李大林黃六蓮，2陳禮輝，2羅小林，2，3劉 婧，2，

（1.福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院，福建福州，350002；2.植物纖維功能材料國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州，350002；3.南京林業(yè)大學(xué)江蘇省制漿造紙科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京，210037）

盡管化石燃料（如汽油和柴油等）促進(jìn)了人類社會(huì)的快速發(fā)展，但其也在全球范圍內(nèi)引發(fā)一系列環(huán)境問題［1-2］?；诳稍偕⒘畠r(jià)及來源豐富等特性，木質(zhì)生物質(zhì)已成為制備燃料化學(xué)品的理想原材料［3-6］。酶水解和發(fā)酵可將木質(zhì)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料化學(xué)品（如乙醇或丁醇）。但在酶水解前，通常需采用物理或化學(xué)預(yù)處理來突破木質(zhì)生物質(zhì)致密結(jié)構(gòu)對(duì)酶的抗降解屏障［7］。盡管現(xiàn)有預(yù)處理方法（如熱水、稀酸、稀堿、氨纖維爆破、亞硫酸鹽、離子液體或低溫共溶劑等）可在一定程度上破壞木質(zhì)生物質(zhì)的致密結(jié)構(gòu)，提高預(yù)處理固體基質(zhì)中纖維素對(duì)酶的可及性，但預(yù)處理（特別是酸法預(yù)處理）也會(huì)促使細(xì)胞壁內(nèi)木質(zhì)素發(fā)生解聚、移位、縮合和反沉積。研究發(fā)現(xiàn)，沉積木質(zhì)素可對(duì)纖維素酶組分產(chǎn)生嚴(yán)重的無效吸附［8］。這種無效吸附不僅使酶水解液中有效作用于纖維素的酶分子減少，而且也會(huì)影響部分酶組分的活力，導(dǎo)致預(yù)處理固體基質(zhì)中酶水解效率下降。為獲得較高的纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率，纖維素酶用量則隨之增加。因商品纖維素酶價(jià)格昂貴，這導(dǎo)致酶水解過程中的酶成本達(dá)到纖維素燃料乙醇整體生產(chǎn)成本的30%~50%?？梢姡举|(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附已成為嚴(yán)重制約纖維素基燃料化學(xué)品產(chǎn)業(yè)（如燃料乙醇等）發(fā)展的技術(shù)瓶頸［7-10］。

除對(duì)酶分子進(jìn)行改造和對(duì)木質(zhì)素分子進(jìn)行化學(xué)修飾外，研究者主要通過向酶水解液中添加屏蔽劑（如牛血清蛋白［11］、聚乙烯醇［12］或Mg2+等［13］）來克服木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的不利影響。然而，因木質(zhì)素和纖維素酶間作用機(jī)制較為復(fù)雜，現(xiàn)已開發(fā)的木質(zhì)素屏蔽劑存在成本較高（如牛血清蛋白）［10，14］或影響后續(xù)發(fā)酵微生物活性及發(fā)酵液后處理效率等缺陷［15］?？梢姡_定木質(zhì)素與纖維素酶間相互作用機(jī)制是合理開發(fā)新型木質(zhì)素屏蔽劑、減少木質(zhì)素對(duì)酶無效吸附以及降低燃料乙醇生產(chǎn)成本的重要理論基礎(chǔ)。因此，除簡(jiǎn)要介紹木質(zhì)素及纖維素酶物化特性外，本文重點(diǎn)概述木質(zhì)素與纖維素酶間相互作用、兩者相互作用的表征以及木質(zhì)素屏蔽劑緩解木質(zhì)素對(duì)纖維素酶不利影響的研究進(jìn)展。

