張 云，薩如拉，包桂榮，薩茹拉其其格，邰繼承，李 響

（1內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2鄂爾多斯市林業(yè)和草原綜合執(zhí)法支隊(duì)，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017000）

0 引言

中國(guó)北方低溫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，玉米秸稈還田后秸稈腐解速率較慢，腐解效果較差，影響北方地區(qū)大量玉米秸稈還田的可施行性。提高秸稈還田效率，選育優(yōu)良微生物菌劑是微生物處理的關(guān)鍵。降解秸稈微生物多為常溫(20～28℃)[1-5]和高溫(30～55℃)[6-12]菌，近幾年選育的低溫秸稈降解菌多樣化，降解效果有差異。趙偉等[13]認(rèn)為東北黑土區(qū)低溫菌劑施入玉米秸稈還田較常溫菌劑顯著提高土壤微生物數(shù)量、土壤酶活性及微生物碳、氮含量。張恒芳[14]發(fā)現(xiàn)，黃桿菌屬(Flavobacterium)和溶桿菌屬(Lysobacter)混合菌劑處理在12℃對(duì)秸稈各組分降解效果最好。劉爽[15]在15℃條件下篩選草酸青霉Penicillium oxalicumQSH3-3、尖孢鐮刀霉Fusarium oxysporumDSH2-3、毛殼霉Chaetomiumsp.YSH3-3以及DSH2-3與YSH3-3的組合菌，在10～25℃范圍內(nèi)，秸稈還田模擬試驗(yàn)中菌株DSH2-3對(duì)小麥秸稈的降解效果較好，組合菌對(duì)水稻和玉米秸稈的降解效果較好。杜俊杰[16]選育降解玉米秸稈低溫兼性厭氧纖維素降解菌系，在低溫條件下絕大部分有機(jī)物可被耐低溫微生物降解。低溫玉米秸稈降解優(yōu)良菌株報(bào)道較少，筆者篩選低溫條件下降解玉米秸稈的菌系并研究其培養(yǎng)條件，以期為加速內(nèi)蒙古地區(qū)秸稈腐熟還田提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年9月在內(nèi)蒙古民族大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

玉米‘農(nóng)華101’收獲期秸稈；腐爛物（腐爛樹(shù)葉、鋸末、腐爛紙盒、朽木、爛草、玉米秸稈、水稻稈、竹葉、羊糞和牛糞），草甸土，沼澤地污泥，螞蟻洞邊土，多年堆放秸稈堆土；腐爛樹(shù)葉、腐爛紙盒、朽木、螞蟻洞邊土采自包頭市土默特右旗薩拉齊鎮(zhèn)，鋸末、沼澤地污泥、爛草和牛糞采自西藏拉薩市，羊糞和草甸土采自西藏那曲班戈縣，玉米秸稈、水稻稈和竹葉采自四川遂寧市，多年堆放秸稈堆土采自通遼市扎魯特旗；中農(nóng)綠康秸稈腐熟劑從中農(nóng)綠康生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)。奧梅梁斯基培養(yǎng)基[15]、玉米秸稈培養(yǎng)基[15]、液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基[15]均于121℃、0.1 MPa條件下滅菌30 min備用。

1.3 試驗(yàn)方法

采集年平均氣溫-0.6～8℃的高寒地區(qū)富含纖維素分解菌的腐爛物分別與450 g草甸土、樹(shù)林土、螞蟻洞邊土、多年堆放秸稈堆土混勻，采用濾紙崩解法、天然玉米秸稈粉培養(yǎng)法富集培養(yǎng)纖維素分解菌，并選濾紙變黃、變斷裂潰爛、玉米秸稈粉蓬松變?yōu)槊扌鯛畹呐囵B(yǎng)物繼代培養(yǎng)，篩選秸稈降解菌系；以篩選到的秸稈降解菌系和生產(chǎn)中主推的秸稈腐熟劑為試材，進(jìn)行玉米秸稈發(fā)酵試驗(yàn)，溫度設(shè)15、20℃ 2個(gè)梯度，pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 6個(gè)梯度，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為繼代培養(yǎng)基，秸稈降解菌系8號(hào)15℃條件下連續(xù)繼代培養(yǎng)15代后，以秸稈腐熟劑為對(duì)照，在不同溫度、pH條件下接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取發(fā)酵液，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)；采用3,5-二硝基水楊酸法[8]測(cè)定發(fā)酵15天的發(fā)酵液濾紙酶和纖維素酶活性。將秸稈降解菌系和秸稈腐熟劑分別接種到玉米秸稈為唯一碳源的玉米秸稈培養(yǎng)基中15、20℃培養(yǎng)15天后測(cè)定玉米秸稈降解率[式(1)]，5次重復(fù)。

