賈羲，付智慧，茹慶國，聶安政?

（1. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2. 河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450008）

細辛來源于馬兜鈴科植物華細辛（Asarum sieboldiiMiq.）、北細辛［Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var. mandshuricum（Maxim.）Kitag.］或漢城細辛（Asarum sieboldiiMiq. var. seoulense Nakai）的干燥根和根莖，后兩種習稱“遼細辛”。細辛最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要功效為解表散寒、祛風止痛、通竅、溫肺化飲，臨床多用于風寒感冒、頭痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、風濕痹痛、痰飲喘咳等［1-3］?！侗静菥V目》中提及“細辛不過錢，過錢命相連”［4］，細辛的毒性便開始受到關注，細辛中所含馬兜鈴酸具腎毒性，長期攝入可致使腎小管功能受損，甚至有誘發(fā)腎癌的風險，印證了細辛的腎毒性［5-9］?！吨腥A人民共和國藥典》將細辛用量限制在1～3 g，但在臨床中為了達到特定療效，常常超劑量使用，如國家中醫(yī)藥管理局推薦的新冠肺炎防疫通用方清肺排毒湯中，細辛用量為6 g，而筆者前期研究發(fā)現(xiàn)細辛煎劑的中毒劑量為6～15 g。作為毒效并存的藥物，臨床如何基于療效與毒性把握細辛用量？因此，筆者擬基于細辛的抗炎、鎮(zhèn)痛作用與腎毒性作用初步探討細辛的“量-毒-效”關系，旨在為細辛的臨床合理應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細辛水煎液的制備

細辛購買于河南尚華堂藥業(yè)股份有限公司（批號：201001），經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院王娟教授鑒定為馬兜鈴科植物華細辛（Asarum sieboldiiMiq.）的根及根莖。稱細辛1 200 g，加蒸餾水6 000 mL煎煮60 min，過濾，將藥渣再加水3 000 mL煎煮60 min，再次過濾，將2次濾液合并，減壓旋轉蒸發(fā)濃縮，小鼠給藥前將水煎液分別以蒸餾水稀釋至1.2、0.6、0.3、0.15 g/mL（生藥量）。

1.1.2 實驗動物

昆明小鼠（清潔級）180只，體質量（20±2）g，雌雄各90 只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2020-0004。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度（23±1）℃，濕度（45±5）%，標準12 h光照/12 h黑暗節(jié)律，普通清潔級鼠飼料與飲水。

1.1.3 試劑及儀器

二甲苯（上海麥克林生化科技有限公司，批號：20150508）；冰醋酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號：920827）；地塞米松（北京索萊寶科技有限公司，國藥準字H44020701）；蘇木素-伊紅染液（德國Sigma公司）；打孔器（上海澤雅科教儀器有限公司，型號：INS500075-5）；電子天平（上海力辰儀器科技有限公司）；BX53顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 醋酸扭體實驗

昆明小鼠適應性飼養(yǎng)5 d 后，取60 只（雌雄各30 只），按體質量隨機分為對照組、陽性藥組以及細辛水煎液劑量1、2、3、4組，共6組，每組10只。陽性藥組小鼠灌胃1.5 mg/kg地塞米松，細辛水煎液劑量1、2、3、4組小鼠分別灌胃24、12、6、3 g/kg 的細辛水煎液，對照組小鼠給予蒸餾水，各組給藥量均為20 mL/kg。每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃1 h 后小鼠腹腔注射1%的醋酸0.2 mL，觀察并記錄15 min 內(nèi)每組小鼠扭體次數(shù)。

1.2.2 耳廓腫脹實驗

小鼠分組與灌胃情況同醋酸扭體實驗。每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃1 h 后將0.05 mL 二甲苯均勻涂抹于小鼠右耳的兩面，左耳對應位置涂抹等體積的生理鹽水，0.5 h 后脫頸椎處死小鼠，將小鼠左右兩耳剪下，疊放對齊，用打孔器在左右耳相同部位打孔，取下稱重。

腫脹度（g）=右耳質量-左耳質量

1.2.3 熱板法實驗

小鼠分組與灌胃情況同醋酸扭體實驗。每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃給藥7 d，于末次灌胃30、60 min 后分別測量并記錄小鼠痛閾值。

1.2.4 腎臟組織蘇木精-伊紅（HE）染色

每批動物實驗結束后，取同一位置腎臟組織固定在4%多聚甲醛中，分別采用70%、75%、80%、90%、95%乙醇和無水乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明處理后用石蠟進行包埋。包埋好的腎臟組織以4 μm 厚度標準切片，進行常規(guī)脫蠟處理，分別以無水乙醇及95%、80%乙醇進行復水，然后用純水浸泡5 min 后，進行蘇木精-伊紅染色，脫水后中性樹膠封片，風干，光學顯微鏡下觀察組織小鼠腎臟病理形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，不同分組之間進行單因素方差分析比較組間差異；各組方差齊性條件下采用Bonferroni法進行兩兩比較，各組方差不齊情況下采用Dunnett's T3 法進行兩兩比較。P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠耳廓腫脹度變化情況比較

陽性藥組小鼠耳廓腫脹度較對照組顯著降低（P＜0.05）；細辛水煎液劑量1、2、3、4組腫脹度較對照組均顯著降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠耳廓腫脹度比較（±s）

表1 各組小鼠耳廓腫脹度比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別對照組陽性藥組細辛水煎液劑量1組細辛水煎液劑量2組細辛水煎液劑量3組細辛水煎液劑量4組腫脹度（g）0.025 3±0.002 8 0.021 3±0.002 5*0.016 5±0.004 3**0.012 5±0.001 2**0.014 2±0.002 4**0.016 9±0.003 7**n 10 10 10 10 10 10劑量—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.2 各組小鼠扭體次數(shù)變化情況比較

