劉靜鳳，李美琪，何青漣，陳思禹，陳佩瑤，梅青剛，姜立春

(綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽 621000)

0 引言

蕨麻(PotentillaanserinaL.)，學(xué)名鵝絨委陵菜，薔薇科，主要分布于我國西藏、青海、甘肅和四川等地.蕨麻富含人類必需的18種氨基酸以及多糖、維生素等[1-2].此外，蕨麻具有健脾胃、益氣補(bǔ)血和止咳止血的作用，故用于治療腹瀉、嘔血、肝炎和脾胃虛弱等疾病[3].如今，隨著“綠色食品”成為主流發(fā)展趨勢，蕨麻作為一種藥食兩用的植物，市場需求量大幅度增加,經(jīng)濟(jì)價值持續(xù)上漲，然而由于缺乏對蕨麻有效成分的研究和開發(fā)，導(dǎo)致蕨麻大部分仍以原材料的形式發(fā)揮作用.近年來隨著蕨麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們越來越重視蕨麻有效成分的研究，除發(fā)現(xiàn)多糖、三萜等有效成分外[4]，研究表明蕨麻還含有生物類黃酮[5]，黃酮具有抗腫瘤和抗炎鎮(zhèn)痛活性，還具有降血壓、膽固醇以及抗老化等作用[6].

本試驗(yàn)以黃酮提取率作為指標(biāo)，利用單因素法和響應(yīng)面法對甘肅地區(qū)蕨麻黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的提取條件，使黃酮提取率達(dá)到最佳，在減少損耗的基礎(chǔ)上提高蕨麻的經(jīng)濟(jì)價值，為蕨麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

蕨麻，甘肅甘南藏族自治州的野生蕨麻，購于綿陽市高新區(qū)永興鎮(zhèn)康貝大藥房.

1.2 試驗(yàn)方法

式中，C：測定樣品溶液的濃度(mg·mL-1)；V：樣品溶液定容后的體積(mL)；W：樣品重量(g)；F：測定時溶液的稀釋倍數(shù).

1.2.2 超聲時間對提取率的影響 稱取5份0.100 0 g蕨麻粉于5只25 mL的比色管中，分別加入3 mL 60%乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中，分別超聲10、20、30、40、50 min，溫度設(shè)置為50 ℃，提取功率級別為3級，超聲完成后，考察不同超聲時間對提取率的影響.

1.2.3 超聲功率級別對提取率的影響 稱取5份0.100 0 g樣品于5只10 mL比色管中，分別加入3 mL 60%的乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中20 min，提取溫度50 ℃，超聲功率級別為1、2、3、4、5級，考察不同超聲功率對提取率的影響.

1.2.4 超聲溫度對提取率的影響 稱取5份0.100 0 g樣品于5只10 mL比色管中，分別加入3 mL 60%的乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中20 min，提取溫度30、40、50、60、70 ℃，超聲功率級別為4級，考察不同溫度對提取率的影響.

1.2.5 料液比對提取率的影響 稱取5份0.100 0 g樣品于5只10 mL比色管中，在5只試管中分別加入1、2、3、4、5 mL 60%的乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中20 min，超聲溫度50 ℃，功率級別為4級，考察不同料液比對提取率的影響.

1.2.6 乙醇濃度對提取率的影響 稱取5份0.100 0 g樣品于5只10 mL比色管中，分別加入3 mL 30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，加塞后放入超聲波清洗機(jī)中20 min，提取溫度50 ℃，功率級別設(shè)置為4級，超聲完成后，考察不同乙醇濃度對提取率的影響.

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用三因素三水平BOX-Behnken design(BBD)實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)優(yōu)化蕨麻總黃酮提取率的自變量(乙醇濃度、超聲溫度和功率級數(shù))，自變量的水平以及BOX-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示.

