侯會會，郭倩倩，曹楠婧，孫奮琪，李峰，郭素堂*

（1.山西醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001；2.山西省腫瘤醫(yī)院分子生物研究室，山西 太原 030013）

0 引言

結直腸癌在我國是一種常見疾病，近年來呈逐漸上升趨勢。結直腸癌的發(fā)生是一個多因素多階段的過程，涉及一系列遺傳和表觀遺傳學的改變，死亡率很高。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，癌基因及抑癌基因的失調(diào)與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性密切相關［1-2］。因此，結直腸癌治療迫切需要新的靶標及更有效的分子標記。

乙?；墙M蛋白最常見的翻譯后修飾，組蛋白乙?；绞芙M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；该富钚缘膭討B(tài)平衡調(diào)節(jié)［3］。許多研究表明組蛋白乙?；Ш馀c癌癥發(fā)生之間存在密切聯(lián)系。組蛋白H3K27乙酰化（H3K27ac）是發(fā)生在組蛋白H3，第27位賴氨酸的乙?；揎?，一般在調(diào)控細胞增殖和分化的基因中富集［4］。目前，H3K27ac是基因表達轉(zhuǎn)錄激活的一個標志［5-6］。有研究表明，在結直腸癌細胞中，H3K27ac激活lncRNA EIF3J-AS1的表達，促 進 細 胞 增 殖［5］，在 肺 癌 中 H3K27ac激 活LINC00519表達，且與患者的預后不良相關［7］。在前列腺癌中，H3K27ac與腫瘤分型相關［8］。在乳腺癌中，H3K27ac上調(diào)ZNF649基因的表達誘導曲妥珠單抗耐藥［9］。

TRIM家族蛋白有共同的氨基末端三分結構域：環(huán)-B盒-1/2螺旋線圈（RBCC）。其中環(huán)-B盒介導蛋白之間的相互作用，環(huán)結構具有E3泛素連接酶的特性［10］。依據(jù)羧基末端結構域不同，TRIM蛋白可分成13個亞型，TRIM11屬于C-IV亞家族，位于人11號染色體上［11］。TRIM11主要調(diào)節(jié)蛋白的翻譯后修飾，如磷酸化和泛素化，進而影響一些蛋白的降解［12］及PI3K/AKT等信號通路的激活［13］，參與機體免疫應答及腫瘤發(fā)生等［14］。近年來研究表明，TRIM11與人肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌和結直腸癌［15］的發(fā)生發(fā)展和預后相關。但是，TRIM11在結直腸癌發(fā)生中的生物學功能及其調(diào)控機制并不明確。近期有研究認為通過公共數(shù)據(jù)分析基因啟動子區(qū)域增強子區(qū)域H3K27ac水平，能夠預測基因轉(zhuǎn)錄激活［5-6］。通過公共數(shù)據(jù)在線分析，我們發(fā)現(xiàn)H3K27ac在TRIM11啟動子區(qū)域富集。

本研究分析了H3K27ac和TRIM11在結腸癌組織及其癌旁正常組織中的表達情況，并在細胞水平上研究了H3K27ac和TRIM11對結腸癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

結腸癌組織及其癌旁正常組織（＞5 cm）來源于山西省腫瘤醫(yī)院，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準。組織取出來后液氮冷凍-80℃保存。實驗所用結腸癌細胞系均獲贈于澳洲紐卡斯爾大學，為貼壁生長細胞，短期存放至-80℃，長期保存于液氮。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

用含有質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清（以色列BI公司）和質(zhì)量分數(shù)1%青鏈霉素混合液（北京索萊寶生物科技有限公司）的高糖DMEM（美國gibco公司）培養(yǎng)細胞，于37℃，體積分數(shù)5%CO2孵箱中孵育。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染

將TRIM11基因的cDNA克隆到載體pEX-3中，構建TRIM11過表達質(zhì)粒（上海吉瑪基因）。將sgRNA-NC：GGGCGAGGAGCTGTTCACCG及 sgRNA：TGCGTTGCTGTTCCAAGCCC連接到載體pGE-2（pU6gRNACas9puro）中，構建TRIM11敲低質(zhì)粒（上海吉瑪基因）。由脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000（美國Life Technology公司）轉(zhuǎn)染結腸癌細胞，SW480、SW620細胞（TRIM11低表達細胞）轉(zhuǎn)染TRIM11-Pex3（TRIM11過表達質(zhì)粒），DLD1、WiDr細胞（TRIM11高表達細胞）轉(zhuǎn)染TRIM11-sgR（TRIM11敲低質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染6 h換液，換為含有質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48 h收蛋白及RNA。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活性

