趙怡凡 劉天鵬 趙少川 芮 琛 楊 鋒

1.陜西中醫(yī)藥大學研究生院，陜西咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨傷科，陜西咸陽 712000

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量降低、骨組織微觀結(jié)構破壞為特征的全身代謝性疾病。OP的發(fā)生與年齡增長呈正相關，在2019 年流行病學調(diào)查中，我國60 歲以上人群的骨質(zhì)疏松患病率為36%，隨著人口老齡化，我國面臨的骨質(zhì)疏松問題將愈為突出[1]。目前臨床上防治OP 的常用藥物有抗骨吸收、促骨形成兩大類，其中抗骨吸收類有：雙膦酸鹽類、降鈣素類、雌激素類；促骨形成的有：甲狀旁腺類、鍶鹽類和活性維生素類。其臨床療效顯著，但也存在諸多不良反應[2]，如雙膦酸鹽類可造成下頜骨壞死[3]，雌激素類可增加心血管疾病發(fā)生的風險[4]。因此發(fā)掘新的靶向治療OP 的藥物有重大的臨床意義。黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，已被證實具有抗骨質(zhì)疏松活性，且不良反應小、價格低廉、作用機制廣泛，是安全理想的天然抗骨質(zhì)疏松用藥[5]。黃腐酚（Xanthohumol，XN）是啤酒花中特有的一種黃酮類化合物，具有強大的抗氧化應激、抗炎、抗癌細胞增殖等藥理作用，并且可作用于成骨細胞（osteoblast，OB）和破骨細胞（osteoclast，OC），靶向刺激相關細胞因子，促進OB 增殖和抑制OC 分化[6]。有相關文獻報道，目前國外已有關于XN 防治OP 的專利得到審批[7]。因此加大開發(fā)有關XN治療OP 的靶向治療研究，并加強對臨床治療的轉(zhuǎn)換具有廣闊的前景，本文基于XN 抗OP 的機制研究作一總結(jié)。

1 XN 防治OP 細胞水平及相關信號通路的研究

1.1 XN 參與OB 分化及相關信號通路的研究

OB 在骨骼發(fā)育中具有重要作用，OB 的分化異常則會造成骨代謝紊亂，從而引發(fā)OP 等疾病[8]。有研究證明，成骨細胞與成脂細胞存在競爭性分化的關系[9]，當成脂細胞的分化增高時會對OB 的增殖產(chǎn)生抑制作用，影響OB 的分化與成熟。XN 可通過刺激成骨轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、過氧化物酶體增殖物活化受體γ（peroxisome proliferators activatedreceptor γ，PPARγ）來促進OB 的增殖與轉(zhuǎn)化，抑制脂肪細胞的生成[6,10]。另外，機體在氧化應激狀況下會致使體內(nèi)活性氧化物（reactive oxygenic species，ROS）堆積，刺激OB 的凋亡[11]。當OB 凋亡過多時則會造成骨形成的減少從而引發(fā)OP 的發(fā)生。研究證明，XN 可刺激核因子紅細胞2 相關因子2（nuclear factor eiythroid-2-related factor，Nrf2），促進機體抗氧化應激能力的表達，清除體內(nèi)堆積的氧化活性產(chǎn)物，抑制OB 的凋亡[12]。

1.1.1 成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2 成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2 具有促進細胞向成骨和軟骨方向分化，在OB 轉(zhuǎn)化中尤為重要，Runx2 能夠促使未成熟的OB 增殖和分裂，使未成熟的骨細胞轉(zhuǎn)化為成熟的骨細胞[13]。在特定的誘導環(huán)境下，Runx2 還能夠促使特定的成骨發(fā)育目基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后生成骨鈣素、骨膠原等對骨組織生成具有重要作用的蛋白[14]。研究證明，降低小鼠Runx2表達后，其成骨細胞分化受到抑制[15]。綜上，說明Runx2 在促使OB 的增殖分化中具有重要作用。Jeong等[16]研究XN 對小鼠C2C12 細胞分化的影響，將C2C12細胞放入XN 溶液中培養(yǎng)，經(jīng)檢測提示EPK、P38 活性隨濃度依賴性顯著增加，提示XN 可通過上調(diào)EPK、P38 的磷酸化來激活Runx2 的表達。夏天爽等[17]將小鼠成骨細胞除空白組外給予地塞米松（Dexamethasone，DEX）損傷，經(jīng)Western blot 檢測顯示XN 可顯著促進Runx2 的表達，并在對骨代謝指標的檢測中發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶等成骨基因上升。參考上述文獻，提示XN可對Runx2 的表達進行上調(diào)來促進OB 的增殖分化，并通過Runx2 表達的增加使成骨相關基因的上升，從而對OP 的發(fā)展產(chǎn)生一定的抑制作用。

