黃曉桃 石博文 吳云霞△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬湖北省婦幼保健院中西醫(yī)結合科，武漢 430070 2華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院藥理系，武漢 430030

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)，是一組造血組織功能衰竭綜合征，其發(fā)病機制與造血干細胞損傷、造血微環(huán)境受損、免疫功能異常特別是T細胞功能亢進和細胞毒性T淋巴細胞直接殺傷骨髓造血干細胞以及淋巴因子介導的造血干細胞過度凋亡引起的骨髓造血細胞減少和功能衰竭有關。從病因方面AA可分為先天性和后天性，其中，先天性AA又稱范科尼貧血(Fanconi anemia，FA)。現普遍認為，FA與22種不同基因突變所導致DNA雙鏈對交聯劑高度敏感、染色體損傷以及DNA雙鏈交聯修復功能缺失有關，將這些與FA有關的基因稱為FANC基因。在實驗室中常用的FA造模方法包括G2期電離輻射法和FANC基因敲除法。而后天性AA的動物模型則可基于其產生機制的不同，而采用不同的造模方法。本文將結合所得文獻，介紹并總結當前最為常用的幾種實驗室AA動物模型造模方法。

1 AA動物模型的通用評價標準[1-3]

動物體態(tài)改變：AA造模成功的動物，包括小鼠、大鼠和兔等，常會出現體重下降、精神萎靡、耳廓蒼白、瞇眼弓背、毛發(fā)蓬松豎立且無光澤等變化。

血象變化：AA模型動物相對于正常的對照組動物出現全血細胞減少，白細胞(white blood cell，WBC)中以中性粒細胞減少最為明顯，紅細胞(red blood cell，RBC)及血紅蛋白(hemoglobin，Hb)水平顯著下降，網織紅細胞(reticulocyte，RET)和血小板(platelet，PLT)數量減少。

骨髓象變化：AA模型動物的骨髓涂片中骨髓脂肪化明顯，骨髓有核細胞減少，非造血細胞增多，鏡下可見空泡數量明顯增多，出現較大和特大空泡。

2 FA動物模型造模方法

2.1 G2期電離輻射法

Zahnreich S等[4]通過對G2期的皮膚和肺成纖維細胞進行X射線照射，發(fā)現實驗細胞的H2AX(一種H2A組蛋白的變型)、53BP1(一種DNA修復因子)或RPA(一種與DNA雙鏈斷裂修復相關的蛋白)定量異常；同時通過細胞遺傳學分析，發(fā)現在G1期及G2期照射后可見染色體過早凝聚，DNA雙鏈之間出現無法修復的交聯，表現出與臨床上FA一致的細胞改變。

2.2 基因敲除法

2.2.1 直接敲除FANC基因 Zhang H等[5]在進行FA相關實驗時采用了生物公司制作的Fancd2-/-基因敲除小鼠，使用基因敲除所得到的小鼠其FA發(fā)病機制與臨床上人類FA發(fā)病機制具有高度一致性，因此在實驗室進行FA相關實驗時常使用FANC相關基因敲除小鼠。但由于使用FANC相關基因敲除小鼠所制作的FA模型并不能完全重現人類FA的所有臨床表現，故而在運用方面亦具有一定的局限性[6]。

2.2.2 敲除可對FANC基因產生作用的其他基因 如Jamsai D等[7]在使用GGN-/-基因敲除小鼠時發(fā)現GGN的最大亞型GGN1可與FANC基因的關鍵組分FANCD2(一種由FANC基因編碼的關鍵蛋白)相互作用，在敲除掉GGN基因后，敲除小鼠表現出對絲裂霉素C的高度敏感性并且出現大量染色體異常等類似于FA的臨床癥狀。

2.2.3 骨髓細胞端?？s短法 B?r C等[8]通過敲除小鼠的Trf1基因，使得造血干細胞出現代償性增生而出現端粒迅速縮短，進而導致了基因敲除小鼠的WBC、Hb、RBC和PLT水平明顯降低。但現在普遍認為，臨床人類FA貧血的發(fā)病機制是通過作用于FANC基因介導的DNA修復途徑導致DNA的交聯和染色體破壞，因此通過該法制造的FA小鼠僅在外周血象及骨髓象表現與臨床FA具有相似性。