1 木質(zhì)素和纖維素酶的物化特性

盡管預(yù)處理方法及其劇烈程度均對(duì)殘余木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)產(chǎn)生不同影響（見表1），但預(yù)處理過程中木質(zhì)素主要發(fā)生解聚（如β-O-4和α-O-4芳基醚鍵斷裂等）和縮合（如β-β′、5-O-4′、5-5′等連接結(jié)構(gòu)的形成）兩類反應(yīng)。因此，基于前期研究［16-33］，預(yù)處理后殘余木質(zhì)素分子中可與纖維素酶發(fā)生作用的官能團(tuán)主要包括：①非離子化基團(tuán)，如酚羥基、脂肪羥基和苯基等；②離子化基團(tuán)，如—COOH和—SO3H等。

表1 不同預(yù)處理殘余木質(zhì)素的物理化學(xué)特性Table 1 Physicochemical properties of residual lignin from different pretreatments

為提高協(xié)同催化效率，商品纖維素酶通常含有多種組分，主要包括外切葡聚糖酶（CBH）Ⅰ~Ⅱ型、內(nèi)切葡聚糖酶（EG）Ⅰ~Ⅴ型、β-葡萄糖苷酶（β-G）Ⅰ型等（見表2）［8，23］。由表2可知，除相對(duì)分子質(zhì)量外，不同酶組分的等電點(diǎn)（pI）也不同，即在特定pH值（如pH值為5的醋酸-醋酸鈉）的緩沖液中，不同酶組分表面電荷特性不同（如CBHⅠ、EGⅠ和EGⅤ帶正電，其他組分帶負(fù)電）。同時(shí)，不同酶組分的疏水性也不同，里氏木霉（T.reesei）和黑曲霉（A.niger）代謝產(chǎn)生的纖維素酶組分按照疏水性由高到低的次序?yàn)椋篍GⅣ>EGⅤ>CBHⅡ>β-GⅠ>EGⅡ>EGⅢ>EGⅠ>CBHⅠ。

表2 纖維素酶組分的物理化學(xué)特性Table 2 Physicochemical properties of cellulase components

基于木質(zhì)素和纖維素酶組分的物理化學(xué)特性，大量研究表明，木質(zhì)生物質(zhì)預(yù)處理后殘余木質(zhì)素可對(duì)纖維素酶產(chǎn)生顯著的無效吸附。無效吸附造成的不利影響主要包括兩方面：①木質(zhì)素對(duì)纖維素酶產(chǎn)生無效吸附后，部分纖維素酶無法脫附，致使酶水解液中有效酶濃度顯著降低；②被吸附的部分纖維素酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，即便發(fā)生脫附，酶分子也會(huì)失去其催化活性。因此，除孔隙結(jié)構(gòu)、半纖維素含量及纖維素本身特性外，固體基質(zhì)內(nèi)外表面殘余木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附已被證實(shí)為影響纖維素酶水解效率的最重要因素之一［6，8，21-22］。

2 木質(zhì)素與纖維素酶間的相互作用

為減少殘余木質(zhì)素的無效吸附對(duì)酶水解過程的不利影響，大量研究從不同角度揭示木質(zhì)素與纖維素酶間的相互作用機(jī)制?；谇捌趫?bào)道，木質(zhì)素與纖維素酶間的相互作用可總結(jié)為：①靜電作用，即纖維素酶帶電官能團(tuán)和木質(zhì)素帶電官能團(tuán)間可發(fā)生靜電吸引或排斥作用；②疏水作用，即纖維素酶外層氨基酸殘基上烷基碳鏈與木質(zhì)素上苯基或聯(lián)苯基團(tuán)間發(fā)生疏水作用；③氫鍵作用，即纖維素酶外層氨基酸殘基上極性非電離基團(tuán)（—OH、—COOH和—C（＝O）—NH2等）與木質(zhì)素的羥基和羧基發(fā)生氫鍵作用；④離子-π作用，即纖維素酶組分中氨基酸殘基基團(tuán)（如—NH3+）與木質(zhì)素芳基基團(tuán)（苯基和聯(lián)苯基等）產(chǎn)生的離子-π作用（見圖1）。因此，下述將從這4個(gè)方面來闡述木質(zhì)素與纖維素酶間相互作用的研究進(jìn)展。

