此，這些菌株均為丙硫菌唑敏感菌株，可以釆用這些菌株的平均EC50值（1.062 9 ± 0.795 9）mg·L-1作為該地區(qū)水稻紋枯病菌對(duì)丙硫菌唑的敏感性基線。

圖1 94株水稻紋枯病菌的EC50值分布

Figure 1 EC50distribution of 94 strains of rice sheath blight fungi

2.2 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的作用機(jī)制

2.2.1 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌菌絲的影響 將紋枯病菌在室內(nèi)培養(yǎng)3 d后，用倒置顯微鏡觀察。結(jié)果表明，在不含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的CK菌絲分叉多，而且菌絲交聯(lián)程度大；隨著丙硫菌唑藥劑濃度的提高，菌絲的分叉減少，菌絲分叉間隔變大，交聯(lián)程度降低（圖2）。

2.2.2 丙硫菌唑?qū)Σ【?DNA 合成的影響 丙硫菌唑不同濃度處理的水稻紋枯病病菌菌絲 DNA 含量差異顯著，且藥劑處理的菌株DNA 含量均低于對(duì)照（圖3）。丙硫菌唑處理后菌絲中 DNA 含量隨藥劑濃度的遞增呈減少趨勢(shì)，在藥劑濃度為4 mg·L-1含量最低。DNA 含量的減少，削弱了病菌繁衍能力，降低了水稻紋枯病菌的數(shù)量，從而遏止了水稻紋枯病的發(fā)展。

2.2.3 丙硫菌唑?qū)Σ【扇苄缘鞍缀铣傻挠绊?結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，經(jīng)過(guò)丙硫菌唑處理的水稻紋枯病菌菌的可溶性蛋白含量都有所降低，且隨著濃度的增加，病菌可溶性蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖4）。各濃度丙硫菌唑?qū)Σ【目扇苄缘鞍缀铣捎绊懶Ч町愋燥@著（< 0.05）。

圖中A、B、C、D、E、F分別表示無(wú)菌水對(duì)照、0.5、1、2、4和8 mg·L-1。

Figure 2 Morphology of mycelium under different concentration of agents

圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0.05）。下同。

Figure 3 Differences of DNA synthesis in mycelia under different concentrations of agents

2.2.4 丙硫菌唑?qū)Σ【z脂質(zhì)過(guò)氧化程度的影響

丙硫菌唑處理后紋枯病菌的 MDA 含量始終高于未用丙硫菌唑處理的 MDA 含量，且差異顯著，并且隨著丙硫菌唑濃度的提高，菌絲中MDA的含量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。CK處理的 MDA 含量最低，丙硫菌唑處理后提高了病菌菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的含量會(huì)導(dǎo)致病原菌菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化。說(shuō)明丙硫菌唑處理后立枯絲核菌菌絲的脂質(zhì)過(guò)氧化程度顯著升高，會(huì)增加菌體氧化程度，破壞病原菌菌體穩(wěn)定性（圖5）。

圖4 不同藥劑濃度下菌絲可溶性蛋白含量的差異

Figure 4 The content difference of soluble protein in mycelium under different concentration of agents

Figure 5 Differences of MDA content in mycelia under different concentrations of agents

2.2.5 丙硫菌唑?qū)Σ【z細(xì)胞膜通透性的影響

由電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果（表1）可知，隨著藥劑濃度的增加，菌絲的電解質(zhì)相對(duì)外滲率呈遞增趨勢(shì)。電解質(zhì)相對(duì)外滲率反映了菌絲電解液泄漏的能力，決定著菌絲破損的嚴(yán)重程度。表明丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌細(xì)胞膜有損傷效果, 且損傷程度隨著處理藥劑濃度的增大而增加。

表1 不同藥劑濃度處理下水稻紋枯病菌菌絲的破損差異

2.2.6 丙硫菌唑?qū)Σ【溄晴薮己铣傻挠绊?不同濃度的丙硫菌唑處理的水稻紋枯病菌絲中的麥角甾醇的含量可以通過(guò)峰面積的大小來(lái)反映。峰面積越大，麥角甾醇含量越高。如表2所示，經(jīng)藥劑處理后，水稻紋枯病菌絲合成麥角甾醇的能力得到有效抑制，且抑制效果隨丙硫菌唑濃度的提高呈遞增趨勢(shì)。在藥劑濃度為4 mg·L-1時(shí)，抑制率可達(dá)30.97%。

