劉輝敏 田瑤 貝承麗 傅滿(mǎn)姣

終止全球結(jié)核病流行的關(guān)鍵在于控制傳染源、切斷傳播途徑。研發(fā)高敏感度和高特異度的檢測(cè)技術(shù)及試劑以對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核進(jìn)行早診斷、早治療，對(duì)降低結(jié)核病的發(fā)病率極為重要。病原學(xué)陽(yáng)性是診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。痰抗酸桿菌涂片簡(jiǎn)單、有效，但痰標(biāo)本的質(zhì)量難以保證、陽(yáng)性率低，且無(wú)法有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)與非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)[2]。MTB培養(yǎng)可有效提高病原學(xué)陽(yáng)性率，但周期長(zhǎng)，易延誤診治[3]。分子生物學(xué)檢測(cè)可有效提高活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰液病原學(xué)的檢出率，臨床應(yīng)用廣泛[4]。通過(guò)基于氣管鏡的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)聯(lián)合分子生物學(xué)檢測(cè)、肺組織活檢，以及超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢(endobronchial ultrasound-transbronchial needle aspitation，EBUS-TBNA)等檢測(cè)技術(shù)獲取深部組織和分泌物亦可有效提高檢出率[5]，但費(fèi)用昂貴且為有創(chuàng)操作，大部分患者難以接受。

為提高活動(dòng)性肺結(jié)核診斷的準(zhǔn)確率，尋找病原學(xué)依據(jù)極為重要，但我國(guó)存在大量病原學(xué)陰性(抗酸染色、核酸檢測(cè)、培養(yǎng)等方法無(wú)法檢出MTB)的活動(dòng)性肺結(jié)核患者，缺乏便捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)及明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，使得該類(lèi)患者難以確診[6]。我國(guó)《肺結(jié)核活動(dòng)性判斷規(guī)范及臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》指出，對(duì)于病原學(xué)陰性的肺結(jié)核活動(dòng)性判定，應(yīng)從以下方面綜合考慮：咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、乏力、盜汗、發(fā)熱、食欲減退等臨床表現(xiàn)；提示活動(dòng)性結(jié)核病的典型肺部影像學(xué)表現(xiàn)；免疫學(xué)檢測(cè)中結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)和γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assay，IGRA)陽(yáng)性提示結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)也具有一定的參考價(jià)值[7]。我國(guó)《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)提出：排除肺部其他疾病后，免疫學(xué)檢查中TST中度陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性、IGRA陽(yáng)性、MTB抗體陽(yáng)性3項(xiàng)中滿(mǎn)足任意一項(xiàng)，以及具有典型肺部結(jié)核病影像學(xué)表現(xiàn)，即可臨床診斷為結(jié)核病[1]。對(duì)于病原學(xué)依據(jù)不足的活動(dòng)性肺結(jié)核患者，免疫學(xué)檢測(cè)具有取材方便、價(jià)格低廉、快速、敏感的優(yōu)勢(shì)，具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣泛。

一、細(xì)胞免疫與細(xì)胞因子檢測(cè)

1.TST：TST將結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)注射到受試者體內(nèi)，通過(guò)人體的免疫反應(yīng)，觀(guān)察其是否出現(xiàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，以判斷是否感染過(guò)MTB[8]。我國(guó)人群普遍接種了卡介苗(bacille Calmette-Guérin，BCG)。PPD與BCG和NTM之間存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)特異度較低，假陽(yáng)性率高；對(duì)免疫受損人群的檢測(cè)敏感度不足；并且，其結(jié)果通過(guò)人為觀(guān)察得到，主觀(guān)性強(qiáng)。因此，TST陽(yáng)性結(jié)果僅能提示MTB感染，對(duì)于臨床判斷活動(dòng)性肺結(jié)核意義不大[9]。

2.IGRA：IGRA是一種以細(xì)胞免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)診斷方法，臨床應(yīng)用較廣泛。MTB基因組學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了此檢測(cè)方法的發(fā)展。BCG菌株及大多數(shù)非致病性分枝桿菌基因組中均缺乏MTB的RD1區(qū)；RD1區(qū)僅存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及少數(shù)致病性分枝桿菌基因組中。MTB的RD1區(qū)上Rv3874編碼的培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein-10，CFP-10)和早期分泌抗原靶蛋白6(early secreting antigen target-6，ESAT-6)是MTB的RD1區(qū)基因片段編碼的兩種主要抗原[10-11]，與機(jī)體內(nèi)Th1細(xì)胞結(jié)合，可引起強(qiáng)烈的、特異性的T細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致T細(xì)胞分泌大量γ-干擾素(IFN-γ)?；谠撛黹_(kāi)展的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-cell spot of tuberculosis，T-SPOT.TB)，對(duì)MTB抗原敏感的效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)，具有較高的敏感度和特異度，但檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性?xún)H表示體內(nèi)存在針對(duì)MTB的效應(yīng)T細(xì)胞，無(wú)法有效鑒別活動(dòng)性肺結(jié)核與LTBI[12-14]。國(guó)內(nèi)研究顯示，IGRA檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度為53%～98%，特異度為60%～90% (或以上)，差異較大[15]。但多數(shù)報(bào)道中IGRA檢測(cè)的敏感度和特異度均超過(guò)70%；在病原學(xué)陰性的活動(dòng)性結(jié)核病中，IGRA檢測(cè)的總體敏感度為80%，總體特異度為79%，均高于TST，可作為缺乏病原學(xué)依據(jù)的肺結(jié)核活動(dòng)性判斷的輔助手段[16-17]。