2.1 靜電作用

根據(jù)前述研究［16，23-24，26-28］，木質(zhì)素與纖維素酶間的靜電作用可產(chǎn)生2種效應(yīng)：①靜電吸引引發(fā)纖維素酶組分的無效吸附或失活，降低酶水解效率；②靜電排斥減少木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附，提高酶水解效率。

前期研究［15］發(fā)現(xiàn)，在pH值為5的酶水解緩沖體系中，帶正電的纖維素酶組分（如β-GⅠ（pI≈8）、EGⅢ（pI=6.8~7.4）和CBHⅡ（pI=5.2~5.9）可與帶負(fù)電的木質(zhì)素產(chǎn)生無效吸附。Fritz等［25］發(fā)現(xiàn)，相同酶水解條件下，因楓木硫酸鹽未漂漿中木質(zhì)素表面靜電荷高于楓木磨木木質(zhì)素，前者對(duì)纖維素酶的吸附量比后者高20%。Kellock等［24］也報(bào)道了類似的現(xiàn)象。然而，將酶水解緩沖液pH值從常規(guī)的4.8~5.0調(diào)至5.2~6.2后，Lan等［26］發(fā)現(xiàn)，SPORL預(yù)處理固體基質(zhì)（楊木和松木等）中纖維素的酶水解轉(zhuǎn)化率提高約20%。這主要是由于，提高緩沖液的pH值后，纖維素復(fù)合酶和SPORL預(yù)處理固體基質(zhì)中木質(zhì)素的Zeta電位均為負(fù)值，兩者間靜電排斥作用隨緩沖液pH值的升高而不斷增強(qiáng)，無效吸附相應(yīng)減弱。同時(shí)，相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)［27-30］也相繼提出，增加木質(zhì)素所帶負(fù)電荷有利于降低其對(duì)纖維素酶的無效吸附，進(jìn)而提高固體基質(zhì)中纖維素的酶水解效率。

總體而言，靜電排斥對(duì)預(yù)處理固體基質(zhì)中纖維素酶水解效率的促進(jìn)作用較為有限（<30%）［26-27］。由此可推測(cè)，在特定pH值的酶水解緩沖體系中，木質(zhì)素非帶電基團(tuán)（如苯基和酚羥基等）與纖維素酶特征基團(tuán)間可能還存在其他類型的相互作用（見圖1）。

圖1 木質(zhì)素與纖維素酶間存在的離子和非離子-π作用Fig.1 Ionic-and non-ionic-π interactions between lignin and cellulase

2.2 疏水作用

部分研究［32-35］認(rèn)為，木質(zhì)素芳基基團(tuán)（如苯基和聯(lián)苯基團(tuán)等）與纖維素酶外層氨基酸殘基上烷基基團(tuán)（如亮氨酸烷基基團(tuán)等）間的疏水作用是導(dǎo)致木質(zhì)素?zé)o效吸附的最主要因素。例如，Lai等［32］發(fā)現(xiàn)，因針葉木木質(zhì)素的疏水性高于闊葉木木質(zhì)素，前者對(duì)纖維素酶的吸附力高于后者?；诜蛛x5種木質(zhì)生物質(zhì)（棉花、黑柳、白楊、桉樹和火炬松）中木質(zhì)素的研究，Huang等［33］發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素的疏水性越高，其對(duì)纖維素酶水解效率的抑制作用也越強(qiáng)。Qin等［36］對(duì)原子力顯微鏡（AFM）探針分別進(jìn)行聚苯乙烯（PS）微球、羥基化或羧基化修飾，使探針具有相應(yīng)的疏水或親水性質(zhì)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PS微球修飾探針對(duì)纖維素酶的吸附力比其他2種修飾探針分別高13%和43%，進(jìn)而推測(cè)木質(zhì)素芳基基團(tuán)與纖維素酶分子烷基基團(tuán)間的疏水作用是2種大分子間最主要的作用力。然而，除烷基基團(tuán)外，纖維素酶外層氨基酸殘基上也可能含有芳香基團(tuán)（如苯丙氨酸的苯基以及部分氨基酸殘基上的吲哚基團(tuán)等），其也可能與木質(zhì)素芳基基團(tuán)產(chǎn)生π-π堆積作用［37］，該作用力對(duì)疏水作用的貢獻(xiàn)有待驗(yàn)證。

