尹 苗，周艷美，陳希文*，王 聰，吳 倩，趙 洪

(1.綿陽(yáng)師范學(xué)院動(dòng)物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，四川綿陽(yáng) 621000；2.四川生豬重大疫病監(jiān)測(cè)與防控工程研究中心，四川綿陽(yáng) 621000)

0 引言

大腸桿菌病是嚴(yán)重危害當(dāng)前畜禽業(yè)健康發(fā)展的細(xì)菌病之一，可以引起仔豬黃白痢和水腫病等，長(zhǎng)期以來其防治主要依靠抗生素.但由于大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，其耐藥質(zhì)粒也能夠在人和動(dòng)物之間傳播，給人類健康和公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重危害[1].同時(shí)，近年來超級(jí)大腸桿菌和多重耐藥菌株的出現(xiàn)，引起了世界的廣泛關(guān)注，多國(guó)紛紛制定政策禁止在養(yǎng)殖過程中長(zhǎng)期使用抗生素.根據(jù)2019年7月9日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告部署，從2020年7月起停止生產(chǎn)、進(jìn)口加工和使用部分藥物為飼料添加劑，以維護(hù)動(dòng)物源食品安全和公共衛(wèi)生安全[2].因此，尋找抗生素替代品保障畜牧業(yè)健康持續(xù)發(fā)展已迫在眉睫.中藥因其具有營(yíng)養(yǎng)、保健、促生長(zhǎng)以及無殘留和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，已逐漸被國(guó)內(nèi)外研究者重視，研究發(fā)現(xiàn)中藥及中藥提取物對(duì)很多致病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，有望成為抗生素的替代藥物或輔助藥物[3-5].同時(shí)，隨著社會(huì)對(duì)食品安全及無抗養(yǎng)殖的重視和關(guān)注，篩選對(duì)致病菌敏感、高效、低毒和低殘留的中藥來防控動(dòng)物疾病已經(jīng)成為當(dāng)前獸醫(yī)工作者研究的熱點(diǎn)和趨勢(shì)，也是發(fā)展綠色健康高效無抗養(yǎng)殖急需解決的一個(gè)重要課題.本研究選擇多糖含量較高的22種中藥，采用超聲波輔助法提取其多糖化合物，研究其對(duì)豬源大腸桿菌的體外抑菌活性，以期為獸醫(yī)臨床合理用藥、有效防控大腸桿菌病提供科學(xué)依據(jù).

1材料與方法

1.1 中藥材

22種常用中藥材地榆、黃芪、大黃、虎杖、丹參、黃連、柴胡、魚腥草、黨參、何首烏、茜草、川牛膝、甘草、石榴皮、黃芩、茯苓、苦參、枸杞、白術(shù)、升麻、大棗、山茱萸和蒲公英均購(gòu)自綿陽(yáng)天源堂大藥房.根據(jù)中藥復(fù)方的組方原則[6]，選擇單味抑菌活性較好的中藥輔以補(bǔ)益理氣等藥物，組成9個(gè)復(fù)方，如下：

復(fù)方1：大黃5+虎杖5/g；

復(fù)方2：黃芩2.5+地榆2.5+大黃2.5+虎杖2.5/g；

復(fù)方3：黃芩1.7+地榆1.7+大黃1.7+虎杖1.7+茯苓1.6+白術(shù)1.6/g；

復(fù)方4：黃芩2.5+金銀花2.5+蒲公英2.5+紫花地丁2.5/g；

復(fù)方5：黃芩1.5+地榆1.5+大黃1.4+虎杖1.4+金銀花1.4+蒲公英1.4+紫花地丁1.4/g；

復(fù)方6：黃芩1.7+地榆1.7+大黃1.7+虎杖1.7+茯苓1.6+川牛膝1.6/g；

復(fù)方7：黃芩1.7+地榆1.7+大黃1.7+虎杖1.7+大青葉1.6+桔梗1.6/g；

復(fù)方8：黃芩1.5+地榆1.5+大黃1.4+虎杖1.4+丹參1.4+黃連1.4+黃芪1.4/g；

復(fù)方9：黃芩5+地榆5/g.

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和肉湯培養(yǎng)基等(購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；微量生化發(fā)酵管(購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；正丁醇、無水乙醇和丙酮等常規(guī)藥品為化學(xué)純(購(gòu)自綿陽(yáng)市信捷商貿(mào)有限責(zé)任公司).

1.3 供試菌種

本試驗(yàn)所用大腸桿菌菌株分離自綿陽(yáng)市某規(guī)模化豬場(chǎng)腹瀉仔豬病料，由綿陽(yáng)師范學(xué)院動(dòng)物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心鑒定保存.

1.4 中藥多糖的提取

將中藥用超聲波提取3次，濃縮至25 mL，按1∶3的比例加入95%的乙醇，靜置過夜，第2天以3 000 r/min離心20 min，除去上清液得到多糖沉淀，加入蒸餾水至恒定體積10 mL；加入Sevage試劑(正丁醇：氯仿=4∶1，Sevage：濾液=1∶5)，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)兩次，以有效去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，至恒定體積為10 mL.具體方法參照參考文獻(xiàn)[7].所有藥液在立式壓力蒸汽滅菌器中121 ℃下滅菌15 min，然后在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.5 菌懸液的制備

將保存的豬源大腸桿菌在無菌條件下活化后，接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，每支斜面加入1.5 mL滅菌蒸餾水，洗凈菌液，將細(xì)菌濃度調(diào)至1.5×106CFU/mL備用.具體方法參考文獻(xiàn)[8].