王婷等[18]發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB結(jié)果陽(yáng)性對(duì)診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度為91.0%，特異度為75.2%。Wang等[19]對(duì)T-SPOT.TB結(jié)果進(jìn)行深度分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)核特異性抗原(TB-specific antigen，TBAg)與植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)斑點(diǎn)數(shù)的比值可有效診斷活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI，以0.234為臨界值時(shí)，其敏感度為69.5%，特異度為94.1%，受試者工作特征曲線(xiàn)(ROC曲線(xiàn))下面積(AUC)為0.881，效果優(yōu)于T-SPOT.TB；以0.236為臨界值時(shí)，TBAg/PHA比值鑒別結(jié)核球與孤立性肺結(jié)節(jié)或腫瘤的敏感度為80.6%，特異度為93.3%，AUC為0.921；以0.129為臨界值時(shí)，TBAg/PHA比值對(duì)鑒別結(jié)核球和其他良性疾病的敏感度為85.1%，特異度為90.0%，AUC為0.909。此外，該比值對(duì)肺外結(jié)核亦有一定的診斷價(jià)值，同時(shí)該比值在抗結(jié)核治療中出現(xiàn)明顯下降，提示該指標(biāo)在有效區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病與LTBI的同時(shí)能對(duì)抗結(jié)核治療療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)[20-21]。Luo等[22]對(duì)T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果中ESAT-6斑點(diǎn)形成細(xì)胞平均斑點(diǎn)大小聯(lián)合改良TBAg/PHA比值鑒別活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI進(jìn)行研究，活動(dòng)性結(jié)核病患者ESAT-6斑點(diǎn)形成細(xì)胞平均斑點(diǎn)大小和改良TBAg/PHA比值均明顯高于LTBI者，建立二者的聯(lián)合診斷模型，以0.46為臨界值時(shí)，該模型鑒別活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的AUC值高達(dá)0.959，敏感度為90.12%，特異度為91.02%。

3.細(xì)胞因子檢測(cè)：結(jié)核病患者體內(nèi)免疫機(jī)制以細(xì)胞免疫為主，對(duì)于控制、殺滅MTB，巨噬細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。巨噬細(xì)胞吞噬MTB后，產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β等一系列的細(xì)胞因子，各細(xì)胞因子又可反向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抗菌活性。目前認(rèn)為，Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-12 等)促進(jìn)免疫應(yīng)答；Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)抑制免疫應(yīng)答。血漿中一些特異性的細(xì)胞因子和趨化因子能夠作為診斷活動(dòng)性結(jié)核病的免疫學(xué)標(biāo)志物，多種細(xì)胞因子的組合可以區(qū)分機(jī)體內(nèi)MTB的不同感染狀態(tài)。

IFN-γ是其中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，目前臨床上應(yīng)用廣泛。對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病患者，結(jié)核病初診時(shí)及抗結(jié)核治療期間和治療后的IFN-γ水平的變化存在爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為無(wú)明顯差異，也有研究顯示可出現(xiàn)下降或陰轉(zhuǎn)，亦有部分患者呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)[23-25]。隨著IL-2、單核細(xì)胞趨化蛋白2(MCP-2)、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)等細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)，一些IFN-γ水平較低、T-SPOT.TB陰性的活動(dòng)性結(jié)核病患者得到早期診斷和治療[26]。一項(xiàng)Meta分析表明，IP-10診斷活動(dòng)性結(jié)核病的AUC為0.88，診斷LTBI的敏感度和特異度分別為73%和83%[27]。Luo等[28]發(fā)現(xiàn)使用嗜酸粒細(xì)胞激活趨化因子、CCL22和MCP-1等3種細(xì)胞因子的組合能有效區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI，其敏感度為87.76%，特異度為91.84%，AUC為0.94。IFN-γ和IL-2分泌量與結(jié)核病的臨床疾病狀態(tài)有關(guān)，活動(dòng)性肺結(jié)核患者T細(xì)胞以分泌IFN-γ和IL-2為主，IL-2可作為鑒別活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的潛在生物標(biāo)志物。余艷艷等[29]對(duì)381份臨床樣本(256例結(jié)核病患者、69例非結(jié)核病患者、56名健康人群)進(jìn)行研究，其中結(jié)核病組排除陳舊性肺結(jié)核及LTBI者，發(fā)現(xiàn)IFN-γ和IL-2雙因子聯(lián)合檢測(cè)在活動(dòng)性結(jié)核病診斷中的雙陽(yáng)敏感度為75.12%，特異度為94%，可有效提高結(jié)核病的檢出率。隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，未來(lái)研究應(yīng)關(guān)注多種細(xì)胞因子聯(lián)合檢測(cè)，以提高診斷的準(zhǔn)確率。這可能是鑒別活動(dòng)性肺結(jié)核和LTBI及判斷結(jié)核病治療療效的關(guān)鍵。

