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定坤丹口服液與傳統(tǒng)工藝水蜜丸對(duì)雌性去勢(shì)大鼠的作用及藥效對(duì)比研究

2022-11-24 01:07:20張潤(rùn)濤李佳高喬節(jié)笑笑劉聰倪艷康永張愛榮趙惠淳
中醫(yī)藥信息 2022年11期
關(guān)鍵詞:口服液批號(hào)試劑盒

張潤(rùn)濤,李佳,高喬,節(jié)笑笑,劉聰,倪艷,康永?,張愛榮,趙惠淳

(1. 山西省中醫(yī)藥研究院,山西 太原 030012;2. 山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司,山西 晉中 030800)

定坤丹由紅參、鹿茸、西紅花等藥物組成,具有滋補(bǔ)氣血、調(diào)經(jīng)舒郁的功效,主要用于氣血兩虛、氣滯血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)行腹痛、崩漏下血、赤白帶下、血暈血脫、產(chǎn)后諸虛和骨蒸潮熱等,被廣泛應(yīng)用于婦科疾病,如卵巢功能不全、月經(jīng)病、不孕癥和更年期綜合征等[1]。目前定坤丹產(chǎn)品主要有口服液、水蜜丸與大蜜丸3 種劑型,其中定坤丹口服液具有口感好、吸收快且起效迅速的優(yōu)點(diǎn),而定坤丹水蜜丸則具有作用緩慢、藥效持久且容易保存的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制雌性去勢(shì)大鼠模型,使大鼠處于卵巢功能缺失狀態(tài),從而引起大鼠雌激素分泌紊亂,以此來探究定坤丹口服液及定坤丹水蜜丸對(duì)卵巢功能的調(diào)節(jié)作用,同時(shí)對(duì)二者的藥效進(jìn)行對(duì)比。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SD 大鼠,SFP 級(jí),200 只,體質(zhì)量180~200 g,由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。大鼠飼養(yǎng)于清潔恒溫環(huán)境,平均溫度25 ℃,平均濕度37%,15~20 次/h 全新風(fēng),12 h光照、12 h黑暗。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

定坤丹口服液(山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司,批號(hào):4112011002);定坤丹水蜜丸(山西廣譽(yù)遠(yuǎn)國(guó)藥有限公司,批號(hào):3282011096);補(bǔ)佳樂戊酸雌二醇片(Bayer,批號(hào):583A)。

大鼠孕酮(P)ELISA試劑盒(批號(hào):202104)、大鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒(批號(hào):202104)、大鼠促卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒(批號(hào):202104)、大鼠黃體生成素(LH)ELISA 試劑盒(批號(hào):202104)、大鼠前列腺素E2(PGE2)ELISA 試劑盒(批號(hào):202104)、大鼠前列腺素F2α(PGF2α)ELISA 試劑盒(批號(hào):202104)均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;C5微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)伯騰)。

2 方法

2.1 分組與去勢(shì)大鼠模型的建立

全部大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對(duì)照組、定坤丹水蜜丸組(水蜜丸組)以及定坤丹口服液高劑量組(高劑量組)、定坤丹口服液中劑量組(中劑量組)、定坤丹口服液低劑量組(低劑量組)。雌性大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉,仰臥位固定于大鼠板上,剃毛消毒后,沿腹部正中線距陰道口2.5 cm 處切開,使用剪刀在正中定位處打開約1.5~2 cm 的皮膚切口。除空白組外,其余大鼠分離兩側(cè)輸卵管進(jìn)行結(jié)扎,結(jié)扎后完整摘除兩側(cè)卵巢,分兩層縫合切口,用無菌生理鹽水沖洗傷口,碘伏消毒;空白組大鼠僅切開,不結(jié)扎。術(shù)后連續(xù)3 d 各組大鼠腹腔內(nèi)注射青霉素4 萬IU/d 以預(yù)防感染,6 d 后拆線,結(jié)扎術(shù)后大鼠可正常存活即為去勢(shì)大鼠模型復(fù)制成功。

