林怡彤，宋高臣

（牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

原發(fā)性肝癌（Primary hepatic carcinoma，PHC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2020年全球有90.6萬新診斷PHC病例和83萬PHC死亡病例，是世界上第六大常見腫瘤和人類第三大癌癥相關(guān)死亡原因［1］。肝細(xì)胞癌約占PHC 中的75%～85%，是最重要的病理類型［1］。目前，手術(shù)切除和肝移植仍然是治療肝細(xì)胞癌最有效的策略，特別是對于預(yù)后較好的早期患者［2］，但由于肝細(xì)胞癌的臨床癥狀出現(xiàn)較晚且腫瘤的高侵襲性，許多患者在確診時已處于晚期，錯過了最佳的手術(shù)治療機(jī)會［3］。因此，積極尋找高效、低毒性的抗癌劑成為治療PHC的重要研究方向。

半枝蓮屬唇形科，全株入藥，味辛微苦，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒、散癖止血、利尿消腫等功效［4］。多糖類是通過糖苷鍵結(jié)合超過10個單糖類而形成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物聚合物［5］。從不同的中草藥中分離得到的多糖具有多種生物學(xué)功能，如抗腫瘤［6］、抗氧化［7］、抗病毒［8］和免疫調(diào)節(jié)［9］等作用。多糖類成分不僅能增強(qiáng)人體的免疫功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的免疫水平，還能促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如干擾素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等，從而提高抗腫瘤效果［10］。本課題組前期對半枝蓮多糖的提取純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化并確定其抗肝癌活性的有效成分，發(fā)現(xiàn)半枝蓮多糖組分（SBP-2A）對肝癌HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，但其對小鼠體內(nèi)肝癌的作用及機(jī)制尚不明確。因此，本實驗觀察半枝蓮多糖組分（SBP-2A）在體內(nèi)對H22 荷瘤小鼠的抑瘤作用及細(xì)胞因子γ-干擾素（IFN-γ）、STAT1 蛋白表達(dá)的影響，為闡明半枝蓮多糖的抗腫瘤作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～25 ℃，濕度45%～55%。所有動物自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。

1.2 樣品、試劑及主要儀器

半枝蓮全草（河北金葉子藥業(yè)有限公司）；H22 細(xì)胞株（無錫鑫潤生物科技有限公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries 公司，批號：2140301）；黃芪多糖（北京美迪克斯生物技術(shù)有限公司，批號：021001B）；BCA蛋白濃度測定盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：100918190318）；STAT1兔源性一抗（沈陽萬類生物科技有限公司，批號：L02222273）；IFN-γ ELISA 試劑盒（江蘇蘇酶科生物科技有限公司，批號：MK2918A）；酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；電泳槽（北京六一儀器廠）；電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 SBP-2A的提取、分離和純化

將半枝蓮全草清洗干凈，放入60 ℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒溫，粉碎，過40目篩得樣品粉末，取半枝蓮干燥粉末按照1∶4的比例置于4倍體積95%乙醇中攪拌，室溫靜置3 h，收集沉淀，沉淀重復(fù)上述去雜操作10次，將沉淀置于60 ℃的干燥箱中干燥24 h；沉淀用Sevage 法除蛋白，加入4倍體積無水乙醇進(jìn)行醇沉，洗滌數(shù)次，大孔樹脂脫色，過濾分離提取液后濃縮至原體積的1/4。-50 ℃下真空干燥制得半枝蓮粗多糖。DEAE-52纖維素柱分離得半枝蓮多糖2組分，Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱分離得半枝蓮多糖2A組分，-40 ℃下預(yù)凍12 h，置冷凍干燥機(jī)中36 h，干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 動物造模、分組與給藥

將30 只雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為模型組、黃芪多糖組和SBP-2A 低、中、高劑量組，每組6 只。常規(guī)方法復(fù)蘇H22 小鼠肝癌細(xì)胞，各組小鼠均在右前肢腋窩皮下注射0.2 mL 1×107個/mL 細(xì)胞密度的H22 肝癌細(xì)胞，建立H22肝癌模型。接種24 h后，模型組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水（0.1 mL/10 g），SBP-2A低、中、高劑量組分別腹腔注射25、50、100 mg/kg SBP-2A，黃芪多糖組腹腔注射100 mg/kg黃芪多糖，每日1次，連續(xù)給藥干預(yù)12 d。