二、體液免疫檢測(cè)

體液免疫檢測(cè)技術(shù)是診斷結(jié)核病的重要方法，臨床應(yīng)用較為普遍。多采用受試者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)酶聯(lián)免疫法、免疫膠體金滲濾法等來(lái)檢測(cè)受試者血清中的抗原、抗體、細(xì)胞因子水平，具有簡(jiǎn)單、高效、便捷等優(yōu)點(diǎn)。但其檢測(cè)的敏感度和特異度則會(huì)根據(jù)檢測(cè)方法及抗原抗體的變化而改變。

1.MTB抗原檢測(cè)：利用抗原抗體反應(yīng)測(cè)定人體內(nèi)抗原濃度判斷機(jī)體是否感染MTB。目前的MTB抗原有：PPD、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)、ESAT-6、CFP-10、抗原85(Ag85)復(fù)合物、38 kD抗原、31 kD抗原等。當(dāng)人體感染MTB后，抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，因此抗原檢測(cè)具有早期診斷意義。

LAM是構(gòu)成分枝桿菌細(xì)胞壁中脂多糖的主要部分，具有高免疫原性，可在尿液標(biāo)本中被檢出，具有高效、便捷、低廉、無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單、可床旁開(kāi)展等優(yōu)點(diǎn)[30-31]。對(duì)其檢測(cè)具有較髙的準(zhǔn)確度，可用于診斷CD4+T淋巴細(xì)胞<100個(gè)/μl或重癥HIV患者是否并發(fā)結(jié)核病。有研究評(píng)估痰液LAM檢測(cè)作為抗結(jié)核療效監(jiān)測(cè)的指標(biāo)，亦有一定的優(yōu)勢(shì)[32-33]。Rv3873、Rv3615c是MTB感染進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的早期標(biāo)志物。孫衛(wèi)國(guó)等[34]發(fā)現(xiàn)Rv2660c只能與活動(dòng)性結(jié)核病(包括病原學(xué)陽(yáng)性和陰性)患者血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)一條明顯的雜交條帶；LTBI者和健康對(duì)照者血清則無(wú)該條帶出現(xiàn)。劉永亮[35]發(fā)現(xiàn)Rv0183能夠刺激全血分泌IL-6，并且在活動(dòng)性結(jié)核病患者中的表達(dá)水平明顯高于LTBI人群和健康人群。唐潔等[36]利用Mtb-HAg-10k特異性誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病患者PBMC中IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)明顯低于LTBI者，可有助于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI。

某些抗原在MTB休眠狀態(tài)下特異性表達(dá)，如DosR蛋白抗原。Shi等[37]從25個(gè)DosR蛋白抗原中篩選出一組包含9個(gè)DosR蛋白抗原的組合，為HspX(Rv2031c)、Hrp1(Rv2626c)、DevR(Rv3133c)、Rv0569、Rv1996、Rv2030、Rv2628、Rv3129和Rv3131，該組合預(yù)測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度為10/10，預(yù)測(cè)LTBI的敏感度為9/10，特異度均為100%(14/14)，整體檢測(cè)正確率為97.1%。

MTB抗原檢測(cè)可避免因機(jī)體免疫應(yīng)答低下導(dǎo)致的假陰性，作為MTB存在的直接證據(jù)，對(duì)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核具有重要價(jià)值。但MTB抗原種類(lèi)及數(shù)目繁多，如何合理選擇抗原來(lái)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核目前尚無(wú)定論。單一抗原進(jìn)行診斷的效果欠佳，多種抗原的聯(lián)合檢測(cè)及相關(guān)抗原蛋白的融合表達(dá)為今后MTB抗原診斷的發(fā)展提供了新思路。