1.6 體外抑菌活性的測(cè)定

采用牛津杯法，將滅菌后的液體培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，待其凝固后，用微量移液器吸取0.1 mL菌懸液，涂布器涂抹均勻，再等距離放入4個(gè)牛津杯，用微量加樣器吸入含生藥1 g/mL的中藥多糖溶液0.2 mL于對(duì)應(yīng)牛津杯中，置37 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑.

1.7 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用二倍稀釋法，每11根試管為一組，重復(fù)3次.首先加入2 mL無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯到11支試管中，在1號(hào)試管中加入2 mL含1 g/mL的中藥多糖溶液吹打混勻，再按照2倍稀釋法以此類推，直到第9號(hào)試管.此時(shí)，試管1～9的混合溶液中藥提取物的濃度分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9和0.9 mg/mL，試管10作為陽(yáng)性對(duì)照，試管11作為陰性對(duì)照，觀察是否有細(xì)菌感染.用微吸管將0.1 mL稀釋后的菌懸液吸入試管1～9中，37 ℃孵育18～24 h.觀察透明和不渾濁的試管，選擇濃度最低的試管溶液，即藥物對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度(MIC).

1.8 最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

將上述選出的透明無渾濁試管，吸取溶液0.1 mL加入培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫養(yǎng)24 h.以99.9%殺死試驗(yàn)菌菌體的藥物最高稀釋度，為最低殺菌濃度(MBC).

2 結(jié)果與分析

2.1 單味中藥多糖的抑菌活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，22種中藥多糖的初提物對(duì)豬源大腸桿菌的抑菌效果存在較大差異，其中黃芩和地榆的體外抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為22.3 mm和21.6 mm，MIC和MBC均為7.8 mg/mL，其次是大黃、虎杖、何首烏、黃芪、石榴皮、柴胡、升麻、甘草、山茱萸等中藥，其抑菌圈直徑均在15 mm以上，也具有較強(qiáng)的抑菌活性.而大棗、黨參和大葉茜草三種中藥對(duì)豬源大腸桿菌沒有明顯的抑菌效果，見表1.

表1 22味中藥對(duì)豬源致病性大腸桿菌抑菌結(jié)果Tab.1 Antibacterial effect of 22 traditional Chinese medicines on pathogenicEscherichia Colifrom pigs

2.2 復(fù)方中藥多糖的抑菌活性

9個(gè)復(fù)方多糖初提物體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方1、復(fù)方3、復(fù)方6和復(fù)方7對(duì)豬源性大腸桿菌為極敏感；復(fù)方2、復(fù)方5、復(fù)方8和復(fù)方9均出現(xiàn)抗菌能力降低的現(xiàn)象.其中復(fù)方3和復(fù)方7對(duì)豬源大腸桿菌菌的抑菌圈直徑分別為27.4 mm、26.5 mm，MIC和MBC均為3.9 mg/mL與單方中抑菌活性最強(qiáng)的黃芩和地榆比抑菌圈明顯增大，MIC和MBC均有降低.見表2.

3 結(jié)論與討論

大腸桿菌普遍存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，危害性大、流行范圍廣，且發(fā)病率和死亡率高，導(dǎo)致畜禽生長(zhǎng)緩慢，料肉比低下，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失.同時(shí)血清型多，免疫效果不明顯，一直依賴抗菌藥物防治，抗生素過量使用導(dǎo)致的藥殘、耐藥性等一系列的危害有目共睹.在中獸醫(yī)學(xué)中中藥作為重要組成部位，在臨床實(shí)踐中已運(yùn)用數(shù)10年.本試驗(yàn)選取的22味中藥具有活血化瘀、消癰散結(jié)、清熱解毒和祛濕等功效，且其中大多數(shù)中藥對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有很好的殺菌抑菌效果.其中黃芩、地榆屬于清熱燥濕解毒類中藥對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC均為7.8 mg/mL；大黃和虎杖次之，MIC為15.6 mg/mL；大棗、黨參和大葉茜草沒有表現(xiàn)出抑菌效果.劉小鳳[9]等研究顯示，黃芩對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；羅怡琳[10]等研究顯示，大黃等對(duì)臨床大腸桿菌沒有抑菌作用，這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致；張凱睿[11]等用地榆提取物對(duì)大腸桿菌抑菌活性試驗(yàn)顯示，地榆正丁醇提取物對(duì)大腸桿菌的MIC為3.125 mg/mL，說明地榆對(duì)大腸桿菌作用強(qiáng)，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.本研究發(fā)現(xiàn)在中藥實(shí)際應(yīng)用中，用量及用法比西藥要復(fù)雜且量大，臨床推廣受到很大限制，也會(huì)由于提取方法等不同，效果也不同，在眾多研究結(jié)果中存在一定差異.筆者認(rèn)為這有可能與中藥種類、提取方法、試驗(yàn)條件及大腸桿菌血清型不同等相關(guān)；還有可能與中藥對(duì)機(jī)體作用靶點(diǎn)較多，在抑菌的同時(shí)還有抗炎、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等功效有關(guān).具體的作用機(jī)制和用藥情況還需進(jìn)一步深入研究.中藥講究君君臣臣，七情配伍，本試驗(yàn)中，復(fù)方3和復(fù)方7聯(lián)合用藥時(shí)，對(duì)豬源性大腸桿菌呈現(xiàn)協(xié)同作用，且MIC為3.9 mg/mL，抑菌效果呈相加效果，可以理解為中藥中的相須配伍；復(fù)方2、復(fù)方5、復(fù)方8和復(fù)方9聯(lián)合用藥時(shí)，抑菌效果反倒降低呈無關(guān)作用，或可單獨(dú)用藥更好.在戴悅[12]等研究報(bào)道得出，復(fù)方中藥的不同配伍對(duì)大腸桿菌呈不同的敏感度，單方的抑菌效果不一定比復(fù)方差.所以，在臨床用藥需根據(jù)實(shí)際情況，辯證用藥.