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2016和Design-Expert10.0.4軟件數(shù)據(jù)處理并分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁在0.008～0.048 mg/mL的濃度范圍內(nèi)的線性方程為：y=20.025x+0.020 5(R2=0.999 4)，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其中橫坐標(biāo)為蘆丁含量，縱坐標(biāo)為蘆丁在510 nm處的吸光度.表明在此范圍內(nèi)，蘆丁濃度與其吸光度之間呈良好的線性關(guān)系.

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲時間對提取率的影響 根據(jù)1.2.2的方法，分析超聲時間對總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：在50 ℃下，提取劑為50%濃度乙醇，料液比為1:30，功率級別為4級.結(jié)果如圖2所示，總黃酮提取率隨著提取時間的增加呈現(xiàn)出先緩慢增加，達(dá)到最高值后呈下降趨勢，當(dāng)提取時間為30 min時，總黃酮提取率達(dá)到峰值，為2.81%.

2.2.2 超聲功率級別對提取率的影響 根據(jù)1.2.3的方法，分析功率級別對總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：料液比為1∶30，提取溫度50 ℃，乙醇濃度50%，提取20 min.結(jié)果如圖3所示，在1～5的功率級別范圍內(nèi)，總黃酮提取率先增加后降低，當(dāng)功率級別為2級(100～150 W)范圍內(nèi)時，總黃酮提取率最高，為3.70%.

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve圖2 提取時間對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids圖3 功率級別對總黃酮提取率的影響Fig.3 Influence of power level on extraction rate of total flavonoids

2.2.3 超聲溫度對提取率的影響 根據(jù)1.2.4的方法，分析提取溫度對總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：料液比為1∶30，功率級別為4級，提取時間20 min，乙醇濃度50%.結(jié)果如圖4所示，隨著提取溫度增加，總黃酮提取率先緩慢增加達(dá)到峰值后迅速降低，當(dāng)提取溫度在40 ℃時，總黃酮提取率最高，為4.18%.通過比較賈曉東等[8]的研究方法和結(jié)果，分析出現(xiàn)以上情況可能是由于溫度升高分子運(yùn)動加速，黃酮提取率增大，但溫度繼續(xù)升高部分黃酮成分受到高溫破壞，使得提取率降低.

2.2.4 料液比對提取率的影響 根據(jù)1.2.5的方法，分析料液比對總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：超聲時間為20 min，超聲的溫度為50 ℃，功率級別為4級，用50%的乙醇為提取劑.結(jié)果如圖5所示，總黃酮提取率隨著料液比的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，當(dāng)料液比為1∶30時，總黃酮提取率最高，為2.89%.李桂娟等[9]采用超聲輔助提取黃酮的操作結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果趨勢一致，分析原因可能是隨著料液比的增加，雜質(zhì)也會隨著增加，導(dǎo)致溶解在體系中的黃酮比例下降.

2.2.5 乙醇濃度對提取率的影響 根據(jù)1.2.6的方法，分析乙醇濃度對總黃酮提取率的影響，反應(yīng)條件為：料液比為1∶30，提取溫度50 ℃，功率級別4級，提取時間20 min.結(jié)果如圖6所示，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率先增加后降低最后趨于平穩(wěn)，當(dāng)乙醇濃度為50%時，總黃酮提取率最高，為3.04%.康坤等[10]對總黃酮提取工藝優(yōu)化時，研究乙醇濃度對提取率的影響方法與試驗(yàn)結(jié)果一致，分析原因可能是較高濃度的乙醇導(dǎo)致非黃酮類的一些脂溶性物質(zhì)溶出，造成體系中黃酮含量下降.

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Influence of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids圖5 料液比對提取率的影響Fig.5 Influence of solid-liquid ratio on extraction rate圖6 乙醇濃度對蕨麻總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids from Anserine hemp

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面對甘南蕨麻超聲提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，分別選取乙醇濃度、提取溫度和功率級別，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示.

