趙莉娜，門波，陳建設(shè)，孫自學，張宸銘

（1. 河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2. 河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046）

精子在生成、形成和成熟過程中，由于主要細胞器的脫落失去了DNA 損傷修復系統(tǒng)。因此，精子在成熟后不具備自我修復的能力，成熟的精子必須依靠卵母細胞中的修復系統(tǒng)來修復DNA損傷［1］。而卵母細胞的修復能力根據(jù)個體、年齡的不同呈現(xiàn)較大差異［2］。尤其是高齡女性會出現(xiàn)妊娠率低、流產(chǎn)率高等情況，這可能與卵子DNA修復功能密切相關(guān)［3］。

益腎通絡(luò)方是本課題組前期臨床使用近二十年的經(jīng)驗方，對于該方在改善精子質(zhì)量方面，尤其是改善精子DNA 完整性方面的作用，做了大量的基礎(chǔ)研究工作［4-7］，發(fā)現(xiàn)該方能夠有效降低患者精子DNA 的碎片率，且安全性較高［8-9］。近年來，隨著二胎、三胎政策的放開，高齡患者的就診量明顯上升。課題組根據(jù)中醫(yī)“異病同治”理論，將該方應用于高齡女性患者，發(fā)現(xiàn)其可明顯增加患者妊娠率、活產(chǎn)率，但具體機制不明。本研究通過復制苯并（a）芘（BaP）致雄鼠精子DNA 損傷模型，使正常雄鼠及BaP 染毒雄鼠分別與灌胃益腎通絡(luò)方水煎液及灌胃生理鹽水的雌鼠合籠，對比各組雌鼠的妊娠結(jié)局，探討益腎通絡(luò)方改善雌鼠卵子質(zhì)量的作用機制。

1 方法

1.1 實驗動物

20 只雄性、30 只雌性SPF ICR（CD1）小鼠（10 周齡，體質(zhì)量30～40 g），購買于河南斯克貝斯生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（豫）2020-0005。對小鼠進行編號，然后依據(jù)隨機數(shù)字表進行隨機分組。所有動物實驗和操作均已得到河南省中醫(yī)院倫理委員會的批準。動物飼養(yǎng)在河南省中醫(yī)院中心實驗室的獨立通風籠（IVC）系統(tǒng)中，許可證號：SYXK（豫）2011-0002。IVC 系統(tǒng)中，溫度21～25 ℃，濕度38%～60%，通風量為22 次/h，光照/黑暗周期為12 h。小鼠可以自由進食標準動物飼料和過濾水。在正式實驗之前，適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗材料

益腎通絡(luò)方組成：菟絲子20 g，淫羊藿20 g，黃芪20 g，丹參30 g，熟地黃10 g，牛膝10 g 和水蛭6 g，飲片購自河南省中醫(yī)院中藥房，所有藥材均經(jīng)河南省中醫(yī)院制劑中心黃小敏主任藥師鑒定。制備為3 g/mL的藥材水煎液，保存在4 ℃的冰箱中備用。苯并（a）芘（BaP，分析純，純度≥96%）（批號：C11287800，北京德晟嘉行科技有限公司）；精子核完整性染色試劑盒（批號：201101，浙江星博生物科技股份有限公司）。

1.3 實驗設(shè)計

20 只雄性小鼠隨機分為兩組，每組10 只，分別為A組和B組。A組小鼠（A1～A10）作為雄性空白對照組，灌胃與B組等量的生理鹽水。B組小鼠（B1～B10）參照文獻［10］進行BaP 染毒，染毒劑量為100 mg/（kg·d），共60 d，復制精子DNA損傷模型作為雄性造模組。同時，30 只雌性小鼠隨機分為3 組，每組10 只，分別為C 組（C1～C10）、D 組（D1～D10）和E 組（E1～E10）。C、D 組小鼠作為雌性空白對照，灌胃與E 組等量的生理鹽水，E 組小鼠按23.78 g/kg 劑量（按照體表面積法［11］計算的等效劑量）灌胃益腎通絡(luò)方水煎液，共60 d。

