吳儷媛陳夢冰李夢華邱士偉喬月華張巖時晰,*

1徐州醫(yī)科大學聽覺與平衡醫(yī)學研究所(徐州 221004)

2江蘇省人工聽覺重點實驗室(徐州 221004)

3徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床聽力中心(徐州 221006)

4福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科(福州 350005)

5暨南大學第二臨床醫(yī)學院（深圳市人民醫(yī)院）(深圳 518020)

6吉林大學白求恩第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(長春 130021)

Waardenburg綜合征(Waardenburg syndrome，WS)，又被稱為聽覺-色素綜合征，它是引起綜合征性耳聾的最常見的原因之一，與2%-5%的先天性耳聾病例有關。WS遺傳方式主要為單基因致病的常染色體顯性遺傳伴不全外顯[1,2]。WS屬神經(jīng)嵴疾病之一，是由于神經(jīng)嵴細胞發(fā)育異常而導致的一組臨床癥候群。荷蘭眼科學家及遺傳學家Waardenburg[2]于1951年首次報道并以其名字命名該綜合征。

全世界范圍不同人種及不同性別均有病例報道，據(jù)推測白色人種WS人群發(fā)病率為1/42 000，占先天性耳聾的1.43%。在我國，楊淑芝等[3]對來自18個省份（自治區(qū)）及2個直轄市的30個聾?；蛎@兒康復機構的2466名在校學生進行抽樣調查，共采集到WS病例17例，構成比為0.69%；其中Ⅰ型病例9例，Ⅱ型病例8例，未收集到Ⅲ型和Ⅳ型病例，我國先天性聾啞兒童患者中WS患者可能比國外少，但目前缺少對WS的大規(guī)模流行病學調查研究。

目前根據(jù)附加體征，WS病例被進一步分為4個亞型。Waardenburg綜合征I（WS1）伴內眥異位，Waardenburg綜合征II（WS2）不伴內眥異位，Waardenburg綜合征 III（WS3）合并上肢異常，又稱Klein-Waardenburg綜合征，Waardenburg綜合征VI（WS4）常伴先天性巨結腸等胃腸道畸形及周圍神經(jīng)脫髓鞘病變、中樞髓鞘形成障礙等神經(jīng)病學改變，又稱Waardenburg-Shah綜合征。根據(jù)W指數(shù)可以區(qū)分兩種類型：W>1.95為WS1，W<1.95為WS2[4]。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，與WS明確相關的基因有6個，分別為MITF、PAX3、EDNRB、EDN3、SOX10及SNAI2，這些基因相互作用，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中占有不同地位[5-7]。EDNRB（endothelin receptor type B）基因即內皮素受體B型基因，對神經(jīng)嵴發(fā)育的起到調控作用，其蛋白屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G Proteincoupled receptor,GPCR)的視紫紅質超家族。在EDNRB中，純合子和不太頻繁的雜合子突變導致WS2和WS4的產(chǎn)生[8]。本文主要對EDNRB基因在Waardenburg綜合征中所扮演角色予以詳細綜述。

1 EDNRB基因及其蛋白結構的概述

EDNRB基因和蛋白質在脊椎動物中呈高度保守狀態(tài)[9]。人源性EDNRB基因位于13號染色體上，其含有7個外顯子和6個內含子。人源性EDNRB全長442氨基酸，預測分子質量約為50kDa，與EDNR序列同源性為64%。小鼠、大鼠、牛、山羊和豬的EDNRB長度在441-443個氨基酸范圍內，與人EDNRB具有高度的序列同源性[10]。EDNRB在許多組織中均有表達，特別是在結腸粘膜下層的肌間神經(jīng)叢、粘膜層、神經(jīng)節(jié)和血管中表達較高[11]。