與上述研究結(jié)果不同的是，Kellock等［24］發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素對(duì)EGⅠ的吸附量顯著高于CBHⅡ，但EGⅠ的疏水指數(shù)（-0.37）明顯低于CBH II（-0.12）（見表2）。這可能是由于，盡管CBH II的疏水性高于EG I，但EG I氨基酸殘基上的苯丙氨酸（Phe）的數(shù)量高于前者?；贜eel等［38］對(duì)π-π堆積效應(yīng)的系統(tǒng)論述，Gusakov等［23］證明，芳香性物質(zhì)間的π-π堆積效應(yīng)可強(qiáng)化其疏水作用。基于理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，Sinnokrot等［39］和Krenske等［40］也分別發(fā)現(xiàn)，芳香性化合物（苯-苯和苯-咪唑等）分子間存在π-π堆積效應(yīng)，其可能對(duì)疏水作用產(chǎn)生較大貢獻(xiàn)。對(duì)于纖維素酶而言，Yama‐guchi等［41］發(fā)現(xiàn)，通過基因編輯等手段將酶分子多肽鏈中部分Phe（含殘余苯基）替換為異亮氨酸（Ile，含殘余異丁基）后，其催化活性不變，但對(duì)木質(zhì)素的吸附量顯著降低。由此，該研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)，基因編輯可降低多肽鏈中Phe苯基與木質(zhì)素苯基間的π-π堆積效應(yīng)，進(jìn)而弱化兩者間的疏水作用。因此，π-π堆積對(duì)增強(qiáng)木質(zhì)素與纖維素酶間疏水作用的機(jī)制仍有待深入探索。

2.3 氫鍵作用

根據(jù)現(xiàn)有研究，木質(zhì)素與纖維素酶間的氫鍵作用主要體現(xiàn)在前者的羥基（酚羥基和脂肪羥基）與后者的羥基和酰胺基間的相互作用。然而，木質(zhì)素酚羥基和脂肪羥基對(duì)此種氫鍵作用的影響程度不同。

相關(guān)研究［16，20］先后證實(shí)，隨著酸法預(yù)處理（LHW和DA等）劇烈程度的提高，盡管固體基質(zhì)中半纖維素去除率顯著提高，其孔隙率也相應(yīng)提高，但木質(zhì)素降解后縮合程度也不斷提高，即便在高纖維素酶用量條件下，固體基質(zhì)中纖維素的酶水解效率也難以再提高［42-44］。Sewalt等［45］推測(cè)，這主要是由木質(zhì)素中酚羥基含量增加所致，其可能通過氫鍵作用加劇對(duì)纖維素酶組分的無效吸附。Yu等［21］和Sun等［22］將木質(zhì)素上酚羥基含量和脂肪羥基含量與纖維素酶的吸附量以及酶水解效率進(jìn)行定量關(guān)聯(lián)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維素酶無效吸附量隨木質(zhì)素酚羥基含量的提高而不斷增加，酶水解效率則隨之不斷下降。由此，這些研究者推測(cè)，木質(zhì)素酚羥基與纖維素復(fù)合酶間的氫鍵作用力高于脂肪羥基與纖維素復(fù)合酶間的此種作用力。為驗(yàn)證此結(jié)論，Yang等［31］對(duì)木質(zhì)素酚羥基進(jìn)行羥丙基化修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素對(duì)純纖維素酶水解效率的抑制作用大幅降低（由70%降至15%），進(jìn)而推測(cè)由酚羥基介導(dǎo)的氫鍵作用是木質(zhì)素與纖維素酶間最主要的作用力。