2.2 分組給藥

術(shù)后1 周開始灌胃給藥,按人與大鼠體表面積換算系數(shù)確定給藥劑量。高、中、低劑量組分別灌胃定坤丹口服液10、5、2.5 mL/kg,陽性對(duì)照組予補(bǔ)佳樂0.12 mg/kg,水蜜丸組給予定坤丹水蜜丸1.75 g/kg,空白組和模型組大鼠灌服等劑量蒸餾水,每天灌胃1次,連續(xù)灌胃4周。每周稱量大鼠體質(zhì)量,調(diào)整給藥劑量。

2.3 標(biāo)本采集

末次給藥結(jié)束后,禁食不禁水12 h,10%水合氯醛溶液麻醉后進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈取血,一部分放入抗凝管中測(cè)定凝血功能,另一部分放入EP管中室溫靜置2 h后3 000 r/min離心20 min,取上清,制備血清,-20 ℃保存。摘取大鼠子宮,并稱取子宮的質(zhì)量,計(jì)算子宮指數(shù)。子宮組織用生理鹽水沖洗后,立刻置于10%甲醛中固定。

子宮指數(shù)=子宮質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%

2.4 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中FSH、LH、E2、P、PGE2、PGF2α含量

嚴(yán)格根據(jù)ELISA 試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作,檢測(cè)大鼠血清中FSH、LH、E2、P、PGE2和PGF2α的含量。

2.5 HE染色觀察大鼠子宮組織病理變化

生理鹽水沖洗后,立刻將子宮置于10%的甲醛溶液中固定,石蠟包埋,切片,HE 染色,200 倍光鏡下觀察子宮內(nèi)膜損傷等病理形態(tài)學(xué)的變化情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示,多組間的比較采用單因素方差分析,兩組間的多重比較采用LSD 分析,若方差不齊則采用Dunnett's T3多重比較法進(jìn)行檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)及子宮指數(shù)比較

造模期間,空白組大鼠皮毛光滑,攝食、飲水規(guī)律,體質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng);模型組大鼠毛發(fā)暗淡無光澤,情緒易激惹,體質(zhì)量較空白組明顯增加(P<0.01)。給藥后,與模型組相比,中劑量組大鼠體質(zhì)量繼續(xù)增加(P<0.01),水蜜丸組大鼠體質(zhì)量有增加趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);定坤丹口服液各劑量組與水蜜丸組大鼠相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠子宮指數(shù)較空白組明顯降低(P<0.01);定坤丹口服液各劑量組、水蜜丸組及陽性對(duì)照組大鼠子宮指數(shù)較模型組顯著升高(P<0.01);中、低劑量組與水蜜丸組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠子宮指數(shù)及體質(zhì)量比較(xˉ±s,n=10)

3.2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較

模型組大鼠PT、TT較空白組顯著升高(P<0.01);高劑量組大鼠PT值較模型組降低(P<0.05),高、中劑量組及水蜜丸組的TT值較模型組顯著降低(P<0.01,P<0.05);定坤丹口服液各劑量組與水蜜丸組大鼠PT及TT值相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較(xˉ±s,n=10)

3.3 各組大鼠性激素指標(biāo)比較

與空白組相比,模型組大鼠血清P、E2、PGE2 水平顯著降低,F(xiàn)SH、LH、PGF2α 水平顯著增高(P<0.01);與模型組相比,定坤丹口服液各劑量組、水蜜丸組大鼠血清P、E2、PGF2α 水平均不同程度升高,LH、FSH、PGE2 水平均不同程度降低(P<0.05,P<0.01),其中中劑量組大鼠的FSH 水平以及高、中劑量組大鼠的PGE2 水平較水蜜丸組改變更明顯(P<0.05),其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠性激素指標(biāo)比較(xˉ±s,n=10)