式中，W0表示接種前培養(yǎng)基中的秸稈干重，W1表示發(fā)酵結(jié)束后秸稈干重。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過(guò)DPS 15.10和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈降解菌系8號(hào)的篩選

由圖1可知，富集培養(yǎng)物纖維素分解能力較強(qiáng)，濾紙出現(xiàn)了很明顯的潰爛，氣液界面濾紙出現(xiàn)孔洞、變薄，7天后濾紙就斷裂，20～30天把濾紙分解成絮狀。螞蟻洞邊土與腐爛物混合樣品、多年堆放秸稈堆土與腐爛物混合樣品對(duì)濾紙的降解效果差，15天內(nèi)濾紙幾乎沒(méi)有變化，這20個(gè)樣品被淘汰。

圖1 纖維素分解菌的富集及初篩試驗(yàn)部分圖片

秸稈降解菌系繼代培養(yǎng)中，20℃培養(yǎng)條件下隨著傳代次數(shù)的增加對(duì)濾紙、玉米秸稈的分解速度逐漸加快，第5～6代復(fù)合菌系分解纖維素的速度明顯加快，第6代菌系在接種的第3天貼于瓶壁上的濾紙液面以上部分變得粗糙膨松，培養(yǎng)液由透明逐漸呈現(xiàn)黃褐色、綠色或黑色；到第5～6天，培養(yǎng)液面上部的濾紙全部變黃，培養(yǎng)液面下部貼近液面的濾紙變得松軟多孔；第7天氣液界面處濾紙斷裂。秸稈降解菌系分解濾紙所需時(shí)間超過(guò)15天的13個(gè)樣品被淘汰；其余7個(gè)菌系在以玉米秸稈為唯一碳源的液體、固體培養(yǎng)基上馴化。在玉米粉培養(yǎng)基上長(zhǎng)有同心圓狀、土灰色菌株和白粘的小點(diǎn)點(diǎn)菌落。秸稈降解菌系8號(hào)對(duì)玉米苞葉和莖髓降解較好，30天玉米苞葉厚壁組織和葉肉被降解，搖試管時(shí)斷裂（圖2）。

圖2 復(fù)合菌系對(duì)濾紙和玉米秸稈降解效果

2.2 溫度和pH對(duì)秸稈降解菌系生長(zhǎng)的影響

從圖3可知，15℃玉米秸稈發(fā)酵10天內(nèi)，pH 4.5、pH 6.5和pH 9.5秸稈降解菌系8號(hào)OD600值先下降，發(fā)酵第3天緩慢上升；pH 5.5時(shí)發(fā)酵前3天OD600值逐漸增加，到第4天有所降低；pH 7.5時(shí)第1～2天OD600值上升，第3天有所下降后緩慢上升；pH 8.5時(shí)培養(yǎng)前6天OD600值逐漸增加；秸稈降解菌系8號(hào)pH 4.5～9.5發(fā)酵5～6天OD600值直線(xiàn)上升，到第6天達(dá)到峰值，最大峰值是pH 7.5發(fā)酵液OD600值0.965，之后逐漸下降。

圖3 秸稈降解菌系8號(hào)15℃條件下生長(zhǎng)曲線(xiàn)

從圖4可知，20℃玉米秸稈發(fā)酵10天內(nèi)，秸稈降解菌系8號(hào)pH 4.5～9.5發(fā)酵液培養(yǎng)前期OD600值總體逐漸上升，OD600值第7天達(dá)到峰值，最大峰值是pH 8.5發(fā)酵液OD600值1.177，之后逐漸下降。pH 4.5和pH 8.5發(fā)酵第6天OD600值有所下降，pH 6.5發(fā)酵第4天OD600值有所下降，pH 7.5和pH 9.5下發(fā)酵第3天OD600值有所下降。