表2 不同濃度藥劑處理后水稻紋枯病菌菌絲麥角甾醇的含量

2.2.7 丙硫菌唑?qū)λ炯闹鞣烙傅挠绊?結(jié)果表明(圖6），施藥后第1天 CAT 、SOD和POD活性在藥劑濃度為1 mg·L-1處理達(dá)到第1次峰值，隨后活性隨著藥劑濃度提高開(kāi)始輕微下降后再次呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)；PAL活性在藥劑濃度為0.51 mg·L-1時(shí)最低，之前隨藥劑濃度的提高而遞增，在藥劑濃度為2 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值，之后隨濃度升高再度下降。藥后第3 天，CAT活性在0.5 mg·L-1時(shí)最低，然后隨著藥劑濃度的提高，活性呈遞增趨勢(shì)，在藥劑濃度為4 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值；SOD活性隨藥劑濃度提高呈遞增趨勢(shì)，在2 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值；POD活性在0.5 mg·L-1時(shí)最高，然后隨著藥劑濃度提高呈遞減趨勢(shì)；PAL活性在藥劑濃度為1 mg·L-1時(shí)最小，然后隨著藥劑濃度增加呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。藥后第7 天，CAT活性在0.5 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值，而后呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)；SOD活性隨藥劑濃度提高而表現(xiàn)出遞增趨勢(shì)；POD和PAL活性隨著藥劑濃度增加顯現(xiàn)出遞減趨勢(shì)。綜上所述，CAT活性在1 mg·L-1丙硫菌唑誘導(dǎo)水稻后第1 天時(shí)最高；POD和SOD活性在藥后第3 天藥劑濃度高于8 mg·L-1時(shí)呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)；PAL活性在藥劑處理第1天活性最好且濃度為2 mg·L-1活性最高，然后活性隨著時(shí)間的推移而降低?？傮w而言，在藥劑濃度作用下，酶活性均呈現(xiàn)較好的狀態(tài)。與井崗霉素相比，丙硫菌唑表現(xiàn)出誘導(dǎo)抗性能力強(qiáng)于井崗霉素（< 0.05）。

(A: SOD；B: CAT；C: POD；D: PA；CK代表空白對(duì)照。0.5、1、2、4和8 mg·L-1代表不同的丙硫菌唑懸浮劑藥劑濃度；陽(yáng)性對(duì)照為100 mg·L-1的井崗霉素粗粉）。

Figure 6 Effects of different pesticide concentrations on the activities of CAT, SOD, POD and PAL in rice

表3 丙硫菌唑防治水稻紋枯病的田間效果

2.3 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病田間防治效果

結(jié)果表明，兩次防治后病株率和病情指數(shù)的防治效果均大于90％，與噻呋酰胺的防效相當(dāng)，說(shuō)明丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病的防治有較好的效果，且中、高劑量處理對(duì)水稻紋枯病防治效果顯著高于低劑量處理（表3）。

3 討論與結(jié)論

3.1 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的敏感性和紋枯病的防效

丙硫菌唑?qū)?4株水稻紋枯病菌有較高的抑菌活性，其中丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌AHGD1的抑制效果最好，EC50值為 0.136 5 mg·L-1。丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌AHFT6的抑制效果較差 EC50值為 4.669 2 mg·L-1。這些菌株的平均EC50值為（1.062 9±0.795 9）mg·L-1。94株菌株的均為丙硫菌唑敏感菌株，可以釆用這些菌株的平均EC50值（1.062 9 ± 0.795 9）mg·L-1作為該地區(qū)水稻紋枯病菌對(duì)丙硫菌唑的敏感性基線。菌株之間的EC50值最大相差將近35倍，推測(cè)防效較差的稻區(qū)可能與其是否施用過(guò)此藥劑或?qū)е陆换タ剐缘乃巹┓N類有關(guān)。田間藥效試驗(yàn)表明，4.8×105mg·L-1丙硫菌唑懸浮劑，每畝施用劑量為25、30和35 mL時(shí)，對(duì)水稻紋枯病均的防治效果分別達(dá)90.40%、96.29%和98.17%，且對(duì)水稻生長(zhǎng)安全。施用劑量為25和30 mL的防治效果存在顯著性差異，說(shuō)明在合理用藥的同時(shí)，高劑量的丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病的防治效果更顯著，這與吳雙[8]研究所得結(jié)論一致。劉保友等[12]研究表明，三唑類殺菌劑之間具有交互抗性。因此，在使用丙硫菌唑時(shí)，應(yīng)注意與其他不同作用機(jī)制的藥劑輪換或者復(fù)配使用，從而避免水稻紋枯病菌對(duì)其產(chǎn)生抗性，可延長(zhǎng)丙硫菌唑使用年限。