2.4 離子-π作用

Dougherty［46］基于理論計(jì)算首次發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子（如Li+和K+等）與芳香性化合物（如苯和苯丙氨酸等）間存在陽(yáng)離子-π作用。隨后Lu等［47］證實(shí)，基于納米力學(xué)分析，在液相環(huán)境（pH值3.0的乙酸溶液）中，帶正電的聚賴氨酸（P-Lys，殘余—NH3+）與芳香性聚色氨酸（P-Trp，殘余吲哚基）間存在陽(yáng)離子-π作用。

根據(jù)Ko等［16］和Kellock等［24］的研究，在pH值為5.0的緩沖體系中，CBH I和EG I等纖維素酶組分均含有帶正電的氨基酸殘基基團(tuán)（如—NH3+）。理論上，這些帶正電基團(tuán)可與木質(zhì)素芳基基團(tuán)（苯基和聯(lián)苯基等）產(chǎn)生陽(yáng)離子-π作用。早期，研究者推測(cè)，陽(yáng)離子-π作用有利于促進(jìn)木質(zhì)素與陽(yáng)離子聚合物（聚二烯丙基二甲基氯化銨）的自組裝［48］。近期，通過不同Debye長(zhǎng)度外源離子（如Na+和K+等）排除靜電、氫鍵和疏水作用的干擾，在液相環(huán)境（酶水解緩沖液）中，本課題組［49］系統(tǒng)研究了木質(zhì)素與纖維素酶間的納米力學(xué)行為，初步證明纖維素酶（Celluclast 1.5L?，T.reesei）與毛竹磨木木質(zhì)素間存在陽(yáng)離子-π作用力（見圖2）。

圖2 木質(zhì)素與纖維素酶間的陽(yáng)離子-π作用Fig.2 Cation-π interaction between lignin and cellulase

與陽(yáng)離子-π作用類似，Gamez等［50］和Frontera等［51］先后證實(shí)，陰離子（如Cl-等）與芳香性化合物（如苯和咪唑等）間存在陰離子-π作用。在pH值為5.0的緩沖體系中，因EG III和β-G I等纖維素酶組分均含有帶負(fù)電的氨基酸殘基基團(tuán)（如—COO-），理論上，其也可與木質(zhì)素芳基基團(tuán)產(chǎn)生陰離子-π作用。但目前，還未見木質(zhì)素與纖維素酶間陰離子-π作用的相關(guān)報(bào)道。

3 木質(zhì)素與纖維素酶間相互作用的表征

基于物理吸附及酶水解效率等宏觀研究手段，前期研究間接推測(cè)出木質(zhì)素與纖維素酶間主要存在靜電、疏水和氫鍵作用［6，8，52］。盡管這些基礎(chǔ)研究為部分實(shí)際應(yīng)用（如磺化木質(zhì)素提高靜電排斥［24-25］、Mg2+弱化酚羥基介導(dǎo)的氫鍵作用[13]以及非離子型表面活性劑屏蔽疏水作用［34-35］等）奠定了理論基礎(chǔ)，但因2種大分子自身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及宏觀實(shí)驗(yàn)研究的局限性，部分研究結(jié)果間存在矛盾。Eriksson等［12］、Cai等［35］和Qin［36］等認(rèn)為疏水作用是導(dǎo)致纖維素酶被無效吸附的主導(dǎo)因素；然而，其他研究者（Yu等［21］、Sun等［22］、Yang等［31］）則認(rèn)為由酚羥基介導(dǎo)的氫鍵作用是最重要的影響因素。這主要是由于，纖維素酶含有多種組分，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)較為多樣化，二者的相互作用也由此變得較為復(fù)雜。物理吸附和間接驗(yàn)證（如木質(zhì)素抑制酶水解效率）等宏觀手段往往無法獲得確定的研究結(jié)論。因此，引入更為微觀的研究手段則顯得尤為必要。