灌胃結(jié)束后，采用角化細胞計數(shù)法［12］觀察雌鼠動情周期。在雌鼠動情期時，將A 組每只雄鼠與編號相同的C 組雌鼠按照1∶1 比例合籠，一籠2 只，即A1 + C1、A2 + C2……A10 + C10。將B 組每只雄鼠與相同編號的D 組和E 組雌鼠按照1∶2 比例合籠，一籠3 只，即B1 + D1 + E1、B2 + D2 + E2……B10 +D10 + E10。合籠次日觀察雌鼠陰栓情況［13］，發(fā)現(xiàn)陰栓則記為妊娠0 d，將雌鼠單獨飼養(yǎng)直至F1 代出生，F(xiàn)1 代出生后統(tǒng)計每只雌鼠活產(chǎn)數(shù)。具體實驗步驟見圖1。

圖1 技術(shù)路線圖

1.4 SCSA法檢測精子DNA碎片指數(shù)（DFI）

合籠成功后，采用戊巴比妥鈉麻醉雄鼠，解剖后取附睪尾制成精子懸液，采用改良的精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測（SCSA）法［14］檢測精子DFI。將精子懸液轉(zhuǎn)移到800 μL的冷TNE緩沖液中，通過100 μm尼龍過濾器。將過濾后的精子懸浮液用相同的緩沖液稀釋到（2 × 106～3×106）/mL 的濃度，然后用酸性洗滌劑溶液將100 μL的精子懸液稀釋到200 μL，置于FACS 管中。加入600 μL 吖啶橙染色液，染色30 s。每個樣本都用BD Accuri?C5流式細胞儀（BD Pharmingen，San Diego，CA，USA）對5 000 個精子進行門控分析。使用BD Accuri?C6 plus 軟件（BD Pharmingen）計算DFI，并根據(jù)單鏈（紅色）和雙鏈（綠色）熒光比例計算精子DNA 碎片指數(shù)（sperm DNA fragmentation index，DFI）。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，則兩組比較采用獨立樣本t檢驗；對于非正態(tài)分布或方差不齊的資料則采用t'檢驗。三組比較則采用單因素方差分析（ANOVA），并應用LSD 法進行各組間進行兩兩比較；對于非正態(tài)分布或方差不齊資料則采用秩和檢驗。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

各組小鼠毛發(fā)光澤，活動正常，雌鼠動情周期規(guī)律。雄鼠造模后未出現(xiàn)明顯的外觀變化。

2.2 兩組雄鼠DFI情況比較

合籠成功后，處死所有雄鼠并取材檢測DFI。兩組雄鼠DFI 相比差異具有統(tǒng)計學意義（P= 0.000 ＜0.01），表明造模成功。見表1。

表1 兩組雄鼠DFI比較（±s）

表1 兩組雄鼠DFI比較（±s）

注：與A組比較，*P ＜0.01。

組別雄性空白對照組（A組）雄性造模組（B組）t值P值DFI（%）4.69±1.48 18.95±4.12**-10.308 0.000 n 10 10

2.3 雌鼠合籠情況比較

與C 組比較，D 組小鼠產(chǎn)仔數(shù)（P= 0.000）及活胎數(shù)（P= 0.000）均顯著降低，死胎率明顯增高（P=0.002）；與D 組比較，E 組產(chǎn)仔數(shù)（P=0.014）及活胎數(shù)（P=0.000）顯著增加。但兩組死胎數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 各組小鼠合籠情況比較（±s）

表2 各組小鼠合籠情況比較（±s）

注：與C 組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與D 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

死胎數(shù)0 1.75±1.39**1.00±1.12*組別C組D組E組n989產(chǎn)仔數(shù)9.89±1.90 5.13±2.10**7.56±1.67*△活胎數(shù)9.89±1.90 3.38±0.92**6.56±1.13**△△