圖4 秸稈降解菌系8號(hào)20℃條件下生長(zhǎng)曲線(xiàn)

從圖5可知，15℃玉米秸稈發(fā)酵10天內(nèi)，秸稈腐熟劑OD600值發(fā)酵1～6天呈現(xiàn)“W”字樣變化，發(fā)酵4～6天發(fā)酵液OD600值直線(xiàn)上升，第6天達(dá)到峰值，最高峰值為pH 7.5發(fā)酵液OD600值1.109，隨后急速下降。

圖5 秸稈腐熟劑15℃條件下生長(zhǎng)曲線(xiàn)

從圖6可知，20℃玉米秸稈發(fā)酵10天內(nèi)，秸稈腐熟劑pH 4.5和pH 9.5發(fā)酵第5天OD600值緩慢下降，第6天開(kāi)始逐漸上升；pH 5.5、pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5發(fā)酵液OD600值1～6天呈上升趨勢(shì)。秸稈腐熟劑發(fā)酵液OD600值大體呈先增后減的趨勢(shì)，發(fā)酵第7天達(dá)到峰值，最高峰值為pH 5.5發(fā)酵液OD600值1.012，隨后急速下降。

圖6 秸稈腐熟劑20℃條件下生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.3 溫度和pH對(duì)秸稈降解菌系纖維素酶活性的影響

從表1可知，15℃和20℃條件下，隨著pH的增加，秸稈降解菌系8號(hào)和秸稈腐熟劑發(fā)酵液濾紙酶活性均呈先增加再降低的趨勢(shì)。15℃條件下，秸稈降解菌系8號(hào)不同pH發(fā)酵液濾紙酶活性無(wú)顯著差異；秸稈腐熟劑pH 4.5～7.5發(fā)酵液濾紙酶活性間無(wú)顯著差異，pH 8.5發(fā)酵液活性與pH 4.5、pH 6.5、pH 7.5的活性無(wú)顯著差異；pH 9.5發(fā)酵液活性顯著低于其他處理。20℃條件下，秸稈降解菌系8號(hào)pH 5.5～9.5發(fā)酵液濾紙酶活性無(wú)顯著差異，其中pH 5.5～8.5發(fā)酵液濾紙酶活性顯著大于pH 4.5；秸稈腐熟劑不同pH發(fā)酵液濾紙酶活性無(wú)顯著差異。

表1 玉米秸稈發(fā)酵體系濾紙酶活性 U/mL

15℃、pH 8.5培養(yǎng)條件下，秸稈降解菌系8號(hào)濾紙酶活性顯著高于秸稈腐熟劑發(fā)酵液；相同溫度下其余處理間無(wú)顯著差異。

從表2可知，隨著發(fā)酵液pH的增加，15℃稈降解菌系8號(hào)發(fā)酵液纖維素酶活性先增加后降低，秸稈腐熟劑發(fā)酵液纖維素酶活性逐漸下降的趨勢(shì)。15℃條件下，稈降解菌系8號(hào)pH 5.5、pH 6.5和pH 7.5發(fā)酵液纖維素酶活性無(wú)顯著差異，其中pH 7.5活性顯著高于pH 4.5、pH 8.5和 pH 9.5的活性；pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5、pH 8.5和pH 9.5間纖維素酶活性無(wú)差異；秸稈腐熟劑pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5間無(wú)顯著差異，pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5、pH 9.5發(fā)酵液纖維素酶活性間無(wú)顯著差異，pH 4.5和pH 5.5發(fā)酵液活性顯著高于pH 9.5。20℃條件下，秸稈降解菌系8號(hào)和秸稈腐熟劑不同pH發(fā)酵液纖維素酶活性均無(wú)顯著差異。

表2 玉米秸稈發(fā)酵體系纖維素酶活性 U/mL

相同培養(yǎng)條件下，pH 5.5、pH 6.5、pH 8.5、pH 9.5秸稈降解菌系8號(hào)和秸稈腐熟劑發(fā)酵液纖維素酶活性間無(wú)顯著差異；20℃、pH 4.5條件下，秸稈腐熟劑發(fā)酵液纖維素酶活性顯著高于秸稈降解菌系8號(hào)；15℃、pH 7.5條件下，秸稈降解菌系8號(hào)纖維素酶活性顯著高于秸稈腐熟劑發(fā)酵液。