3.4 各組大鼠子宮病理形態(tài)的比較

與空白組比較,模型組大鼠子宮明顯萎縮,內(nèi)膜上皮及子宮腺上皮細(xì)胞呈小圓柱狀,質(zhì)核比下降,子宮內(nèi)膜層變薄,間質(zhì)細(xì)胞呈紡錘形,細(xì)胞變小,肌層萎縮變薄;與模型組相比,各給藥組大鼠子宮均有不同程度的萎縮,水蜜丸組及定坤丹口服液高劑量組子宮萎縮情況減輕,間質(zhì)細(xì)胞排列密集,兩者相比無顯著差異。見圖1。

圖1 去勢(shì)模型大鼠子宮病理(HE,×200)

4 討論

定坤丹始于清乾隆年間,為宮廷秘方,乾隆帝因其可“安定坤富”而將其命名為“定坤丹”。該方由紅參、鹿茸、西紅花等中藥組成,由四君子湯、四物湯、逍遙散、八珍益母丸、理中丸、柴胡疏肝散等經(jīng)典名方化裁而成,具有共行補(bǔ)益氣血、滋補(bǔ)肝腎、調(diào)經(jīng)舒郁、健脾行氣、溫中祛寒、活血止痛之功效,用于治療氣血兩虛、氣滯血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、行經(jīng)腹痛、崩漏下血、赤白帶下、血暈血脫、產(chǎn)后諸虛和骨蒸潮熱等。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),定坤丹在原發(fā)性卵巢功能不全(POI)的治療中具有良好的效果[2-3]。POI 的發(fā)病原因包括遺傳學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)源性、環(huán)境和生活方式等因素[4]。LH、FSH、E2、P作為女性卵巢功能不全的早期標(biāo)志物,在疾病的發(fā)生過程中可表現(xiàn)為L(zhǎng)H、FSH 含量升高,E2、P含量降低,其中FSH 最為敏感[5]。女性的卵泡發(fā)育、性激素水平的調(diào)節(jié)以及正常生殖功能的維持主要依靠下丘腦-垂體-卵巢軸,E2、FSH 和LH 是女性生殖軸的重要激素[6],其中E2受LH 和FSH 的調(diào)節(jié),共同維護(hù)女性生殖系統(tǒng)正常的生理功能[7]。有研究表明,前列腺素與子宮收縮有密切關(guān)系,其中研究較多的是PGF2α 和PGE2,PGF2α 可促進(jìn)子宮收縮,而PGE2則對(duì)子宮收縮產(chǎn)生抑制作用[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)通過摘除大鼠卵巢復(fù)制雌性去勢(shì)大鼠模型,使大鼠處于卵巢功能缺失的狀態(tài),并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行定坤丹口服液與定坤丹水蜜丸的藥效對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,定坤丹口服液和水蜜丸均能不同程度升高大鼠血清P、E2、PGE2 水平,降低LH、FSH、PGF2α 水平,證明定坤丹能夠通過調(diào)節(jié)大鼠雌激素紊亂的狀態(tài)從而促進(jìn)卵巢功能的恢復(fù),另外給藥后TT降低也說明出定坤丹能夠促進(jìn)凝血功能的改善。

水蜜丸是指藥材細(xì)粉以水和蜂蜜按適當(dāng)比例混勻?yàn)轲ず蟿┲瞥傻乃幫?,其作用緩慢,藥效持久,?yōu)點(diǎn)在于使用的蜂蜜量較少,含水量低,可便于長(zhǎng)期保存和服用。口服液劑是以中藥湯劑為基礎(chǔ),提取中藥內(nèi)的有效成分,并按照注射劑的加工工藝合成的口服液體制劑,具有服用劑量小、味道好、吸收快、奏效迅速和質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。通過本實(shí)驗(yàn)對(duì)定坤丹口服液和水蜜丸進(jìn)行藥效學(xué)對(duì)比,結(jié)果顯示二者具有相似的治療效果,因此可以在不同的應(yīng)用場(chǎng)景根據(jù)使用人群的偏好進(jìn)行選擇。

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