3 后天性AA動物模型造模方法

3.1 物理方法造模

該方法是基于造血干細胞減少導致貧血的發(fā)病機理而設計的，過去常使用76 Gy60Co γ射線對實驗動物進行全身照射(劑量率為1 Gy/min)，該法所制得AA動物模型基本符合人類臨床AA發(fā)病特點且制作周期短[9]，但由于使用射線單獨造模難以控制照射量，經常導致動物因過量照射死亡，并且還存在設備不便、需要特殊防護、操作繁瑣、對人體存在傷害等問題，因此現在常使用物理射線聯合化學藥品(氯霉素、環(huán)磷酰胺)進行復合造模，所得動物模型具有較好穩(wěn)定性，且操作比較簡便。

3.2 物理聯合化學方法造模

張樂等[10]將BALB/c小鼠于第1天予以3.0 Gy137Cs γ射線照射(劑量為91 Gy/min)，之后分別于第4天、第5天、第6天予以環(huán)磷酰胺、氯霉素腹腔注射；結果模型小鼠血液WBC和PLT水平迅速下降，Hb和RET顯著減少；經骨髓象檢查發(fā)現骨髓有核細胞數量顯著減少，于鏡下觀察到大量脂肪細胞和非造血細胞增生；該動物模型符合AA的臨床表現。通過該方法制得的AA小鼠模型骨髓衰竭持續(xù)時間長，生存率也相對穩(wěn)定，因此在近幾年的AA造模中常使用復合方法造模，而較少使用單獨射線照射造模。

3.3 化學方法造模

3.3.1 苯 最早應用于AA造模的化學試劑是苯劑，苯及其代謝產物在體內超過一定限度可對造血系統(tǒng)產生嚴重傷害致使造血微環(huán)境損傷，從而導致AA的發(fā)生。賀今等[11]將小鼠背側皮下注射玉米油與苯油的混合液(苯劑量2 mL/kg)，分別于造模第5天、第10天、第15天、第20天和第25天注射；最后一次注射后第2天抽查外周血象，可見其WBC、RBC、Hb、PLT和RET水平明顯下降；通過其骨髓象檢查發(fā)現，小鼠造血面積顯著減少，脂肪細胞增多，骨髓間質血竇充血。通過苯間斷注射誘導AA動物模型不僅使得外周血象各指標均顯著下降，而且造模成功后沒有引起小鼠死亡，因而此種造模方式明顯優(yōu)于射線照射造模。外周血免疫學分析結果顯示，模型組CD4+細胞比例低于對照組，CD8+細胞比例高于對照組，CD4+/CD8+比例低于對照組；表明在實驗動物模型的發(fā)病過程中有細胞免疫的參與，這與臨床上AA具有一致性。

3.3.2 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)聯合白消安 5-FU為抗代謝藥，主要殺傷處于增殖周期內的細胞，而非增殖周期內的細胞則不會受到殺傷作用，且5-FU主要富集在骨髓中，其骨髓中濃度為血漿濃度2倍，因而可以導致造血功能損傷。白消安屬于烷化劑，為細胞周期非特異性藥物，由于其血液毒性將會對造血細胞進行殺傷，可與5-FU同用產生協(xié)同作用。蘇攀柯等[2]將SD大鼠第1天予以5-FU腹腔注射150 mg/kg，第5天予以白消安蒸餾水懸液灌胃15 mg/kg；一周后進行外周血象檢查，顯示WBC、Hb和RBC水平均明顯減少；骨髓涂片可見骨髓非造血細胞增生明顯，脂肪化嚴重，骨髓有核細胞數量大幅減少，出現大空泡；該動物模型的血象及骨髓象較為接近臨床人類AA。

3.3.3 環(huán)磷酰胺聯合白消安 由于環(huán)磷酰胺與白消安均可導致造血干細胞損傷，Chen YF等[12]將ICR小鼠使用環(huán)磷酰胺40 mg/kg和白消安20 mg/kg聯合皮下注射12 d后進行外周血象檢查，結果與對照組相比，模型組小鼠WBC、RBC、Hb、PLT和骨髓有核細胞計數分別顯著下降64.32%、42.33%、20.04%、61.53%和68.25%；骨髓檢查發(fā)現骨髓有核細胞數量大幅減少，脂肪化嚴重，出現大空泡；這些指標表明該法所造的動物模型與臨床AA的表現基本一致。