納米力學(xué)是指特征尺度在0.1~100 nm距離范圍內(nèi)納米物體或納米界面間的力學(xué)行為［38，46-47］。在特定環(huán)境（如氣相或液相）中，基于微觀力學(xué)分析儀器（如AFM［36］和表面力儀（SFA）［47，49］），納米力學(xué)分析距離及力學(xué)強(qiáng)度的靈敏度可分別達(dá)到埃米和nN數(shù)量級(jí)，顯著提高了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。據(jù)此，研究者近期利用SFA初步證實(shí)，木質(zhì)素與纖維素酶間存在陽(yáng)離子-π作用［49］?？梢姡瑓^(qū)別于物理吸附和間接驗(yàn)證等宏觀研究手段，納米力學(xué)分析可為揭示大分子間新型作用機(jī)制提供直接且可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，有利于系統(tǒng)分析木質(zhì)素與纖維素酶組分間的非共價(jià)作用機(jī)制。

4 木質(zhì)素屏蔽劑對(duì)木質(zhì)生物質(zhì)酶水解的促進(jìn)作用

盡管分子修飾或代謝基因改造等生物化學(xué)技術(shù)是降低木質(zhì)素對(duì)纖維素酶產(chǎn)生不利吸附的理想手段，但木質(zhì)素和纖維素酶分子結(jié)構(gòu)及組成成分均較為復(fù)雜，基于木質(zhì)素-纖維素酶相互作用來確定靶向改性位點(diǎn)的研究仍存在挑戰(zhàn)［52-53］。因操作簡(jiǎn)單、成本低、效果明顯等原因，目前，研究者主要通過開發(fā)屏蔽劑來弱化木質(zhì)素-纖維素酶分子間的相互作用，進(jìn)而達(dá)到減少無效吸附以及提高木質(zhì)生物質(zhì)酶水解效率的目的［6，8，54］。下述將從屏蔽劑與木質(zhì)素相互作用的角度來概述不同類型屏蔽劑的開發(fā)和應(yīng)用效果。

4.1 基于靜電和氫鍵作用的木質(zhì)素屏蔽劑

Akimkulova等［13］采用Mg2+對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，其可在一定程度上降低木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附（見表3）。以單寧酸為木質(zhì)素模型物，該研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)，Mg2+可與木質(zhì)素酚羥基產(chǎn)生螯合作用，進(jìn)而降低纖維素酶組分與木質(zhì)素酚羥基間的氫鍵作用；同時(shí)，Mg2+也可能與部分酚羥基中的氫質(zhì)子發(fā)生交換，減少木質(zhì)素表面的負(fù)電荷，從而削弱木質(zhì)素與纖維素酶分子間的靜電吸引作用。當(dāng)向SPORL預(yù)處理固體基質(zhì)酶水解體系中添加Ca2+后，研究者發(fā)現(xiàn)，酶水解液中纖維素酶的穩(wěn)定性和活性顯著提高；由此推測(cè)Ca2+可與木質(zhì)素磺酸鹽（LS）形成表面負(fù)電荷較低的復(fù)合物，降低LS大分子間的靜電排斥，促使LS自身通過氫鍵等作用發(fā)生絮聚沉淀，進(jìn)而減少木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附［8，55-56］。

表3 木質(zhì)素屏蔽劑對(duì)預(yù)處理固體基質(zhì)酶水解的影響Table 3 Effects of lignin-blocking agents on enzymatic hydrolysis of pretreated solid substrates

