呂 薇，李勝男，馮國軍，楊曉旭，劉 暢，閆志山，劉大軍

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150081）

0 引言

黃瓜(Cucumis sativus)隸屬于葫蘆科黃瓜屬，果實營養(yǎng)價值豐富，是全國以及世界范圍內(nèi)廣泛種植的一種蔬菜作物，也是深受人們喜愛的蔬菜之一[1]。黃瓜在生產(chǎn)過程中易受到各種常見病蟲害的侵染，如霜霉病、灰霉病、炭疽病等，使其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。長期使用生物化學(xué)藥劑進(jìn)行病害防治，易導(dǎo)致黃瓜等蔬菜農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，大量的農(nóng)藥殘留會造成食品安全、環(huán)境污染等嚴(yán)重的社會問題。在黃瓜等蔬菜種植中，為有效控制病蟲害的侵染，生產(chǎn)中經(jīng)常使用多種殺蟲劑進(jìn)行病蟲害的防治。其中，霜霉威（propamocarb，分子式為C9H20N2O2）是一種常用的殺菌劑，其作用方式主要有莖葉面噴施、土壤噴灑和種子的浸泡等方式[2]，主要功效是防治卵菌引起的葉部病害或土傳病害，例如黃瓜、番茄、萵苣等蔬菜作物以及煙草、花卉、葡萄等作物的霜霉病、疫病、猝倒病等病害，總有效率達(dá)90%以上[3]，因高效、低毒的特性在國內(nèi)應(yīng)用廣泛[4]。施用霜霉威后，霜霉威一部分會在黃瓜體內(nèi)蓄積，其余沉降到土壤或擴(kuò)散到大氣中，一方面會造成黃瓜農(nóng)藥殘留，影響品質(zhì)，引發(fā)食品安全問題；另一方面造成環(huán)境污染，危害人類健康[5]。因此，研究黃瓜體內(nèi)農(nóng)藥殘留代謝對促進(jìn)黃瓜安全生產(chǎn)具有現(xiàn)實意義[6]?，F(xiàn)有研究表明，一部分殘留在果蔬表面的農(nóng)藥可以通過水洗、浸泡、剝皮等方法不同程度去除，但另一部分農(nóng)藥會通過植物的葉根直接或間接吸收進(jìn)入植物組織內(nèi)部，最后殘留在蔬菜體內(nèi)[7]。關(guān)于農(nóng)藥的解毒和代謝機(jī)制已有了深入的研究。植物體在長期的外部環(huán)境刺激下已經(jīng)逐漸進(jìn)化出了一套應(yīng)對有毒分子的代謝機(jī)制。植物體通過各種過氧化物酶、水解酶和轉(zhuǎn)移酶的相互協(xié)調(diào)作用，將有毒的大分子基團(tuán)代謝和水解形成低毒的小分子，小分子毒性物質(zhì)通過降解運輸?shù)郊?xì)胞外，最終減輕外源有毒物質(zhì)對植物體的傷害，降低農(nóng)藥殘留量[8]。

前人研究表明，外源施用一氧化氮[9]、胡敏素[10]、脯氨酸[11]等物質(zhì)可以促進(jìn)農(nóng)藥的代謝和解毒，降低植株中農(nóng)藥的殘留量。褪黑素(melatonin，Mel)在植物抵抗逆境脅迫中具有重要的作用。外源噴施褪黑素可以減輕農(nóng)藥對番茄、萵苣、白菜、菠菜、芹菜、黃瓜和甜瓜產(chǎn)生的毒害，同時可以降低農(nóng)藥在這些作物中的殘留量[12]。Mel的解毒作用主要是由于Mel激活了植株的抗氧化系統(tǒng)，提高植株的抗氧化能力，并參與關(guān)鍵的解毒過程[13]。以番茄為研究對象，外源施用Mel或過量表達(dá)Mel相關(guān)基因COMT1（可以直接清除農(nóng)藥產(chǎn)生的ROS，活性氧(ROS)和脂質(zhì)過氧化物(LPO)水平顯著降低。更重要的是Mel激活了抗壞血酸-谷胱甘肽(ASAGSH)循環(huán)，參與谷胱甘肽途徑介導(dǎo)的百菌清解毒[14]。然而，目前關(guān)于褪黑素降低農(nóng)藥殘留方面的研究鮮有報道。筆者以農(nóng)藥霜霉威為處理試劑，以黃瓜為供試材料，通過測定褪黑素處理對黃瓜體內(nèi)殘留霜霉威含量的影響，以及葉片的O2-·產(chǎn)生速率、H2O2含量、MDA含量、抗氧化酶和解毒酶活性的變化，研究外源褪黑素對霜霉威噴施黃瓜的抗氧化體系與解毒系統(tǒng)的調(diào)控作用，探究其對黃瓜體內(nèi)霜霉威的作用，以期探索一條能有效降解蔬菜作物農(nóng)藥殘留的新途徑。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