將細胞以2000個/孔的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后檢測0 h、24 h、48 h和 72 h的吸光度值。檢測時向每孔加入10 μL CCK-8試劑（上海Dojindo公司）孵箱中孵育90 min，酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.2.4 細胞集落形成檢測細胞增殖

將細胞以500個/孔密度接種于6孔板，每組細胞做3個復孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)兩周后，PBS洗滌兩次后用4%多聚甲醛固定30 min，1%結晶紫染色20 min。顯微鏡計數(shù)≥50個細胞集落數(shù)。

1.2.5 EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine細胞增殖檢測）

將細胞以5000個/孔密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。經(jīng)過EdU標記，細胞固定化，Apollo染色，最后用熒光顯微鏡觀察拍照。在熒光顯微鏡下細胞核呈藍色，增殖細胞呈紅色。

1.2.6 蛋白印跡

RIPA裂解液（上海碧云天公司）加1%蛋白酶抑制劑處理組織或細胞提取總蛋白，BCA法（北京索萊寶生物科技有限公司）測定蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜。鼠單克隆GAPDH抗體（1∶10 000稀釋；武漢三鷹生物技術有限公司），兔單克隆TRIM11抗體（1∶2000稀釋；武漢三鷹生物技術有限公司），兔單克隆H3K27ac抗體（1∶500稀釋；英國abcam公司，ab4729），兔多克隆H3抗體（1∶2000稀釋；杭州景杰生物 PTM-1001）。二抗室溫孵育1 h，山羊抗兔lgG（1∶10 000稀釋；武漢三鷹生物技術有限公司），山羊抗鼠lgG（1∶10 000稀釋；武漢三鷹生物技術有限公司）。使用ECL發(fā)光液（美國Millipore公司）曝光。

1.2.7 RNA提取及RT-PCR

TRIzol裂解液（美國invitrogen公司）裂解細胞或組織，氯仿抽提，異丙醇萃取RNA。Prime-ScriptTMRT Master mix（日本Takara公司，RR036A）將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。RT-PCR（美國Promega公司）對GAPDH及TRIM11定量檢測，以 2-ΔΔCt計算 TRIM11 相對表達量。

引物序列：GAPDH-F ：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′

GAPDH-R ：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCC AAA-3′

TRIM11-F ：5′-CGCCATCTGCCTCGACTA C-3′

TRIM11-R ：5′-CTGGCTCTCCACCATCTT CTGC-3′

1.2.8 加藥處理細胞

將細胞以3×104個每孔接種于6孔板，待細胞貼壁后加藥。DLD1細胞用乙?；敢种苿–646，25 μmol/L）處理，SW480細胞用去乙?；敢种苿┗旌弦海?%）處理，兩組細胞的空白對照均為質(zhì)量分數(shù)1%二甲基亞砜（DMSO）。加藥處理24小時后收蛋白及RNA。

1.3 統(tǒng)計學分析

運用Graphpad Prism7分析。兩配對樣本且數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用t檢驗進行分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 H3K27ac和TRIM11在結直腸癌組織中高表達

RT-PCR結果顯示，相對于癌旁正常組織，TRIM11 mRNA在結直腸癌組織中表達量明顯升高（56/93）（圖1（a））。Western印跡結果同樣顯示，在12對組織中，TRIM11蛋白在結直腸癌組織中表達量明顯高于癌旁正常組織（11/12）（圖1（b））。Western印跡結果表明，H3K27ac在結直腸癌組織中高表達（圖1（c））。對以上12對組織中TRIM11與H3K27ac表達水平進行相關性分析。結果顯示，TRIM11在結直腸癌組織中的表達與H3K27ac表達正相關（圖1（d），P＜0.000 1）。

圖1 TRIM11與H3K27ac在結直腸癌組織中的表達(a)TRIM11 mRNA在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的相對表達量；(b)TRIM11在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的蛋白表達水平。N:正常結直腸組織；T:結腸癌組織；(c)H3K27ac在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的蛋白表達水平；(d)TRIM11與H3K27ac表達之間的相關性分析Fig.1 Expression of TRIM11 and H3K27ac in colorectal cancer(a)The relative expression of TRIM11 mRNA in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues;(b)The expression level of TRIM11 protein in colorectal cancer tissue and its corresponding normal tissue.N:normal colorectal tissue;T:colorectal cancer tissue;(c)The expression level of H3K27ac in colorectal cancer tissue and its corresponding normal tissue;(d)The relationship analyze between TRIM11 and H3K27ac expression