3.3.4 重組人γ-干擾素聯合白消安 劉香等[13]選用重組人γ-干擾素聯合白消安進行造模，他們通過使用干擾素以達到類似于免疫介導所致T細胞功能亢進的效果，從而使用較為簡單的方法以制造與免疫介導方法相近的AA模型，因此此種方法也可歸屬于免疫介導方法。使用該法制造的AA模型在第7天時出現WBC、PLT、Hb水平下降，與對照組第7天相比具有顯著差異，在第14天時AA模型鼠的血象與對照組比較仍顯著下降，第7天與第14天血象比較則無顯著差異。這表明使用該法所得到的模型鼠表現出與AA相似的血象變化，且該造模方法具有較好的穩(wěn)定性。

除了上述方法以外，還有采用乙酰苯肼聯合環(huán)磷酰胺腹腔注射以建立AA大鼠模型[14]以及使用氯霉素[15]進行AA造模，這些動物模型其病理表現也接近于人類AA。越來越多的研究表明，聯合使用化學試劑制造AA動物模型，其機制都有免疫細胞的參與，病理表現較接近于人類AA的臨床病理表現。

3.4 免疫介導法造模

免疫介導是通過誘導T淋巴細胞功能亢進并產生細胞毒性T淋巴細胞而導致AA的動物模型制造方法，由于T淋巴細胞功能亢進是臨床AA最重要的發(fā)病機制，因此該方法制造的動物模型是最能反映臨床狀況的動物模型。該造模方法包括病毒感染和淋巴細胞輸注。前者主要用于FA的基因治療，Czechowicz A等[16]報道了由攜帶FANC相關基因的慢病毒進行兒童FA的臨床基因治療，而在實驗室中普遍使用的是淋巴細胞輸注法制造AA模型。Wu D等[17]將DBA/2小鼠通過頸椎脫臼法處死后收獲胸腺并制備成細胞懸液，再將細胞懸液通過尾靜脈注射進入經過Co照射4 h后的小鼠體內，第10天時檢查其外周血象發(fā)現AA組小鼠WBC、Hb、RBC和PLT水平明顯降低，而且其骨髓檢查也出現了經典的AA病理表現。該法所制得的模型，同樣有細胞免疫的參與，因此其發(fā)病機制與人類AA相近。雖然該模型制造周期短，但其操作繁瑣，胸腺懸液制備需要嚴格無菌。

4 評價與展望

實驗室中對于FA動物模型主要通過敲除小鼠相關基因制備，當前實驗室經常使用的FANC基因敲除小鼠發(fā)病后的血象特點與人類相似，但基因敲除所導致的FA模型動物表現出的發(fā)育異常、貧血和癌癥傾向并不能完全模擬臨床FA癥狀[18-20]，同時靶向于FANC基因的治療結果也均不理想[21-22]。

后天性AA動物模型在篩選AA治療藥物方面較為常用，其制備方法通常包括物理、物理聯合化學、化學試劑聯用以及免疫介導法。其中，化學試劑聯用制造AA動物模型因為具有操作簡便、試劑易得、評價方法成熟等優(yōu)點而被大量采用，但是該法也存在與臨床AA病理表現一致性不夠高的缺點。物理、物理聯合化學方法由于射線照射操作不便，因此較為少用，現在已經被化學試劑聯合造模方法所替代。在4種后天性AA動物模型造模方法中，免疫介導法中的淋巴細胞輸注法制造AA動物模型，與人類AA最為相似，但是其操作更加繁瑣。后天性AA動物模型的另3種制造方法各有優(yōu)缺點，但均有小鼠模型穩(wěn)定性不夠高以及外周血象(WBC、PLT、RBC、Hb)下降程度不一致的問題，因此在實際的實驗造模過程中尚應根據具體實驗需要進行選擇和改進[23-24]。

中醫(yī)藥在緩解造血功能障礙、治療AA方面具有獨特的優(yōu)勢，療效穩(wěn)定，毒副作用少，臨床選方用藥可以從解毒、化瘀、化痰、補腎、健脾、益氣、養(yǎng)血等多方面進行合理配伍以治療。在研發(fā)新的防治AA中藥新藥過程中，我們需要合理選擇契合度高的AA模型以便能全面、準確評估中藥的療效并推薦用于臨床適合類型。以上模型可用于初步篩選，但如果要更加合理評估中醫(yī)藥療效，則需要以辨證為依據建立中醫(yī)相應AA動物模型則更好，目前這方面工作尚有很多不足，希翼對AA有興趣的臨床和科研工作者進一步探索新的中醫(yī)證型AA模型和中西醫(yī)結合模型，從而能充分評估和顯示中醫(yī)藥在治療AA方面的優(yōu)勢。