利用軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到以黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸方程為：Y=4.15+0.15A+0.084B+0.14C-0.25AB-0.16AC+0.32BC-0.38A2-0.44B2-0.38C2(R2=0.980 7，P<0.000 1).

由表3可知，回歸方程的P<0.000 1，說明該回歸方程模擬效果極顯著，失擬項(xiàng)P=0.081 6>0.05，說明失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，回歸方程模型擬合度高，試驗(yàn)誤差對試驗(yàn)結(jié)果干擾性較低.R2=0.980 7，說明響應(yīng)面的理論值和實(shí)際值呈現(xiàn)較為顯著的相關(guān)性.此外，模型A、B、C對黃酮提取率的影響顯著(P<0.05).通過F值大小可以看出，蕨麻提取的3個因素對黃酮提取率的影響大小為：A乙醇濃度>C功率級別>B提取溫度，且AB、BC、AC交互作用P<0.05，說明乙醇濃度、提取溫度和功率級別對總黃酮的提取率的交互影響較顯著.

2.3.2 響應(yīng)面曲面圖及分析 利用Design-Expert軟件繪制乙醇濃度、功率級別以及提取溫度3個因素之間的交互作用對黃酮提取率的響應(yīng)面，結(jié)果如圖7所示.

根據(jù)響應(yīng)面坡度的陡峭程度以及等高線密集程度和形成橢圓形的程度表示兩因素之間交互作用影響大小的原則，由圖7可知，功率級別與提取溫度之間所形成的交互作用最強(qiáng)，而乙醇濃度和功率級別之間所形成的交互作用最弱，結(jié)合方差分析可知各因素交互作用大小為BC>AB>AC.

圖7 兩因素交互作用對黃酮提取率的影響Fig.7 Interaction of the two factors on the extraction rate of flavonoids

2.3.3 優(yōu)化及驗(yàn)證 通過軟件測定，模擬出最優(yōu)的的提取條件為乙醇濃度50.911%，提取溫度為31.550 ℃，功率級別為2.233時，蕨麻總黃酮的提取能達(dá)到4.180%，但考慮具體情況，將優(yōu)化條件改為：乙醇濃度50%，提取溫度32 ℃，功率級別為2.在此條件下，做5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表4，最后得到平均值為4.217±0.342，與理論值4.180符合，因此該模型有效可靠.

3 結(jié)論

本研究以甘南蕨麻為材料，通過超聲輔助提取黃酮，結(jié)合單因素法與響應(yīng)面法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，從而得到黃酮提取的最佳條件.研究表明：黃酮提取優(yōu)化條件為提取時間30 min，料液比為1∶30，超聲時的溫度32 ℃，功率級別2，提取劑為50%乙醇，在此條件下，總黃酮提取率達(dá)到4.217%；提取條件對黃酮提取率影響的大小順序?yàn)椋汗β始墧?shù)>乙醇濃度>提取溫度；以黃酮提取率為目標(biāo)函數(shù)的模型為：Y=4.15+0.15A+0.084B+0.14C-0.25AB-0.16AC+0.32BC-0.38A2-0.44B2-0.38C2(R2=0.980 7，P<0.000 1).

蕨麻作為一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，其應(yīng)用廣泛、前景廣闊，近年來研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻中富含的蕨麻素具有抑制乙肝病毒復(fù)制、保肝降酶等作用[11].但目前針對蕨麻的研究大部分仍停留于初步研究或宏觀水平的分析上[12]，其有效成分、活性成分以及藥用機(jī)理等亟待進(jìn)一步研究.要完善蕨麻在理論方面的研究缺陷，為蕨麻發(fā)展提供可靠準(zhǔn)確的理論支撐，就要從不同角度對蕨麻進(jìn)行全面系統(tǒng)的科學(xué)研究，這樣才能更好的發(fā)揚(yáng)我國的中醫(yī)藥文化，才能更加科學(xué)合理的利用蕨麻，有效的推動蕨麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.