此外，離子型表面活性劑（如LS和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB））也被開發(fā)為木質(zhì)素屏蔽劑。例如，Wang等［27］發(fā)現(xiàn)，將LS添加到酶水解體系中，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附量從182 mg/g降至88 mg/g，纖維素酶水解效率提高了約30%。這是因?yàn)?，LS可吸附于木質(zhì)素上，增加LS-木質(zhì)素復(fù)合物的電負(fù)性，進(jìn)而通過靜電排斥作用減少木質(zhì)素對(duì)酶的無效吸附。進(jìn)一步將聚乙烯醇（PEG）修飾于LS上，研究者發(fā)現(xiàn)，LS-PEG可通過靜電排斥等作用分散纖維素酶的聚集狀態(tài)，進(jìn)而提高木質(zhì)纖維素的酶水解效率，且其作用效果與LS相對(duì)分子質(zhì)量和磺酸根含量均有關(guān)［57-58］。此外，將LS加入酶水解體系后，研究者還發(fā)現(xiàn)，如繼續(xù)添加CTAB，二者具有協(xié)同作用，CTAB可降低LS表面負(fù)電荷，促進(jìn)LS在預(yù)處理固體基質(zhì)殘余木質(zhì)素表面的吸附，強(qiáng)化木質(zhì)素與纖維素酶的靜電排斥作用，最終提高SPORL預(yù)處理固體基質(zhì)酶水解效率［59］。

4.2 基于疏水作用的木質(zhì)素屏蔽劑

研究者發(fā)現(xiàn)，部分屏蔽劑主要通過疏水作用屏蔽木質(zhì)素。Castanon等［34］和Eriksson等［12］先后采用非離子表面活性劑吐溫80和PEG來屏蔽木質(zhì)生物質(zhì)預(yù)處理固體基質(zhì)表面的木質(zhì)素，纖維素酶水解效率得到顯著提高（30%~50%）。近期，Cai等［35］利用兩親性聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作為添加劑，在低酶用量（3 FPU/g聚葡萄糖）條件下，桉木稀硫酸預(yù)處理固體基質(zhì)中纖維素的酶水解效率從~30%提高到70%。研究者認(rèn)為，吐溫80和PVP等非離子型表面活性劑主要通過疏水作用與木質(zhì)素結(jié)合，被吸附的屏蔽劑可在木質(zhì)素表面發(fā)生重排，其親水基團(tuán)（醚鍵）暴露于水相，所形成的水化層可抑制木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附［6，11-12，35］。

盡管非生物基木質(zhì)素屏蔽劑（如金屬離子和表面活性劑等）可通過疏水和靜電等作用有效緩解木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的不利影響，但其具有廢液難以處理以及不具生物兼容性等缺陷［62-63］。因此，研究者進(jìn)一步將動(dòng)植物蛋白開發(fā)為生物基木質(zhì)素屏蔽劑。

因?qū)γ杆庑示哂忻黠@的促進(jìn)作用，牛血清蛋白（BSA）常被用作生物基木質(zhì)素屏蔽劑。例如，添加一定量BSA至酶水解液中，諸多酸法預(yù)處理固體基質(zhì)中纖維素的酶水解效率得以顯著提高［10，60-61，64-65］。這主要是由于，基于蛋白疏水區(qū)域與木質(zhì)素的疏水作用，BSA可選擇性屏蔽固體基質(zhì)表面的木質(zhì)素。大量研究［10，16，60-61，64］發(fā)現(xiàn)，酸法預(yù)處理固體基質(zhì)對(duì)纖維素酶和BSA均具較強(qiáng)的吸附能力，但純纖維素（如微晶纖維素Avicel）僅對(duì)纖維素酶產(chǎn)生吸附。這表明，在選擇性屏蔽預(yù)處理固體基質(zhì)表面木質(zhì)素的同時(shí)，BSA將不會(huì)影響纖維素對(duì)酶的可及性［11］。在實(shí)驗(yàn)研究方面，盡管BSA具有一定的應(yīng)用價(jià)值（如減弱木質(zhì)素的無效吸附），但商品BSA主要來源于牛血清，其價(jià)格昂貴，不具備工業(yè)化應(yīng)用的潛在可能性［10，66］。酪蛋白也被用于木質(zhì)素屏蔽劑制備，作為動(dòng)物蛋白，其也存在成本較高的缺陷。