EDNRB蛋白屬于GPCR的視紫紅質超家族，由一個長的胞外末端序列、7個螺旋跨膜結構域(Transmembrane domains,TMDs)、3個細胞外環(huán)和3個細胞內環(huán)以及一個細胞質C末端組成。其中TMD I-III和VII以及相鄰的細胞外回路構成了激動劑結合結構域。TMD IV-VI和鄰近的細胞外環(huán)參與受體的選擇性結合，與羧基末端尾部構成信號傳導域。EDNRB的翻譯后修飾主要包括棕櫚酰化、磷酸化和潛在的糖基化。定點突變和[3H]棕櫚酸研究結果表明，人源性EDNRB羧基尾部存在三個半胱氨酸殘基(Cys402、403和405)是潛在的棕櫚?；稽c。C端棕櫚?；潭瓤赡苡绊懪cG-蛋白的偶聯(lián)及影響下游信號通路和EDNRB磷酸化。目前已經(jīng)確定了13個磷酸化位點，主要集中在C端(435-442AA)。EDNRB磷酸化可能會影響受體功能，GPCR激酶(GRKs)或β-arrestins在第三細胞質環(huán)和/或C末端尾部的磷酸化可能參與受體脫敏。EDNRB在Asn59含有糖基化位點，但似乎不影響配體結合[10]。EDNRB對EDN1、EDN2和EDN3這三個配體都有很高且相似的親和力。雖然EDNRB可以結合這三種內皮素，但對EDN3和EDNRB人和小鼠突變體的相似表型的觀察表明，EDN3是EDNRB的主要生理配體[12]。EDNRB與其配體之間的相互作用面積較大，這就很好地解釋了EDNs的異常高的親和力。EDNs結合誘導受體的構象發(fā)生變化，從而導致效應器的激活以及內化，EDNRB內化的作用是導致受體和配體的降解[9]。

2 EDNRB基因對神經(jīng)嵴發(fā)育的調控作用

神經(jīng)嵴細胞（neural crest cells，NCC）是胚胎發(fā)生早期，起源于神經(jīng)管背側的多能遷移細胞。學術界，根據(jù)NC細胞在前后胚軸上的初始位置，已經(jīng)確定了四個NC細胞亞群，這些細胞在發(fā)育過程中聚集在胚胎的各個區(qū)域，并參與不同組織和器官的形成。根據(jù)類別和局部模式信號，NC細胞可以分化成多種譜系，包括黑素細胞、神經(jīng)內分泌細胞和各種結締組織，包括顱面骨骼的骨和軟骨，以及心臟近端流出道的平滑肌、外周神經(jīng)系統(tǒng)的一些神經(jīng)元和膠質細胞，以及腸神經(jīng)系統(tǒng)的所有神經(jīng)元和膠質細胞[9]。

大量的研究已經(jīng)證實內皮素介導的信號在神經(jīng)嵴衍生細胞系的發(fā)展中起著至關重要的作用。在脊椎動物中，EDNRB首先在神經(jīng)管的背端表達，然后在NCC的背腹側和背側通路上表達[12]。Shin等[11]在1999年建立了一種能誘導表達EDNRB的小鼠。證明EDNRB信號通路在E10和E12.5小鼠胚胎中，對于黑素細胞和腸道神經(jīng)母細胞前體的起始和正確遷移至關重要。此外該信號通路對小鼠黑素細胞的存活、增殖和/或遷移起到關鍵調控作用，但對于遷移前增殖或能否決定遷移并非必要條件。此外，靶向敲除小鼠EDNRB基因實驗同樣證實EDNRB在黑素細胞和腸道發(fā)育中發(fā)揮了關鍵作用[12]。

3 EDNRB基因突變與Waardenburg綜合征的聯(lián)系

1951年，Waardenburg的研究結果發(fā)表在《美國人類遺傳學雜志》上，定義了現(xiàn)在被命名的I型Waardenburg綜合征[13]。WS是一種常見的綜合性耳聾，其特征是皮膚、頭發(fā)、眼睛和耳蝸血管紋中缺乏NCC衍生的黑素細胞[11]。

WS2主要表現(xiàn)為先天性感音神經(jīng)性聾和色素異常，直到1971年，Arias[13]才發(fā)現(xiàn)了Waardenburg綜合征的這一獨立分支，他將其命名為II型。WS2診斷的臨床標準至少描述為以下兩種：先天性感音神經(jīng)性聾、白額、虹膜完全或節(jié)段性異色、發(fā)育不良的藍眼、早期灰化和一級親屬受累[14]。WS4又稱Waardenburg—Shah綜合征或Waardenburg—Hirschsprung病，其主要特征為患者常伴先天性巨結腸或胃腸道閉鎖，部分WS4病例可出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，包括周圍神經(jīng)病變、智力遲鈍、小腦共濟失調和四肢痙攣[2]。迄今為止，大約5%的WS2和25-35%的WS4病例報告了EDNRB和/或EDN3突變[9]。