供試材料為黃瓜品種‘Y3F604’，由黑龍江大學(xué)園藝學(xué)團(tuán)隊提供；以北京索萊寶科技有限公司的褪黑素（Mel，CAS為73-31-4）為灌根藥劑；以氨基甲酯類農(nóng)藥霜霉威（CAS為24579-73-5，購于拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司）為處理試劑。采用穴盤播種育苗，設(shè)置4個處理。處理1為根部澆灌蒸餾水(CK)、處理2為1 mmol/L褪黑素+根部澆灌蒸餾水，處理3為葉面噴施400 mg/kg霜霉威+根部澆灌蒸餾水，處理4為葉面噴施400 mg/kg霜霉威+黃瓜營養(yǎng)液中加入1 mmol/L褪黑素+根部澆灌蒸餾水。Mel持續(xù)處理2天，處理結(jié)束的7天后葉面噴施400 mg/kg的霜霉威，霜霉威處理結(jié)束后第24、48 h取第6片真葉測定霜霉威的殘留量，并在48 h后取樣，-80℃保存。每個處理20株黃瓜幼苗，設(shè)3個重復(fù)。

1.2 霜霉威殘留量測定

采用高效氣相色譜法測定黃瓜葉面噴施400 mg/kg霜霉威后葉片中的霜霉威含量，詳細(xì)方法如下：（1）取10 g黃瓜葉片組織磨碎加入50 mL比色管中，加入20 L乙腈和2 g NaCl均質(zhì)儀勻漿5 min，充分萃取；（2）上述溶液靜置30 min后，取10 mL清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)近干；（3）用丙酮多次沖洗旋蒸瓶，洗液合并后定容至2 mL；（4）定容后的溶液用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，可能需要多次，直至濾液中沒有顆粒；（5）濾液用丙酮稀釋100倍，通過安捷倫7890B-5977A氣相色譜儀上機(jī)檢測，色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 抗氧化系統(tǒng)和解毒酶活性測定

黃瓜葉面噴施400 mg/kg霜霉威48 h后稱取0.3 g樣品，加入2 mL預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)，冰浴研磨，勻漿，4℃、12000 r/min下離心20 min，上清液為酶提取液。超氧化物岐化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定[15]，丙二醛(MDA)含量參照王學(xué)奎等[15]的方法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[16]，過氧化氫酶(CAT)活性參照李合生的方法測定[16]，抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性采用紫外吸收法測定[17]，谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性參照趙世杰等[17]的方法測定，過氧化氫(H2O2)含量參考Rai等[18]試驗方法，超氧陰離子(O2-·)含量參考Shah等[19]試驗方法，還原型谷胱甘肽(GSH)參考Ma等[20]試驗方法，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)參考Rahman等[21]試驗方法測定，谷胱甘肽還原酶(GR)活性的測定參考Knorzer等[22]試驗方法，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的測定參考Komives等[23]的實驗方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行處理并繪圖，SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素處理對黃瓜體內(nèi)霜霉威殘留量的影響

由圖1可知，Mel+霜霉威處理的黃瓜葉片中的農(nóng)藥霜霉威的殘留量均顯著低于噴施霜霉威處理，且較噴施霜霉威處理的霜霉威殘留量分別降低了11.8%、29.6%。在霜霉威的脅迫下，48 h比24 h的Mel+霜霉威處理減少黃瓜葉片中霜霉威的殘留量差異更顯著。說明外源褪黑素處理下48 h比24 h能夠更加有效地減少黃瓜體內(nèi)霜霉威的累積。

圖1 外源褪黑素處理對黃瓜體內(nèi)霜霉威殘留量的影響

2.2 外源褪黑素處理對農(nóng)藥脅迫下黃瓜體內(nèi)O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

與CK相比，Mel處理中的黃瓜葉片中的O2-·和H2O2含量沒有顯著差異（圖2），僅施用Mel對黃瓜葉片中的O2-·和H2O2的含量不產(chǎn)生明顯影響。而葉面噴施霜霉威后，黃瓜葉片的O2-·和H2O2含量顯著積累。與噴施霜霉威相比，Mel+霜霉威處理均顯著降低了黃瓜體內(nèi)O2-·、H2O2含量，分別降低了24.2%、19.7%，但是未恢復(fù)到對照水平。說明外源Mel處理能在一定程度上緩解由霜霉威脅迫造成黃瓜體內(nèi)O2-·和H2O2含量的累積。