小鼠在造模后15 min，陽性藥組、細辛水煎液劑量1、2 組扭體次數(shù)較對照組顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05），其余各組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠扭體次數(shù)比較（±s）

表2 各組小鼠扭體次數(shù)比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別對照組陽性藥組細辛水煎液劑量1組細辛水煎液劑量2組細辛水煎液劑量3組細辛水煎液劑量4組扭體次數(shù)（次）19.80±2.00 13.80±2.00**14.20±2.24**17.30±1.70*18.60±2.00 19.80±2.00 n 10 10 10 10 10 10劑量—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.3 各組小鼠痛閾值變化情況比較

給藥后30 min，陽性藥組、細辛水煎液劑量1組小鼠痛閾值較對照組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），其余各組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；給藥后60 min，各給藥組痛閾值較對照組均顯著降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠痛閾值比較（±s）

表3 各組小鼠痛閾值比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別n 劑量對照組陽性藥組細辛水煎液劑量1組細辛水煎液劑量2組細辛水煎液劑量3組細辛水煎液劑量4組痛閾值（s）給藥后30 min 16.54±2.02 18.85±1.55*22.75±3.56**15.82±3.55 17.13±1.04 15.32±1.29給藥后60 min 13.81±1.03 21.11±1.43**25.22±3.30**20.30±3.31**19.04±1.74**16.96±1.54**10 10 10 10 10 10—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.4 各組小鼠腎臟病理變化情況比較

對照組小鼠腎組織表面被膜由厚薄均勻的致密結締組織構成，腎實質為淺層皮質和深層髓質，皮質髓質分界明顯，皮質中腎小球分布均勻，腎小球中細胞數(shù)量以及基質均勻，腎小管排列緊密，間質無明顯增生，未見明顯的炎性改變；與對照組相比，小鼠耳廓腫脹實驗、醋酸扭體實驗、熱板法實驗中細辛水煎液劑量1、2 組的腎組織均出現(xiàn)大量的腎小管與集合管輕度擴張，腎小管上皮細胞水腫，上皮扁平化細胞腫脹，胞質疏松淡染；其余各組未見明顯變化。見圖1。

圖1 不同劑量的細辛水煎液對小鼠腎組織的影響（HE染色，×200）

3 討論

細辛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，臨床應用廣泛，《傷寒雜病論》中收載含細辛的中藥方劑19 首［10］，《備急千金要方》中記載含細辛方劑6 首［1］，清代共發(fā)現(xiàn)373 首含細辛的中藥方劑［11］，2020 版《中華人民共和國藥典》中共收載含細辛中藥制劑42 首［12］。自2020年清肺排毒湯（含細辛6 g）被推薦成為首個防疫通用方并廣泛應用于臨床。但研究顯示，細辛臨床毒性反應眾多［13］，其臨床應用安全性受到廣泛關注。臨床對細辛應用頗具爭議，有欲取速效而超量使用，亦有因恐懼毒性而棄之不用者，究其原因，都是對細辛毒-效關系的認識模糊。本研究討論不同劑量下的細辛的毒-效關系，為細辛毒-效關系的深入探討奠定基礎，同時也為臨床細辛湯劑用量的把控提供參考。

本實驗結果顯示，24、12、6、3 g/kg劑量的細辛水煎液均可顯著抑制致炎物引起的小鼠耳廓腫脹，并能明顯降低小鼠耳腫脹度（P＜0.01）；24、12 g/kg 劑量的細辛水煎液可顯著減少醋酸所致的小鼠疼痛扭體次數(shù)，延長小鼠扭體潛伏期（P＜0.05 或P＜0.01）；給藥后30 min，24 g/kg 劑量的細辛水煎液開始顯著提升小鼠痛閾值；給藥后60 min，24、12、6、3 g/kg 劑量的細辛水煎液均可顯著提升小鼠的痛閾值。連續(xù)給藥7 d 后，24、12 g/kg 劑量的細辛水煎液可對小鼠的腎臟產(chǎn)生輕度的損傷，6、3 g/kg 劑量的細辛水煎液對腎臟影響較小。上述結果表明，3～24 g/kg劑量的細辛水煎液均具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，連續(xù)給予12～24 g/kg劑量的細辛水煎液7 d可能會產(chǎn)生輕度腎損傷。研究發(fā)現(xiàn)細辛脂素、甲基丁香酚是細辛抗炎鎮(zhèn)痛的主要活性成分，而馬兜鈴酸、黃樟醚是細辛的主要毒性成分，其中馬兜鈴酸是主要的腎毒性成分。本研究結果提示臨床應用細辛時，應從小劑量開始，療效不佳時逐漸增加劑量，當使用大劑量細辛時，應當適當配伍保護腎臟的中藥或者抑制馬兜鈴酸溶出的中藥從而達到減毒之效［14-17］。

本研究基于抗炎鎮(zhèn)痛與腎毒性初步探討了細辛水煎液“量-毒-效”關聯(lián)關系，發(fā)現(xiàn)12 g/kg 細辛水煎液連續(xù)給藥7 d即可使腎臟組織發(fā)生病理變化，印證了細辛的腎毒性?；诖耍P者認為：①應在6～12 g/kg 范圍內(nèi)設置多種濃度細辛水煎液劑量組，深入闡釋細辛“量-毒-效”關系；②可基于肝、腎、肺毒性多維聯(lián)合闡釋細辛的“量-毒-效”關系；③應基于不同的給藥療程闡明細辛水煎液“時-毒-效”關系；④采用液質聯(lián)用明確細辛水煎液“毒-效”成分，基于“毒-效”成分探討細辛減毒增效方法。