2.2 TRIM11啟動子區(qū)域H3K27ac富集調(diào)控TRIM11高表達

為了進一步分析H3K27ac和TRIM11的關系，通過UCSC基因組瀏覽器（http：//genome.ucsc.edu/）分析發(fā)現(xiàn)，包括結腸癌細胞在內(nèi)的多種腫瘤細胞TRIM11啟動子區(qū)域H3K27ac富集（2（a））。進一步通過乙酰化酶抑制劑C646處理細胞，發(fā)現(xiàn)C646抑制H3K27ac表達，TRIM11mRNA和蛋白水平也相應明顯低于對照組（圖2（b），2（c）），而去乙?；敢种苿┗旌弦禾幚砑毎?，H3K27ac表達增高，同樣TRIM11mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組（圖2（d），2（e）），提示結腸癌細胞中TRIM11的高表達可能受到H3K27ac調(diào)控。

圖2 H3K27ac調(diào)控TRIM11的表達(a)UCSC數(shù)據(jù)庫分析TRIM11啟動子區(qū)域H3K27ac富集情況；(b)Western印跡檢測C646處理DLD1細胞后H3K27ac及TRIM11的表達情況；(c)qPCR檢測C646處理DLD1后TRIM11 mRNA的表達情況。***代表P＜0.001;(d)Western印跡檢測去乙酰化酶抑制劑混合液處理SW480細胞后H3K27ac及TRIM11的表達情況；(e)qRT-PCR檢測去乙酰化酶抑制劑混合液處理SW480細胞后TRIM11 mRNA的表達情況。***代表P＜0.001Fig.2 H3K27ac regulates the expression of TRIM11(a)UCSC Genome Bioinformatics Site(http://genome.ucsc.edu/)showed high enrichment of H3K27Ac at the promoter of TRIM11;(b)The expression of H3K27ac and TRIM11 in DLD1 cells treated with C646;(c)The expression of TRIM11 mRNA in DLD1 cells treated with C646.***P＜0.001;(d)The expression of H3K27ac and TRIM11 in SW480 cells treated with deacetylase inhibitor mixture;(e)TRIM11 mRNA expression in SW480 cells treated with deacetylase inhibitor mixture***P＜0.001

2.3 TRIM11促進結腸癌細胞增殖

Western印跡和RT-PCR檢測TRIM11過表達效率，結果顯示過表達成功（圖3（a）、3（b））。CCK8實驗結果顯示，過表達TRIM11細胞活性增大（圖3（c））。細胞集落形成結果表明，SW480細胞轉(zhuǎn)染TRIM11-Pex3后集落形成數(shù)（335±8.49）個明顯高于Vector alone（對照組）組（137±9.03）個（P＜0.000 1）。SW620細胞轉(zhuǎn)染TRIM11-Pex3后集落形成數(shù)（179±6.96）個明顯高于Vector alone組（113±4.1）個，P＜0.000 3（圖 3（d））。Edu結果顯示，過表達TRIM11時增殖細胞明顯增多（圖3（e））。

圖3 TRIM11過表達促進結直腸癌細胞增殖(a)Western印跡檢測SW480、SW620細胞轉(zhuǎn)染后TRIM11的表達情況；(b)qRT-PCR檢測SW480、SW620細胞轉(zhuǎn)染后TRIM11 mRNA的表達情況。**代表P＜0.01;(c)CCK8檢測SW480（左圖）、SW620（右圖）細胞過表達TRIM11后細胞的增殖能力；(d)細胞集落形成實驗檢測SW480（上圖）、SW620（下圖）細胞過表達TRIM11后細胞的集落形成能力。(e)Edu檢測SW480（上圖）、SW620（下圖）細胞過表達TRIM11后細胞的增殖能力Fig.3 TRIM11 overexpression promotes the proliferation of colorectal cancer cells(a)TRIM11 protein expression in SW480 and SW620 cells after transfection of TRIM11-pEX3;(b)TRIM11 mRNA expression in SW480 and SW620 cells after transfection of TRIM11-pEX3.**P＜0.01;(c)The proliferation ability of SW480(left)and SW620(right)cells overexpressing TRIM11;(d)The colony formation of SW480(upper)and SW620(down)cells after overexpression of TRIM11;(e)The proliferation ability of SW480(upper)and SW620(down)cells overexpressing TRIM11

TRIM11-sgR作為對照，Western印跡及RT-PCR結果顯示，TRIM11-sgR可有效敲低TRIM11（圖 4（a）、4（b））。CCK-8結果表明敲低TRIM11能抑制細胞活性（圖4（c））。細胞集落形成實驗結果顯示，DLD1細胞轉(zhuǎn)染TRIM11-sgR后集落形成數(shù)（164±8.05）個明顯低于Vector alone組（316±8.05）個（P＜0.000 1）。WiDr細胞轉(zhuǎn)染TRIM11-sgR后集落形成數(shù)（125.3±6.01）個 明 顯 低 于 Vector alone組（310±14.42）個（P＜0.000 1）（圖 4（d））。EdU實驗結果表明敲低TRIM11增殖細胞的數(shù)量明顯減少（圖4（e））。提示TRIM11高表達促進結腸癌細胞增殖。