2.3 外源褪黑素處理對農(nóng)藥脅迫下黃瓜體內(nèi)MDA含量的影響

與CK相比，Mel處理中黃瓜葉片的MDA含量差異不顯著（圖3），僅施用Mel對黃瓜體內(nèi)的MDA含量不產(chǎn)生顯著影響。而葉面噴施霜霉威后，黃瓜葉片中的MDA含量顯著升高。與噴施霜霉威的處理相比，Mel+霜霉威處理下黃瓜葉片中的MDA含量顯著降低，降低了23.4%，但未恢復(fù)到對照水平。說明外源Mel處理能在一定程度上緩解由霜霉威脅迫造成的MDA含量積累。

2.4 外源褪黑素處理對農(nóng)藥脅迫下黃瓜體內(nèi)GSH/GSSG比值的影響

如表1所示，與CK相比，外源Mel處理的植物在GSSG和總谷胱甘肽含量上沒有顯著差異，但外源Mel處理后GSH含量降低了6.5%。而葉面噴施霜霉威后，黃瓜葉片中顯著增加了GSH的含量，增加了60.9%，而GSSG含量顯著降低，降低了34.2%，GSH/GSSG增加。與霜霉威相比，Mel+霜霉威處理后GSH含量顯著增加，增加了10.8%，總谷胱甘肽含量增加了7%，GSH/GSSG也顯著增加。說明外源褪黑素處理顯著誘導(dǎo)霜霉威脅迫下GSH和總谷胱甘肽含量的積累，并且GSH/GSSG增加。

表1 外源褪黑素對農(nóng)藥脅迫下黃瓜體內(nèi)GSH-GSSG含量的影響

2.5 外源褪黑素處理對農(nóng)藥脅迫下黃瓜體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

與CK相比，Mel處理的黃瓜體內(nèi)抗氧化酶活性均無明顯差異（圖4）。而葉面噴施霜霉威后，顯著提高黃瓜葉片中的抗氧化酶活性。與噴施霜霉威相比，Mel+霜霉威處理黃瓜葉片中的SOD、POD、CAT、APX和GPX等抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)，分別增加了24.2%、25.6%、25.3%、16.1%、25.0%。說明外源Mel處理能激活霜霉威脅迫下黃瓜體內(nèi)抗氧化酶活性。

圖4 外源褪黑素處理對農(nóng)藥脅迫下黃瓜體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

2.6 外源褪黑素處理對農(nóng)藥脅迫下黃瓜體內(nèi)解毒酶活性的影響

與CK相比，外源施用Mel降低了GST和GR酶活性，但差異不顯著（圖5）。而葉面噴施霜霉威后，黃瓜中的GST、GR酶活性均顯著增強(qiáng)。與噴施霜霉威相比，Mel+霜霉威處理黃瓜葉片中的GST和GR酶活性顯著增強(qiáng)，分別提高了22.4%、25.4%。說明外源Mel處理在霜霉威脅迫下能增強(qiáng)GST和GR酶的活性。

圖5 外源褪黑素處理對農(nóng)藥脅迫下黃瓜體內(nèi)解毒酶活性的影響

3 結(jié)論

外源褪黑素處理可以提高霜霉威脅迫下黃瓜葉片中的SOD、CAT、POD、APX、GPX等抗氧化酶活性，減少MDA積累，并提高GSH/GSSG，通過清除植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生O2-·和H2O2等活性氧，促進(jìn)解毒酶GR和GST酶活性，促進(jìn)GSH含量的增加，進(jìn)而加快霜霉威在黃瓜體內(nèi)降解代謝。本研究以對蔬菜進(jìn)行內(nèi)源調(diào)控為基礎(chǔ)，探索了一條減少蔬菜農(nóng)藥殘留的新途徑，為褪黑素在果蔬綠色生產(chǎn)與農(nóng)藥調(diào)控降解技術(shù)中的應(yīng)用提供了理論參考。