1.3.3 對腫瘤抑制和免疫器官指數(shù)的影響

末次給藥24 h后，小鼠禁食不禁水，稱體質(zhì)量后處死小鼠，剝離瘤塊組織，取出脾臟和胸腺，用濾紙吸凈血液分別稱重，計算腫瘤抑制率和免疫器官指數(shù)。

抑瘤率（%）=（1-實驗組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量）×100%

免疫器官指數(shù)=免疫器官質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

1.3.4 ELISA法測定荷瘤小鼠血清中IFN-γ的表達(dá)

末次給藥后24 h 后，眼球取血，收集血液，靜置30 min，離心，取上清，ELISA法測定血清中IFN-γ含量，具體操作步驟按照IFN-γ ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 蛋白免疫印跡法檢測STAT1蛋白的表達(dá)

剪取0.025 g 腫瘤組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1 次，加入250 μL 的RIPA 蛋白裂解液提取總蛋白，用苯二甲芐基氯化銨（BCA）蛋白濃度測定法進(jìn)行蛋白定量，通過聚丙烯酰胺電泳按相對分子質(zhì)量大小分離，然后轉(zhuǎn)移到雜交膜上，加入50 mL 封閉液，封閉2 h，加入一抗（1∶1 000），放入搖床，4 ℃過夜，將蛋白條帶用TBST 洗滌3次后，用稀釋后的二抗（1∶5 000）與膜共同孵育60 min。再用TBST 洗滌3 次后，用化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，掃描底片，用Image J 軟件計算灰度值，以β-actin為內(nèi)參，對比分析瘤體組織中的蛋白表達(dá)。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism8統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組對荷瘤小鼠的抑瘤作用比較

與模型組比較，半枝蓮多糖組分（SBP-2A）低、中、高劑量組及黃芪多糖組瘤重顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；不同劑量SBP-2A 對H22 小鼠表現(xiàn)出不同的抑瘤作用，其中以中劑量組效果最佳；SBP-2A中劑量組對H22肝癌小鼠的抑瘤率為38.67%。見表1。

表1 SBP-2A對H22荷瘤小鼠瘤重的影響（±s，n=6）

表1 SBP-2A對H22荷瘤小鼠瘤重的影響（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

抑瘤率（%）—15.42 38.67 29.95 42.32組別模型組SBP-2A低劑量組SBP-2A中劑量組SBP-2A高劑量組黃芪多糖組劑量［mg/（kg·d）］—25 50 100 100瘤重（images/BZ_9_1380_2696_1401_2739.png±s，g）1.291±0.096 1.092±0.160*0.792±0.072**0.905±0.084**0.745±0.080**

2.2 各組荷瘤小鼠免疫學(xué)功能的比較

與模型組比較，SBP-2A 中劑量組胸腺指數(shù)有顯著提高（P＜0.05）；給藥各組脾臟指數(shù)均較模型組有顯著提高（P＜0.01），其中SBP-2A 高劑量組效果最佳；SBP-2A 低、中、高劑量組的IFN-γ 水平呈劑量依賴性顯著升高（P＜0.01）。黃芪多糖組與模型組相比，各免疫學(xué)指標(biāo)均有顯著回升（P＜0.01）。見表2。

表2 SBP-2A對荷瘤小鼠免疫學(xué)功能的影響（±s）

表2 SBP-2A對荷瘤小鼠免疫學(xué)功能的影響（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別模型組SBP-2A低劑量組SBP-2A中劑量組SBP-2A高劑量組黃芪多糖組IFN-γ（pg/mL）51.59±1.14 56.24±1.72**57.17±1.62**60.54±0.67**70.50±0.63**n66666劑量［mg/（kg·d）］—25 50 100 100脾臟指數(shù)（mg/g）6.14±0.20 11.85±0.32**11.29±0.23**13.27±0.17**7.084±0.05**胸腺指數(shù)（mg/g）1.63±0.06 2.07±0.59 2.54±0.09*1.74±0.06 2.71±0.82**