3.2 丙硫菌唑?qū)λ炯y枯病菌的作用機(jī)制

生理生化測(cè)定結(jié)果表明，丙硫菌唑?qū)е虏【溄晴薮己拷档?，菌絲細(xì)胞滲透壓、菌絲脂質(zhì)過(guò)氧化程度升高，DNA含量和可溶性蛋白含量隨降低。丙硫菌唑使POD、CAT、SOD和PAL 4個(gè)植物基礎(chǔ)防御酶活性升高。丙硫菌唑可能是通過(guò)抑制麥角甾醇的生物合成，破壞細(xì)胞膜流動(dòng)性，達(dá)到了殺菌效果，從而可能會(huì)影響部分能量代謝過(guò)程，導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)濃度的微小變化。而且，麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成部分，能夠維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性、生物調(diào)控和三維結(jié)構(gòu)。構(gòu)成真菌細(xì)胞膜的甾醇是C-4去甲基麥角甾醇。雖然與其他三唑類藥物一樣，丙硫硝唑通過(guò)抑制了病菌合成麥角甾醇的能力，導(dǎo)致真菌細(xì)胞的破裂和死亡。通過(guò)對(duì)病菌MDA含量和細(xì)胞膜通透性測(cè)定也證明了病菌的細(xì)胞膜受到藥劑破壞。因此，丙硫菌唑的治療效果主要是通過(guò)抑制水稻紋枯病菌甾醇的合成，細(xì)胞膜受到破壞，致使病菌裂解死亡，喪失致病能力。施藥后寄主防御酶在水稻植株體內(nèi)的活性都顯著提高，表明丙硫菌唑具有一定的誘導(dǎo)抗性能力，從而提高田間防治效果。

丙硫菌唑的作用機(jī)理是抑制真菌中甾醇的脫甲基化作用，即脫甲基化抑制劑（DMIs）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)病菌的抑制。丙硫菌唑內(nèi)吸活性較好，能夠兼顧實(shí)現(xiàn)對(duì)作物的保護(hù)與治療作用，而且藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)作物十分安全并能夠促進(jìn)作物增產(chǎn)[13]。

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Study on the bioactivity of prothionazole tocaused by rice sheath blight

ZHANG Sen, TAN Li, WANG Zhangxun, ZHANG Lixin, LI Miao, TAN Genjia

(School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

Prothioneazole is a broad-spectrum triazole fungicide at present. In order to clear out the bioactivity of prothionazole tocaused by rice sheath blight, the mechanism of action of prothioneazole was preliminarily confirmed by determining the contents of DNA, MDA, ergosterol and protein in the hyphae of, and the changes of defense enzyme activities in rice, the osmotic pressure of mycelial cells and mycelial lipid peroxidation were studied with the method of physiology, biochemistry and molecular biology. The control effects of prothionazole on rice sheath blight were studied by a field experiment and bioassay. The results showed that prothionazole had high antifungi activity against 94 strains of rice sheath blight, and the average EC50value (1.062 9 ± 0.795 9) mg·L-1of these strains could be used as the baseline of the sensitivity of rice sheath blight fungi to prothioxazole in this area. The changes in DNA, soluble protein and ergosterol contents in the hyphae oftreated with different concentrations of prothioconazole showed that prothioconazole would lead to the reduction of sterols content, the increase of the osmotic pressure of mycelial cells and degree of the mycelial lipid peroxidation, and the decrease of DNA and soluble protein contents. The activities of POD, CAT, SOD and PAL showed an increasing trend under the action of a series of insecticides, and they had certain inductive disease resistance. The results of field efficacy experiment showed that prothionazole suspension at the dosage of 25, 30 and 35 mL per mu in the concentration of 4.8×105mg·L-1had good control effect on rice sheath blight, reaching 90.40%, 96.29% and 98.17%, respectively, and the control effects were similar to those of the control agent, thiofuramide. The safety evaluation of prothionazole on rice showed that different concentrations of prothionazole had no significant effect on the normal rice growth.

prothionazole; rice sheath blight; bioassay; mechanism

S435.111.42; S482.2

A

1672-352X (2022)05-0700-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20221111.009

2022-11-14 10:56:07

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20221111.1112.018.html

2021-10-29

安徽省科技重大專項(xiàng)（201903b020008），省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（1804a07020139）和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0200806)共同資助。

張 森，碩士研究生。E-mail：1273391902@qq.com

檀根甲，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：tgj63@163.com