圖4 敲低TRIM11抑制結直腸癌細胞增殖(a)Western印跡檢測DLD1、WiDr轉(zhuǎn)染sgRNA后TRIM11的表達情況；(b)qPCR檢測DLD1、WiDr轉(zhuǎn)染sgRNA后TRIM11 mRNA的表達情況。**代表P＜0.01，***代表P＜0.001；(c)CCK8檢測DLD1（左圖）、WiDr（右圖）細胞敲低TRIM11后細胞的增殖能力；(d)細胞集落形成實驗檢測DLD1（上圖）、WiDr（下圖）細胞敲低TRIM11后細胞的集落形成能力；(e)Edu檢測DLD1（上圖）、WiDr（下圖）細胞敲低TRIM11后細胞的增殖能力Fig.4 Knockdown of TRIM11 inhibits the proliferation of colorectal cancer cells(a)The expression of TRIM11 in DLD1 and WiDr cells transfected with TRIM11-sgR/NC;(b)The expression of TRIM11 mRNA in DLD1 and WiDr cells transfected with transfected with TRIM11-sgR/NC.**P＜0.01,***P＜0.001;(c)The proliferation ability of DLD1(left)and WiDr(right)cells transfected with TRIM11-sgR/NC;(d)The colony formation of DLD1(upper)and WiDr(down)cells transfected with TRIM11-sgR/NC;(e)The proliferation ability of DLD1(upper)and WiDr(down)cells transfected with TRIM11-sgR/NC

3 討論

受我國城市化進程和人口老齡化的影響以及人們的飲食結構、生活方式的變化，我國結直腸癌發(fā)病率逐年升高，且近年來發(fā)病年輕化趨勢明顯，疾病防控形勢較為嚴峻。因此，找尋與結直腸癌發(fā)生發(fā)展相關的分子標記，為結直腸癌的治療提供分子靶點尤為重要。

H3K27ac是乙?；揎?，在調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展及耐藥的基因啟動子區(qū)域富集。有研究表明，H3K27ac在Creb1基因啟動子區(qū)域富集可促進乳腺癌的發(fā)展［16］。c-Myc基因啟動子區(qū)域H3K27ac的富集與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關［17］。H3K27ac在肝癌細胞系中高表達與肝癌的發(fā)生相關［18］，同時H3K27ac的表達水平在結腸癌組織中上調(diào)［19］。我們在結直腸癌組織中檢測H3K27ac表達發(fā)現(xiàn)，相對于癌旁正常組織，H3K27ac在結直腸癌組織中表達明顯增高，與之前研究結果相同。

TRIM11屬于TRIM蛋白家族，是一種E3泛素連接酶，是許多類型癌癥的癌基因。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM11能促進前列腺癌細胞增殖［20］。在脊索瘤中TRIM11能促進PHLPP1的泛素化從而促進PHLPP1的降解，同時促進AKT的磷酸化誘導細胞增殖抗凋亡［21］。TRIM11在肝癌組織中的高表達與患者的預后不良相關，TRIM11參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，是肝癌治療的潛在靶標［22］。研究表明，TRIM11在肺癌［15］、肝癌［22］、前列腺癌［20］等惡性腫瘤中發(fā)揮癌基因作用，與患者的預后不良及低生存率相關，但TRIM11在結腸癌中的報道較少且作用機制尚不明確。

本研究表明TRIM11在結直腸癌組織中高表達。對TRIM11與H3K27ac表達相關性分析發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關。進一步通過在線生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)在TRIM11的啟動子區(qū)域H3K27ac富集。為了驗證H3K27ac與TRIM11表達之間的關系，分別運用乙酰化酶及去乙?；敢种苿┨幚砑毎?，結果進一步證實TRIM11的表達隨著H3K27ac水平的變化而變化。表明TRIM11高表達受H3K27ac富集調(diào)控。進一步通過敲減和過表達TRIM11，發(fā)現(xiàn)過表達TRIM11可促進結直腸癌細胞增殖。

綜上所述，本研究表明，TRIM11在結腸癌的發(fā)生中發(fā)揮了癌基因的作用。H3K27ac的富集激活了TRIM11的表達。但H3K27ac調(diào)控TRIM11高表達的精確機制尚需進一步研究探討。