Doubaj等[15]報告了一個3個月大的摩洛哥女孩，其患病類型為WS4型?；颊哂?個表親在嬰兒期死亡，癥狀相同。Sanger測序的分子分析表明，EDNRB基因的外顯子6中發(fā)現(xiàn)了一種純合子錯義突變c.1133A>G(P.Asn378Ser)，這一變化導致了天冬酰胺-378殘基被絲氨酸殘基所取代，從而導致胺基取代羥基，引起疾病的發(fā)生。Loupe等[16]的研究發(fā)現(xiàn)患者在RPS6KA3的第289密碼子發(fā)現(xiàn)了一個新的2 bp缺失(c.865_866delCA)，導致RSK2的框架移位和過早終止，使整個EDNRB基因的雜合缺失，導致父親、一個兒子和兩個女兒患有WS4。Sangkhathat等[17]的研究發(fā)現(xiàn)EDNRB基因在外顯子2的第196密碼子檢測到一個純合錯義突變(Ser196Asn)，即該密碼子的第二個核苷酸發(fā)生的變化可能會導致氨基酸天冬酰胺取代絲氨酸從而引發(fā)WS4。Syrris等[18]用標準的DNA突變分析和測序技術篩選了一個結合WS-HSCR表型的家族，以了解EDNRB位點的突變，其在密碼子253(CGA→TGA，Arg→STOP)上發(fā)現(xiàn)了一個新的無義突變。這種突變導致EDNRB在第3外顯子的翻譯過早結束，并預測它會產(chǎn)生一個截短的非功能的EDNRB從而導致WS4。Ohtani等[19]研究了WS4小鼠，是模擬人類WS4的動物模型，在此研究中，作者檢測了WS4小鼠Ednrb基因的基因組序列，發(fā)現(xiàn)該基因有598bp的缺失。被刪除的區(qū)域包含外顯子2的整個區(qū)域和外顯子3的5'端部分，并且兩側是反向重復序列，這被認為是觸發(fā)刪除的原因。因此作者認為Ednrb基因的缺失是WS4小鼠表型突變的主要原因。Matsushima等[20]報道了另一種WS4小鼠模型，由于外顯子2和3的缺失，它們的Ednrb缺乏編碼Ednrb跨膜結構域的318個核苷酸。內皮素3及其受體之間的相互作用是黑素細胞和奧爾巴赫叢細胞正常分化和發(fā)育所必需的。所以該文獻的結論是，這里缺失的相互作用導致了這些細胞的缺乏，進而導致了WS4小鼠的色素沉著異常、耳聾和巨結腸。

Somashekar等[21]在攜帶純合突變的先證者中觀察到EDNRB的另一新的突變類型c.673G>A[p.（Gly225Ser）]，患者表現(xiàn)為WS2的特征且無先天性巨結腸表征。Issa等[14]篩選了49例疑似WS2診斷的EDNRB突變或缺失患者，先前發(fā)現(xiàn)MITF和SOX10突變陰性。在這個系列中，作者在EDNRB中發(fā)現(xiàn)了四個新的雜合突變，且在主要數(shù)據(jù)庫中均未見報道。在家系2中，作者發(fā)現(xiàn)c.50T>c變異導致信號肽中的p.Leu17Pro改變，可以通過SIFT（有害，得分：0.03）和 MutationTaster軟件（致病，p：0.607）來預測，而不能通過PolyPhen-2軟件（良性，得分：0.332）來預測。在家系3中，作者發(fā)現(xiàn)c.467C>G變異導致第二跨膜結構域的p.Pro156Arg改變，這三個預測軟件均判斷為“高致病性”（SIFT有害，得分：0；MutationTaster：致病，p：1；PolyPhen-2：損傷，得分：0.999）。在家系4中，一個內含子變異c.484-5T>G，被預測改變外顯子2上游的剪接受體位點。最后，在家系5中發(fā)現(xiàn)的變異，c.678G>A，被預測截斷蛋白質（p.Trp226*）。