1.1.2 成脂轉(zhuǎn)錄因子PPARγ 成骨細胞和成脂細胞具有競爭性分化的關系，脂肪細胞的分化是一個嚴格調(diào)控的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)過程，PPARγ 是脂肪形成過程中的關鍵調(diào)節(jié)因子，在成脂分化過程中，AMP 反應原件結(jié)合蛋白磷酸化，誘導CEBP-β 的表達，在此基礎上激活CEBP-α 與PPARγ 的轉(zhuǎn)錄，維持成脂過程的完成[18]。實驗證明，當敲除PPARγ 基因時胚胎干細胞的脂肪形成的過程則幾乎不能完成[19]。Kiyofuji 等[20]通過培養(yǎng)小鼠3T3-L1 細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化，隨后置入不同濃度XN 中干預，結(jié)果顯示，XN 的表達呈成濃度依賴性抑制PPARγ 的表達。Yang 等[21]將3T3-L1 細胞分化為脂肪細胞，分時間段干預，通過電泳檢測可見XN 顯著降低PPARγ，以24 h 時為著。以上研究表明XN 可通過限制PPARγ 的表達來限制脂肪細胞的分化?；诔晒羌毎统芍毎g的競爭性分化，而XN 可通過促進Runx2 的表達而上調(diào)OB 的分化。因此，對于XN 是否可通過抑制PPARγ 的表達而促進OB 分化的研究具有巨大的前瞻性意義。

1.1.3 抗氧化應激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 氧化應激是指體內(nèi)氧化能力與抗氧化能力失衡使ROS 堆積過多，導致細胞及組織損傷，抑制成骨分化的表達，如堿性磷酸酶，Ⅰ型膠原及Runx2 分化的減少，導致OB 的凋亡及骨形成的減少，促使OP 的發(fā)生[22]。Nrf2 是體內(nèi)重要的抗氧化應激轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，Nrf2 與細胞質(zhì)中的Keap1 結(jié)合被泛素化降解；在氧化應激刺激下，Nrf2-keap1 復合物被解離，并轉(zhuǎn)運到細胞核，與抗氧化反應元件結(jié)合，促使各種抗氧化酶的表達，如谷胱甘肽過氧化物酶、谷氨酸半胱氨酸連接酶等[23]。Suh等[24]通過甲基乙二醛（methylglyoxal，MG）誘導MC3T3-E1 成骨細胞ROS 以及線粒體超氧化物的堆積造成細胞凋亡。將細胞置于XN 中預處理，隨后置于MG中暴露，經(jīng)檢測表明MG 造成的ROS 堆積明顯下降，Nrf2 水平隨XN 濃度呈依賴性增加。因此，XN 可能通過對Nrf2 的表達進行上調(diào)，促進體內(nèi)抗氧化物的產(chǎn)生或抗氧化活性的增高，抑制ROS 的堆積，從而減少氧化應激對OB 損害的可能性。鑒于此，XN 強大的抗氧化應激能力在防治OP 方面具有廣闊的前景。

1.2 XN 參與OC 分化及相關信號通路的研究

OC 是由造血干細胞分化的多核細胞，在核因子受體激活因子-κB 配體[receptor activator of nuclear factor-κB（NF-κB）ligand，RANKL]和巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）的刺激下可促使單核細胞向OC 分化成熟。M-CSF 可促進單核細胞增值與存活，而RANKL 則誘導OC 的分化成熟[25]。兩種信號因子可通過一系列信號傳導促進OC 的分化。XN 可抑制部分信號的傳導，如NF-κB、鈣離子/鈣調(diào)磷酸酶/NFAT 通路（Ca2+/NFATc1）、絲裂素活化蛋白激酶（mitin-activated protein kinase，MAPK）等，對OC 的分化成熟造成干擾，抑制OC 的分化成熟[6]。

1.2.1 NF-κB 通路 NF-κB 屬于促進OC 分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，未活化前與亞單位IkB 在細胞質(zhì)中結(jié)合。當受到相關因子的刺激而激活后，IkB 降解，促使NF-κB 進入細胞核中，啟動基因的轉(zhuǎn)錄與表達，促使OC 的分化與成熟。RANKL 與RANK 相結(jié)合，活化NF-κB/IκB 復合物，促使IκB 的降解與分離，NF-κB 轉(zhuǎn)位進入細胞核中促使OC 的分化與成熟[26]。Li 等[27]將實驗組RAW264.7 細胞置于XN 中預處理，隨后加入RANKL 誘導OC 的分化，對照組只進行RANKL 處理，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)實驗組較對照組IκB 蛋白降解明顯降低。謝娟[28]將RAW264.7 細胞置于標記過的NF-κB溶液中培養(yǎng)，隨后置于不同濃度的XN 和RANKL 溶液中，將細胞裂解，進行熒光素酶報告基因分析，結(jié)果提示，RANKL 可激活NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，而XN 呈濃度依賴式抑制RANKL 激活的NF-κB 的轉(zhuǎn)錄。鑒于NF-κB 在OC 的分化中的重要作用，因此研究抑制NF-κB 的分化具有重大意義。參考上述研究，XN 對NF-κB 的轉(zhuǎn)錄確有抑制作用，并可能通過抑制IκB 的降解來產(chǎn)生，但XN 對NF-κB 的最佳抑制劑量尚未明確，因此選擇合適劑量的XN 來抑制NF-κB 轉(zhuǎn)錄的相關研究有待進一步完善。