2.MTB抗體檢測(cè)：利用抗原抗體反應(yīng)測(cè)定人體內(nèi)抗體滴度判斷機(jī)體是否感染MTB。MTB抗體檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷具有一定的價(jià)值，特別是對(duì)痰涂片/痰培養(yǎng)陰性、少/無(wú)痰及肺外結(jié)核者[38]。但人體血液中抗體為多克隆抗體，MTB抗原檢測(cè)時(shí)易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性偏低；重癥結(jié)核病、HIV感染等免疫力低下者體內(nèi)的MTB抗原難以刺激機(jī)體產(chǎn)生足量的抗體，致使敏感度較低，存在假陰性可能；初愈結(jié)核病患者體內(nèi)MTB抗體濃度較高，存在假陽(yáng)性?；顒?dòng)性肺結(jié)核患者體液中MTB抗體水平較高，隨著治療進(jìn)展，MTB抗體水平降低，抗體檢測(cè)對(duì)結(jié)核病患者療效判斷有一定價(jià)值。

三、新技術(shù)與思路

以免疫學(xué)檢測(cè)為基礎(chǔ)的蛋白芯片技術(shù)是將不同的蛋白質(zhì)分子按預(yù)先設(shè)置的排列順序有序地固定在載體表面做成微陣列檢測(cè)芯片，用標(biāo)記了特定熒光物質(zhì)的抗原或抗體與其反應(yīng)，利用熒光掃描儀等檢測(cè)芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，再對(duì)各樣本中的蛋白進(jìn)行分析。其具有所需樣本量少、高通量、高敏感度、方便、快速等優(yōu)點(diǎn)[39]。Cao等[40]采用含有4262種抗原的蛋白質(zhì)芯片篩選可鑒別LTBI與活動(dòng)性結(jié)核病患者的血清生物標(biāo)志物，ROC分析顯示，Rv2031c、Rv1408、Rv2421c等3種抗原的AUC分別為0.8520、0.8152、0.7970。蛋白芯片技術(shù)是近年來(lái)新興的一種方法，也存在無(wú)法區(qū)分既往感染及現(xiàn)癥感染的不足，對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷意義有必要進(jìn)一步研究。

MTB入侵宿主體內(nèi)，宿主為抵抗會(huì)啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)，稱(chēng)為結(jié)核宿主反應(yīng)。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法獲取活動(dòng)性結(jié)核病患者全血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，篩選出可用于診斷活動(dòng)性結(jié)核病的多個(gè)基因標(biāo)志物，是診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的突破點(diǎn)[41]。Warsinske等[42]將Sweeney團(tuán)隊(duì)篩選出的在活動(dòng)性結(jié)核病患者中表達(dá)水平與其他患者明顯不同的3個(gè)基因(GBP5、DUSP3、KLF3)整合，創(chuàng)建了一個(gè)3-基因結(jié)核分?jǐn)?shù)(3-gene TB score)，可有效鑒別活動(dòng)性結(jié)核病與LTBI。將來(lái)基于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的新型宿主免疫學(xué)診斷標(biāo)志物的尋找也是鑒別肺結(jié)核活動(dòng)性的關(guān)鍵，為結(jié)核病免疫學(xué)診斷提供了新的思路。

四、總結(jié)

目前，對(duì)病原學(xué)陰性活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷仍是臨床診療中的熱點(diǎn)及難點(diǎn)問(wèn)題。對(duì)于痰液病原學(xué)陰性的患者，推薦使用支氣管鏡下肺泡灌洗、肺活檢等手段獲取病理學(xué)和病原學(xué)依據(jù)，如仍無(wú)法明確，則需通過(guò)臨床癥狀、影像學(xué)、免疫學(xué)、診斷性抗結(jié)核治療綜合判斷。

對(duì)于肺結(jié)核活動(dòng)性的判斷仍有許多問(wèn)題需要解決，包括研究高敏感度和特異度的檢測(cè)手段，發(fā)掘高效準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物，建立科學(xué)的診斷流程。多種抗原及細(xì)胞因子聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)于判斷肺結(jié)核活動(dòng)性有一定的價(jià)值，結(jié)核宿主免疫反應(yīng)相互作用機(jī)制的深入研究也為臨床診斷活動(dòng)性肺結(jié)核提供了新方法。但目前仍缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合新技術(shù)新方法，多種標(biāo)志物聯(lián)合診斷提高對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核診斷的敏感度和特異度是當(dāng)前診斷方法發(fā)展的趨勢(shì)，可能是未來(lái)鑒別肺結(jié)核活動(dòng)性和LTBI，以及預(yù)測(cè)結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，解決結(jié)核病患者精準(zhǔn)治療和精準(zhǔn)停藥等臨床問(wèn)題的關(guān)鍵。