2.3 各組荷瘤小鼠STAT1蛋白表達(dá)的比較

Western blot 結(jié)果顯示，與模型組比較，各劑量SBP-2A處理的小鼠瘤組織中的STAT1蛋白表達(dá)量均顯著增加，其中高劑量組最為明顯（P＜0.05）。見圖1。提示SBP-2A 可能通過提高STAT1 蛋白水平來抑制小鼠肝癌腫瘤的生長。見圖1和表3。

圖1 各組荷瘤小鼠腫瘤組織STAT1蛋白表達(dá)的比較

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織STAT1蛋白表達(dá)量的比較（±s，n=6）

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織STAT1蛋白表達(dá)量的比較（±s，n=6）

注：模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別模型組SBP-2A低劑量組SBP-2A中劑量組SBP-2A高劑量組黃芪多糖組STAT1 0.684±0.066 0.694±0.142 0.989±0.256 1.212±0.096*1.384±0.159**劑量［mg/（kg·d）］—25 50 100 100

3 討論

多糖是許多植物的活性成分之一，對癌癥具有低毒高效的治療作用［11］。如黃芪、人參、五味子等多味中藥的多糖組分均已被證明對腫瘤具有良好的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮多糖可抑制多種腫瘤，如結(jié)直腸癌［12-13］、肝細(xì)胞癌［14］、肺癌［15-16］、卵巢癌［17］和乳腺癌［18］等。但關(guān)于半枝蓮多糖的研究主要集中在粗多糖方面，關(guān)于半枝蓮多糖分離純化的組分研究較少，且其對肝癌腫瘤生長的免疫調(diào)節(jié)作用仍不清楚。因此，本研究探討半枝蓮多糖組分對H22 荷瘤小鼠的抗腫瘤作用，并探索潛在的免疫調(diào)節(jié)功能。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SBP-2A 在體外實驗顯示良好的抗肝癌效果，作為先前研究的延續(xù)，本實驗通過H22 肝癌小鼠模型，探討SBP-2A 在H22 荷瘤小鼠中的抗腫瘤活性和可能潛在機(jī)制。首先建立H22肝癌小鼠模型，SBP-2A 干預(yù)治療后處死小鼠，測定瘤體、脾臟、胸腺重量，計算出腫瘤抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。結(jié)果表明，SBP-2A各劑量組均可抑制瘤體生長，增加肝癌小鼠免疫器官指數(shù)，其中SBP-2A中劑量組小鼠抑瘤率高于SBP-2A低、高劑量組，可能與SBP-2A中劑量組小鼠胸腺指數(shù)最高有關(guān)，提示SBP-2A 可能通過增加小鼠免疫器官質(zhì)量，增強(qiáng)小鼠免疫功能，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的效果。細(xì)胞因子IFN-γ 已被證明在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)以及抑制腫瘤生長方面發(fā)揮著重要的作用，并已在臨床前、體外和體內(nèi)以及惡性疾病免疫治療的患者中進(jìn)行了廣泛的測試［19］。在體內(nèi)實驗中，注射SBP-2A 的H22荷瘤小鼠血清IFN-γ 水平顯著升高，提示SBP-2A可能通過刺激H22荷瘤小鼠的細(xì)胞因子分泌，發(fā)揮間接的抗腫瘤效果。STAT1 是STATs蛋白家族的成員之一，經(jīng)磷酸化激活的STAT1蛋白向核轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡、腫瘤血管生成和免疫監(jiān)視等多種生物學(xué)過程［20］。本研究觀察到H22肝癌小鼠經(jīng)過SBP-2A治療后，其腫瘤組織的STAT1 蛋白水平顯著增加（P＜0.05），以高劑量組最為明顯。提示SBP-2A 可能通過提高STAT1蛋白水平從而抑制腫瘤生長。

綜上所述，本研究證實從半枝蓮多糖中分離純化的SBP-2A 具有抑制H22 荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，該作用可能與免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。