近期，研究者進(jìn)一步將部分廉價(jià)植物蛋白開發(fā)為木質(zhì)素屏蔽劑。本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，廉價(jià)脫脂豆粉中水溶性大豆蛋白（SP）具有顯著提升水熱預(yù)處理固體基質(zhì)酶水解效率的作用［60，64］。添加80 mg/g聚葡萄糖的SP后，水熱預(yù)處理竹子、桉木及馬尾松固體基質(zhì)中纖維素酶水解效率從對(duì)照樣品的57%、54%和45%分別增加至87%、94%和86%［60］。添加SP后，達(dá)到相近的酶水解效率（如80%~90%），纖維素酶用量可減少4~8倍，這將顯著降低酶水解的成本。與此類似，本研究團(tuán)隊(duì)［61］還發(fā)現(xiàn)，脫脂花生粉中水溶性花生蛋白（PP）具有與SP相似的作用效果，這進(jìn)一步擴(kuò)大了廉價(jià)生物基木質(zhì)素屏蔽劑的選擇范圍?；趯?duì)酶水解底物及蛋白的表征，研究者初步認(rèn)為，SP和PP主要通過疏水和氫鍵等作用力吸附于木質(zhì)素上，被吸附的蛋白分子的親水區(qū)則裸露在水相中，形成水合層后，其可降低木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附［6，60-61］。可見，此作用機(jī)制與非離子表面活性劑（如吐溫80和PVP等）屏蔽木質(zhì)素的過程具有相似之處，但SP和PP等蛋白與木質(zhì)素間是否存在離子-π作用還有待進(jìn)一步證實(shí)。

5 結(jié)語(yǔ)及展望

高效制備可發(fā)酵糖（如葡萄糖）是開發(fā)纖維素基燃料化學(xué)品的基礎(chǔ)。然而，木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附嚴(yán)重抑制了酶催化水解纖維素制備葡萄糖的效率。目前，屏蔽劑是克服木質(zhì)素對(duì)纖維素酶不利影響的最簡(jiǎn)單、廉價(jià)的方法。但木質(zhì)素與纖維素酶分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，兩者間相互作用的機(jī)制較為復(fù)雜，這也在一定程度制約了高效、綠色屏蔽劑的開發(fā)。前期研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素與纖維素酶間存在靜電、疏水、氫鍵和陽(yáng)離子-π作用，但關(guān)于“木質(zhì)素與纖維素酶間陰離子-π、π-π堆積或p-π共軛等非共價(jià)相互作用”等方面的報(bào)道仍然較少。同時(shí)，纖維素不同酶組分與木質(zhì)素官能團(tuán)對(duì)特定作用力的影響也有待進(jìn)一步深入探索。因此，仍需從不同角度、采用不同手段來系統(tǒng)揭示木質(zhì)素與纖維素酶間的非共價(jià)作用機(jī)制。

利用納米力學(xué)等微觀分析手段以系統(tǒng)解析木質(zhì)素與纖維素酶間的作用機(jī)制，目前還需繼續(xù)探索研究以下關(guān)鍵問題：①明確纖維素酶主要組分外層氨基酸殘基上帶電基團(tuán)（如—NH3+和—COO-等）與木質(zhì)素苯基基團(tuán)間的陽(yáng)離子-π和陰離子-π作用；②探索分析木質(zhì)素苯環(huán)所連接官能團(tuán)（苯環(huán)、酚羥基和甲氧基等）對(duì)離子-π作用的影響；③辨明非離子-π作用（如π-π堆積和p-π共軛效應(yīng)）對(duì)木質(zhì)素與纖維素酶間疏水和氫鍵作用的強(qiáng)化機(jī)制。研究這些問題將不僅有利于系統(tǒng)揭示木質(zhì)素與纖維素酶間的非共價(jià)作用體系，也可為新型木質(zhì)素屏蔽劑的定向開發(fā)以及酶和木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)調(diào)控奠定堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)，有利于推動(dòng)纖維素燃料乙醇的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。