1.2.2 Ca2+/NFATc1 通路 T 細胞胞質(zhì)1 的核因子（nuclear factor of activated T-cells 1，NFAT1）是破骨細胞分化的一個關鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要誘導破骨細胞在晚期的分化成熟。NFAT 家族主要通過Ca2+激活的鈣調(diào)磷酸酶來調(diào)控，當受到RANKL 的刺激與激活后，NFAT 的絲氨酸結(jié)合位點可被去磷酸化，促進NFATc1的入核，完成基因的轉(zhuǎn)錄，促進OC 的分化成熟，當敲除小鼠的NFAT 基因后，在RANKL 的刺激下小鼠干細胞不能完成OC 的相關分化[29]。Suh 等[30]將RAW264.7細胞置于RANKL 中處理，隨后置于不同濃度的XN中培養(yǎng)。結(jié)果顯示在4 μg/ml 的XN 干預下，NFAT1顯著下降，表明黃腐酚可通過抑制NFAT1 的分化來達到抑制OC 分化的作用。另有研究表明，Ca2+振蕩是維持NFAT 轉(zhuǎn)錄的關鍵因素，Ca2+振蕩被抑制時，NFAT 則不能完成轉(zhuǎn)錄，OC 的分化也受到抑制[31]。Li等[27]將BMM 細胞置于鈣流皿中，實驗組加入XN 及RANKL 以誘導Ca2+振蕩；對照組只加入RANKL，結(jié)果顯示實驗組Ca2+振蕩較對照組明顯降低。NFAT 在OC分化中的作用具有重要意義，Ca2+振蕩在促進NFAT轉(zhuǎn)錄中的作用也已得到證實，上述研究提示XN 可能通過抑制Ca2+振蕩來抑制OC 的分化，預示著XN 在防治OP 發(fā)生的治療中具有巨大的發(fā)展前景。

1.2.3 MAPK 通路 MAPK 是維持OC 分化的重要通路，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinases，EPK）、P38、JNK。RANKL 可激活MAPK，誘導EPK、NFAT1、c-fos 等來刺激OC 的分化，其中EPK1/2 在破骨細胞的分化、成熟及凋亡中尤為重要[32]。M-CSF 與c-Fms 結(jié)合，導致c-Fms 尾部的酪氨酸殘基的磷酸化，與MEK2 相結(jié)合，激活EPK1 的轉(zhuǎn)錄，促進EPK1 從細胞質(zhì)進入細胞核中，啟動下級相關因子的磷酸化完成OC 的轉(zhuǎn)錄，當敲除小鼠的EPK基因，小鼠體內(nèi)的OC 分化、成熟及轉(zhuǎn)運將會受到顯著限制[33]。Suh 等[30]將RAW264.7 細胞分別置于RANKL中培養(yǎng)，隨后置于不同濃度的XN 中干預，隨后進行PCR 檢測，結(jié)果顯示，EPK1 以及c-fos 水平受到明顯抑制。參考上述研究，推測XN 通過抑制RANKL 對MAPK 的作用，減少其下游相關信號的激活來限制OC的分化、成熟，受限于相關研究量及研究深度不足，尚需加強進一步研究以增強研究的準確性。

2 展望

隨著我國人口老年化進程不斷加快，OP 防治已成為了一個社會性難題。西藥見效快但不良反應多且價格較貴，故人們漸漸將目光轉(zhuǎn)向強調(diào)整體防治且不良反應小的天然植物成分中來。關于XN 的細胞實驗已經(jīng)證明XN 在防治OP 方面具有重要的潛在價值。XN 作為一種植物黃酮類成分，具有強大的抗炎及清除氧自由基的作用，并可通過RUNX2、MAPK、NF-κB 等多種通路調(diào)節(jié)降低骨代謝紊亂所造成的骨小梁缺損及骨礦丟失，同時也可以直接作用于OB 和OC 來影響骨基質(zhì)的吸收與形成，從多方面來綜合實現(xiàn)骨保護作用。我們在探索及回望成就的同時也要清楚客觀地意識到：在XN 防治OP 的藥物研發(fā)上，仍存在研究不夠深入等問題，如XN 抗骨質(zhì)疏松的具體活性成分的靶點不夠明確、具體作用分子機制研究不夠全面等，還需深入的進一步研究。期待在未來能擴大有關XN防治OP 方面的研究，并加快其對臨床治療的轉(zhuǎn)換，在闡明OP 的根本發(fā)病機制的基礎上完善臨床行之有效的防治策略。