4 討論

在環(huán)境脅迫下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡狀態(tài)會被打破，使植物細(xì)胞增加了活性氧的產(chǎn)生[24]?；钚匝酰∣2-·和H2O2）作為細(xì)胞的第三信使調(diào)節(jié)許多不同的基因和蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生對各種脅迫環(huán)境的反應(yīng)[25]。在農(nóng)藥脅迫下，植物細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生積累的ROS是有氧代謝帶來的有毒副產(chǎn)物，并且會導(dǎo)致質(zhì)膜損傷[26]。本研究中，霜霉威脅迫后，黃瓜體內(nèi)的O2-·和H2O2含量均顯著高于對照組，且MDA含量也顯著增加，說明黃瓜植株已受到ROS脅迫。植物遭受ROS脅迫時，抗氧化防御系統(tǒng)包括抗壞血酸-谷胱甘肽系統(tǒng)和SOD、POD等抗氧化酶系統(tǒng)會迅速啟動[27]。而外源Mel處理可以減少植物在遭受農(nóng)藥脅迫下ROS的累積，增強(qiáng)黃瓜體內(nèi)氧化還原信號分子介導(dǎo)的抵抗防御反應(yīng)，從而促進(jìn)農(nóng)藥的氧化降解[28]。本研究表明，外源Mel處理減少了在霜霉威脅迫下O2-·和H2O2累積，顯著降低了霜霉威誘導(dǎo)的MDA積累，這與劉娜等[29]的結(jié)果相似。這可能是Mel處理引起細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、POD、APX和GPX酶活性增加，加速ROS的清除，在此過程中，SOD清除O2-·并轉(zhuǎn)化為H2O2，而通過CAT、POD、APX和GPX酶進(jìn)一步清除H2O2[30]，從而減少植株體內(nèi)的ROS積累，減輕霜霉威對植物的毒害。MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，MDA積累可能會對膜和細(xì)胞造成一定的傷害，其含量可以反映植物遭受逆境的傷害程度[31]。本研究中外源Mel處理顯著降低由霜霉威誘導(dǎo)的MDA積累，減緩細(xì)胞的膜脂過氧化作用，從而降低植物受到的霜霉威毒害。魏志為等[32]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可有效增強(qiáng)蘋果植株的抗氧化能力，從而有效減輕蘋果在逆境脅迫下所受到的應(yīng)激損傷。付晴晴等[33]在葡萄上和張俊康等[34]在獼猴桃上通過研究得出類似的結(jié)論。本研究結(jié)果表明，在霜霉威的脅迫下，外源Mel處理可提高在霜霉威脅迫下植株體內(nèi)SOD、CAT、POD、APX和GPX等抗氧化酶活性，并減少MDA的積累。

此外，谷胱甘肽還原酶GR和谷胱甘肽也在植物細(xì)胞抗氧化過程中發(fā)揮作用。GR不僅是植物細(xì)胞內(nèi)H2O2清除酶系統(tǒng)的主要組成之一，也是植物谷胱甘肽解毒系統(tǒng)的主要組成[35]，與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在植物內(nèi)殘余農(nóng)藥的降解過程中發(fā)揮重要的解毒作用[36]。有科學(xué)研究證明，Mel處理能夠增強(qiáng)GR的活性，促進(jìn)氧化態(tài)型胱甘肽GSSG的還原，進(jìn)而促進(jìn)GSH的再生，同時GSH/GSSG比值增加有利于ROS的清除[37-38]。本研究表明，外源Mel處理可顯著提高農(nóng)藥脅迫下黃瓜GR，提高GSH/GSSG和GST酶活性，進(jìn)而顯著提高植株抗氧化能力和解毒能力，并促進(jìn)黃瓜對霜霉威的降解。阮海華等[39]研究表明，鹽脅迫可使小麥GSH/GSSG比值增加；韓一林等[40]研究表明，高溫干旱和協(xié)同脅迫顯著增加毛竹GSH/GSSG的比值；孫舒暢等[41]研究表明，外源Mel預(yù)處理對鎘脅迫下的番茄植株GSH/GSSG顯著增加。GSH與GSSG的比值反映細(xì)胞是否受到氧化應(yīng)激。Mel調(diào)控植物在逆境下的抗氧化能力和氧化還原平衡至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在霜霉威脅迫下，外源Mel處理增加了黃瓜體內(nèi)GSH和總谷胱甘肽含量的累積，減少GSSG含量，從而提高GSH/GSSG，激活黃瓜植株抗氧化酶活性，提高抗氧化能力。還原型谷胱甘肽GSH為植物體內(nèi)抗氧化還原非酶系統(tǒng)的關(guān)鍵成員，在植物遭受逆境脅迫時，所產(chǎn)生的活性氧既可由酶促作用或非酶促作用去除，也能利用ASA-GSH循環(huán)來調(diào)節(jié)GSH/GSSG氧化還原，清除ROS[42]。在植物中，谷胱甘肽可以減少植物受到脅迫造成的ROS積累，并降低其對植物機(jī)體的損傷效果[43]。此外，谷胱甘肽與異源有毒性化學(xué)物質(zhì)緊密結(jié)合，在GST酶的催化相互作用下，加速有害物質(zhì)降解[44]。本研究結(jié)果表明，外源Mel處理可增強(qiáng)GST、GR解毒酶的酶活性，增加GSH和總谷胱甘肽的累積，使GSH/GSSG升高，增強(qiáng)植株的解毒能力，并加速黃瓜體內(nèi)霜霉威的降解?；赗OS和谷胱甘肽在植物解毒途徑中功能的保守性，本實驗未能探究褪黑素應(yīng)用于其他蔬菜殘留農(nóng)藥降解代謝的調(diào)控效果，具體的調(diào)控效果尚有待于進(jìn)一步研究。