通常來說EDNRB突變導致WS2或者WS4，但隨著研究的深入，越來越多證據(jù)表明EDNRB突變同樣與WS其余的類型有關聯(lián)。Cheng等[4]的研究表明，EDNRB基因變異在一個患有WS1的中國家庭中被發(fā)現(xiàn)。按照WS的評定標準，19歲男孩，其姐及一名旁系親屬被確診。先證者EDNRB基因外顯子2編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)一個錯義雜合突變。在先證者患病的旁系親屬和姐姐身上也發(fā)現(xiàn)了同樣的突變。隨后的研究證實EDNRB中的c.469A>G雜合突變可能致具有病性。這是中國WS1患者中首次報道EDNRB突變?yōu)闈撛诘闹虏⊥蛔儭orimoto等[22]的研究發(fā)現(xiàn)一列先證者EDNRB基因中有一個純合錯義突變(p.R319W)而導致的WS1。p.R319W突變EDNRB的模型顯示該區(qū)域帶正電荷的表面積減少，這可能降低EDNRB與G蛋白的結合能力，并導致WS表型下的異常信號轉導。

4 發(fā)病機制

目前較為認可的WS發(fā)病機制有兩種學說：單倍體劑量不足學說和顯性負效應學說，但二者只能解釋部分WS發(fā)病機制。其中單倍體劑量不足學說認為基因雜合突變中，兩個等位基因中的一個突變基因（無義突變、移碼突變和錯義突變）導致其所編碼的蛋白質失去正常功能或保留部分功能，另一個野生型基因編碼的蛋白質的量不能達到兩個正常等位基因編碼的蛋白質行使正常功能所需生物量的閾值，從而造成突變基因編碼的蛋白質不能發(fā)揮正常的生理功能。不同個體癥狀嚴重程度的差異可能是由于殘留的正常野生蛋白量的不同以及不同個體不同器官中黑色素細胞發(fā)育所需野生蛋白量不同所致。EDNRB基因突變可因為單倍體劑量不足效應導致WS。顯性負效應學說主要認為，在兩個等位基因中如果一個基因突變，另一個基因保持野生型，即使突變的基因完全失去功能，理論上這一對等位基因仍應保留50%功能。但某些情況下突變的蛋白質不僅自身不能發(fā)揮正常生理功能，還使正常蛋白質也不能發(fā)揮功能，這種蛋白質相互作用中的干擾現(xiàn)象稱為顯性負效應。EDNRB基因突變同樣存在因顯性負效應抑制野生蛋白功能最終導致WS的可能性[23,24]。

綜上，EDNRB基因的一些突變導致蛋白表達的下降、蛋白質相互作用的干擾和ETBR功能的喪失，繼而影響黑素細胞的增殖和分化。黑素細胞被認為是血管紋的中間細胞，該細胞發(fā)育不良或減少，將會影響耳蝸血管紋分泌內淋巴的功能，進而引起聽力損失從而引起WS。

5 展望

經(jīng)過學者多年的研究，WS的分子遺傳背景得到了極大的豐富。盡管目前發(fā)現(xiàn)的EDNRB突變數(shù)量不斷增加，但對EDNRB突變導致WS的發(fā)病機制尚不明確。從神經(jīng)嵴發(fā)育到黑素細胞發(fā)育是一個非常復雜的網(wǎng)絡調控過程，EDNRB突變在這個網(wǎng)絡中的具體調控作用以及在調控中與其他蛋白的相互作用仍不明確。在WS發(fā)病中遺傳背景、基因修飾、環(huán)境因素等因素可能同樣具有重要意義，這些為今后研究WS發(fā)病機制提供了更多的潛在思路和研究方向。

目前人工耳蝸的植入是治療耳聾的一種較為普遍的手段，關于WS患者人工耳蝸植入效果的報道不多，盡管大部分現(xiàn)有報道表明術后效果良好，與其他耳聾無明顯差別，但仍有一些研究認為部分WS患者術后效果不佳[25]。因此深入研究WS的發(fā)病機制，為徹底解決WS臨床治療難題奠定必要理論基礎。