3 討論

精子DNA 對于妊娠而言至關(guān)重要，雖然許多不育患者的精液分析報告顯示精子活力和濃度正常，但是他們中有近一半患者的精子DNA 碎片率增高［15］。因此，精子DNA 更能夠反映男性生殖能力，預測妊娠結(jié)局。臨床治療中也發(fā)現(xiàn)，與無相關(guān)病史的男性相比，有反復自然流產(chǎn)史夫婦中的男性，精子的活動率明顯較差，DFI增高［16-18］。當精子DFI小于27%時，受精后卵母細胞能夠修復受損的精子DNA，但如果DFI超過這一數(shù)值，就超過了卵母細胞的修復能力，可能會出現(xiàn)不孕或自然流產(chǎn)［19］。

女性的孕育能力和其后代的健康在很大程度上依賴于源源不斷的優(yōu)質(zhì)卵母細胞。與體細胞相似，當卵母細胞受到各種內(nèi)外因素，如輻射、污染、炎癥、氧化損傷等影響，出現(xiàn)DNA 損傷后，會啟動DNA 損傷修復通路，DNA 修復可能是確保女性生育能力以及將高質(zhì)量的遺傳物質(zhì)傳遞給后代的重要機制［20］。卵子在形成時，會經(jīng)歷染色體解螺旋、復制、分離等過程，在這一時期染色體更容易受到外界因素的影響出現(xiàn)DNA 損傷。而且，隨著年齡的增大［21］、復制次數(shù)的增加以及外界不明原因的影響，會導致染色體出現(xiàn)復制錯誤、斷裂、基因片段丟失等情況，最終導致形成的卵子功能不全，甚至出現(xiàn)過早凋亡，在這期間卵母細胞的DNA 修復機制起著至關(guān)重要的作用［22］。然而，這種能力是有限的，可能隨著年齡的增長而下降［23］。

目前已經(jīng)有許多關(guān)于中藥修復精子DNA 的報道［24］，但未見中藥修復卵子DNA 的相關(guān)報道。關(guān)于中藥提高卵子質(zhì)量方面的報道更為常見，中藥能夠明顯提高卵子的質(zhì)量，減少促排卵時促性腺激素的使用，提高妊娠率、活產(chǎn)率，改善妊娠結(jié)局［25］。在輔助生育技術(shù)中，中醫(yī)藥同樣也發(fā)揮著重要作用，補腎類中藥能夠改善卵子質(zhì)量、提高受精率、降低不良反應及流產(chǎn)率，總體提高輔助生育的成功率［26-27］。目前認為卵細胞中線粒體功能與卵子質(zhì)量密切相關(guān)［28］，經(jīng)典補腎填精中藥方劑毓麟珠可通過改善卵巢功能不全模型小鼠的線粒體功能提高卵子質(zhì)量［29］。也有學者發(fā)現(xiàn)采用自擬經(jīng)后增殖方（組成：黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、熟地黃、白芍、當歸、川芎、菟絲子和鹿角霜等）能夠提高超促排卵大鼠卵母細胞質(zhì)量，具體機制可能與提高GDF9、BMP15 和FGF10（分泌因子）的表達有關(guān)［30］。

通過臨床觀察并結(jié)合文獻發(fā)現(xiàn)，許多不孕癥女性患者常見的臨床證型為腎虛血瘀型，尤其是卵巢功能低下及卵巢早衰患者［31］。眾多醫(yī)家也主要通過補腎活血法改善患者卵巢功能［32-33］。因此，近年來課題組將原本改善男性生殖細胞質(zhì)量的益腎通絡(luò)方應用于女性患者，尤其是高齡女性患者，取得了較好的療效。但中醫(yī)藥是如何通過提高卵母細胞DNA 修復能力從而提高妊娠率的機制尚不明確，本研究為中醫(yī)藥提高卵母細胞DNA 修復能力提供初步證據(jù)，但仍需進一步探討其確切機制。

綜上所述，BaP 染毒可造成雄鼠DFI 升高，降低合籠雌鼠妊娠率。益腎通絡(luò)方提前干預雌鼠可改善其與高DFI雄鼠合籠的妊娠結(jié)局。具體機制推測可能與益腎通絡(luò)方改善卵子的DNA修復能力有關(guān)。