2.4 溫度和pH對(duì)秸稈降解菌系秸稈降解率的影響

從圖7可知，15℃條件下，秸稈降解菌系8號(hào)pH 6.5和pH 7.5秸稈降解率顯著高于其余pH的降解率，pH 4.5降解率最低；而秸稈腐熟劑pH 4.5和pH 5.5的顯著高于其余pH的降解率。20℃條件下，秸稈降解菌系8號(hào)pH 7.5秸稈降解率顯著高于其余發(fā)酵液的降解率，pH 6.5、pH 8.5和pH 9.5的降解率無(wú)差異，但它們顯著高于pH 4.5和pH 5.5的降解率；而秸稈腐熟劑pH 4.5和pH 5.5的顯著高于其余pH下的降解率。

圖7 玉米秸稈發(fā)酵體系秸稈降解率

相同pH下，20℃的秸稈降解菌系8號(hào)pH 4.5的降解率顯著低于15℃的，其余pH 2個(gè)溫度下的秸稈降解率無(wú)差異；秸稈腐熟劑pH 9.5 2個(gè)溫度秸稈降解率無(wú)差異，其余pH 20℃的降解率顯著大于15℃的。相同溫度下，pH 4.5 2種菌系秸稈降解率間無(wú)差異，其余pH下秸稈降解菌系8號(hào)秸稈降解率顯著大于秸稈腐熟劑的降解率。

3 結(jié)論與討論

采用的3種富集培養(yǎng)方法中，玉米秸稈粉震蕩培養(yǎng)法富集到的纖維素分解菌材料較少，可能是玉米秸稈粉的成分比濾紙復(fù)雜，纖維素濃度較高，選擇壓力太大且富集培養(yǎng)代數(shù)不夠，難以在短期內(nèi)明顯降解玉米秸稈粉，所以篩選玉米秸稈分解菌時(shí)采用玉米秸稈培養(yǎng)基上多代馴化培養(yǎng)是非常必要的。玉米秸稈降解的過(guò)程中，木質(zhì)素的堅(jiān)韌結(jié)構(gòu)是降解過(guò)程的最大阻礙[17]，產(chǎn)各種纖維素酶系的菌吸附到玉米秸稈表面，導(dǎo)致微纖維鏈間氫鍵結(jié)合減弱、吸水力增加、纖維溶脹[18]、水解底物，需要各類(lèi)菌株所產(chǎn)生的酶類(lèi)協(xié)同才能完成對(duì)玉米秸稈的降解。玉米秸稈復(fù)合菌系對(duì)玉米莖髓部分的降解較多，玉米莖髓部位是秸稈中可利用纖維含量最高的部位[19]。玉米莖髓纖維素含量為玉米莖髓質(zhì)量的45%，半纖維素為35%，木質(zhì)素為15%；玉米秸稈中纖維素含量43%，半纖維素27%，木質(zhì)素20%[20]。莖皮的木質(zhì)素含量是莖髓的1.3倍，在全株中的比例為20.5%；莖髓占玉米秸稈的18.57%；酸性洗滌纖維和木質(zhì)素含量均以莖皮中最高（分別為52.0%和14.4%），苞葉中最低（分別為38.2%和6.7%）[20]。據(jù)此，本研究馴化玉米秸稈降解菌時(shí)，碳源的選用順序是濾紙條、玉米苞葉、莖髓、莖皮，逐漸增加木質(zhì)纖維含量。降解后的秸稈，莖髓降解較多，而外表皮被降解得較少。這可能與玉米秸稈外表皮結(jié)構(gòu)有關(guān)。外表皮是由致密的表皮細(xì)胞構(gòu)成，且表皮木質(zhì)化嚴(yán)重，微生物分泌的酶很難與秸稈中的纖維素及半纖維素分子接觸，造成了降解困難，而玉米秸稈的莖髓是含有大量纖維素及半纖維素的微管束，同時(shí)莖髓的薄壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，具有吸水能力，對(duì)降解有利。

pH能夠影響秸稈的腐殖化進(jìn)程，溶液酸堿度影響秸稈腐殖化產(chǎn)物[21]。秸稈發(fā)酵產(chǎn)物包括十五烷酸、正十六烷酸、2,4-二叔丁基酚和6-叔丁基對(duì)甲酚等酸、酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)抑制菌株B(Bacillus cereus)降解水稻秸稈的效率，菌株D2(Bacillusamyloliquefaciens)、W1(Ochrobactrum intermedium)、G1(Bacillus licheniformis)組成的復(fù)合菌群能夠減少包括4種物質(zhì)在內(nèi)的酸、酚類(lèi)含量，來(lái)提高秸稈降解效率[22]。學(xué)者們選育的秸稈降解菌系對(duì)pH有不同的響應(yīng)，復(fù)合菌系GF-20可在較大的溫度(4～30℃)和pH(6.0～9.0)范圍內(nèi)保持較高的纖維素和半纖維素酶活性，能發(fā)揮秸稈降解作用[23]；復(fù)合菌系LDC降解玉米秸稈的最佳降解條件為培養(yǎng)溫度32℃、初始pH 8.2[24]；pH 8.2、含水量1.42%、保藏濕度10%、保藏溫度15℃時(shí)，玉米秸稈降解復(fù)合菌系GFS72降解玉米秸稈的效率最高[25]；復(fù)合微生物CM17菌系在35、45、55℃，pH 6、pH 7.5、pH 10，都能正常分解纖維素[26]；草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株QSH3-3土壤偏堿性條件下對(duì)秸稈纖維素類(lèi)物質(zhì)的降解具有較高的應(yīng)用潛力[27]；木質(zhì)素的降解率與pH呈負(fù)相關(guān)，纖維素的降解率與pH呈正相關(guān)[28]；pH變化規(guī)律能夠反映WSC-6對(duì)木質(zhì)纖維素的分解進(jìn)程及分解活性[29]；pH 4.0時(shí)漆酶對(duì)玉米秸稈木質(zhì)素發(fā)生脫甲基作用最強(qiáng)[30]。本研究中秸稈降解菌系8號(hào)發(fā)酵適宜pH 7.5，15℃和20℃下無(wú)顯著差異；秸稈腐熟劑發(fā)酵適宜pH 5.5，適宜溫度為20℃。相同發(fā)酵條件下，稈降解菌系8號(hào)秸稈降解率顯著高于秸稈腐熟劑降解率。農(nóng)田條件下，秸稈腐解主要發(fā)生在秸稈還田后的前3年，累積腐解量達(dá)77.0%，腐解率隨時(shí)間呈線(xiàn)性下降[31]；土壤溫度的增加顯著促進(jìn)了稻稈的好氧分解[32]，稻稈的分解速率隨著溫度(-5、5、10、15、25℃)的升高而增加[33]；隨著溫度的降低，土壤有機(jī)物分解的溫度敏感性增加[34]，低質(zhì)量土壤中具有更高的溫度敏感性[35]；溫度、秸稈質(zhì)量和微生物碳源引起的微生物PLFA組成的變化可能會(huì)導(dǎo)致秸稈分解的變化[36]；在15、25、35℃的潮土條件下，秸稈化學(xué)性質(zhì)差異占小麥秸稈腐解細(xì)菌群落組成變異的19.3%、土壤性質(zhì)差異占24.0%、溫度差異占7.4%，秸稈的化學(xué)性質(zhì)對(duì)小麥秸稈腐解過(guò)程中不同溫度下細(xì)菌群落的組成產(chǎn)生了顯著的影響[37]。大量來(lái)自更難降解的碳庫(kù)，如纖維素和木質(zhì)素的降解率取決于溫度[38]；若爾蓋高原濕地沼澤土中分離到15～20、25～30、40～50℃3個(gè)溫度型的纖維素分解菌，不同纖維素分解菌的降解能力相差較大[39]；玉米秸稈腐解微生物代謝多樣性在不同溫度(15、25、35℃)下差異顯著[40]。-3℃和18℃下的玉米秸稈和甘藍(lán)廢棄物共青貯系統(tǒng)具有更高的生物降解潛力，并伴有較低的酸性洗滌劑木質(zhì)素(ADL)含量；而在34℃下生物降解潛力低、ADL含量高[41]。后續(xù)試驗(yàn)將在變溫、酸性土壤、中性土壤、堿性土壤等不同條件下，探索秸稈降解菌系對(duì)不同作物秸稈的降解過(guò)程中微生物群落組成的變化及其降解效果。