周國權(quán) 黃承俊

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110032）

體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)是家畜繁育的核心技術(shù)之一。但豬育種中利用該技術(shù)的效果不如牛、羊育種,一是因?yàn)轶w外胚胎生產(chǎn)技術(shù)常與細(xì)管凍精技術(shù)相結(jié)合,而豬體外胚胎的超低溫冷凍難度較大,進(jìn)展較為緩慢[1]。豬的鮮精液在低溫下具有較長的受精保存期[2,3],能夠滿足國內(nèi)任意長距離運(yùn)輸?shù)男枰?。而?xì)管凍精不僅各指標(biāo)都不如鮮精液[4,5],而且在人工授精前還需要解凍并稀釋到一定的精液量[6],推廣難度大。二是因?yàn)樨i為多胎動物,具有高繁特性。我國多數(shù)品種的豬平均窩產(chǎn)仔數(shù)都在10頭以上,有些地方品種豬的產(chǎn)仔數(shù)甚至達(dá)到幾十頭的水平[7],這都是體外胚胎移植難以達(dá)到的高度[8],也是豬體外胚胎生產(chǎn)難以發(fā)揮優(yōu)勢的主要原因。此外,體外胚胎生產(chǎn)不僅需要一定的條件和造價,還難以保證移植后仔豬的品質(zhì)與數(shù)量,綜合成本或不低于直接購買。

隨著我國對種質(zhì)資源普查與保護(hù)的推進(jìn),作為家畜資源保護(hù)與利用的重要技術(shù)手段之一,豬體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系的應(yīng)用也逐漸被重視起來,且已運(yùn)用于某些地方品種豬的保護(hù)與開發(fā)中[9]。此外,我國豬凍精的生產(chǎn)也取得了很大突破[10,11],在一定程度上促進(jìn)了豬體外胚胎生產(chǎn)體系的成熟。本文從豬卵母細(xì)胞的體外成熟、體外受精和胚胎的體外培養(yǎng)等3方面對我國豬體外胚胎生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,以期為相關(guān)學(xué)者提供參考。

1 豬卵母細(xì)胞的體外成熟

卵母細(xì)胞的體外成熟是體外胚胎生產(chǎn)體系中相對較為成熟和簡單的技術(shù)環(huán)節(jié)。卵母細(xì)胞除了用于體外胚胎的生產(chǎn)外,還廣泛用于克隆胚胎、單精注射胚胎和孤雌激活胚胎的研究。尤其豬等多胎類家畜,由于體外胚胎在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用相對較少,該技術(shù)環(huán)節(jié)更偏向于研究領(lǐng)域。

1.1 卵巢的運(yùn)輸條件及卵母細(xì)胞的獲取

卵巢是卵母細(xì)胞的發(fā)育儲存庫,保護(hù)好卵巢即是保護(hù)好卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞的保存條件并不十分嚴(yán)格,如距離較近時,可以直接采集并短時間常溫保存,然后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理即可[12,13]。距離稍遠(yuǎn)時可用含青鏈霉素的30～37℃的生理鹽水先保存,于1～2 h帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理[14,15],且最好不超過6 h。距離再遠(yuǎn)就需低溫保存,此外,也有用其他溫度生理鹽水保存運(yùn)輸?shù)腫16,17]。一般卵巢離體后,運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的時間越短越好。卵巢的保存溫度和運(yùn)輸時間因?qū)嶒?yàn)室而異,并無嚴(yán)格的數(shù)值限定。

卵巢運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后,多數(shù)是先去除周圍多余的組織,然后用含青鏈霉素的37℃左右的生理鹽水洗3～4次,最后進(jìn)行卵母細(xì)胞的采集操作。由于豬卵母細(xì)胞的采集多采用集中撿卵法,可以無需采卵液,因此,有的實(shí)驗(yàn)室則不經(jīng)清洗直接進(jìn)行采卵。方法主要為抽吸法,方便快捷。常用18號針頭的10 mL注射器,對表面直徑為3～8 mm的卵泡進(jìn)行側(cè)吸,然后集中撿卵。

用于體外成熟的卵子一般為具有3層及以上卵丘細(xì)胞的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。這與其他家畜類似,因?yàn)槁懵?DOs)的成熟率、受精率和囊胚發(fā)育率均極顯著低于COCs[18]。撿出的COCs用成熟液洗滌后即可進(jìn)行成熟培養(yǎng),一般洗滌次數(shù)為3次。

1.2 卵母細(xì)胞的體外成熟

常用于豬卵母細(xì)胞體外成熟的基礎(chǔ)培養(yǎng)液有TCM199和NCSU-23,其中NCSU-23基礎(chǔ)培養(yǎng)液是豬卵母細(xì)胞體外成熟液的專用基礎(chǔ)培養(yǎng)液,效果較好[19]。但也有試驗(yàn)顯示NCSU-23不如改良后的TCM199或無差異[20,21],加上TCM199市場化較為成熟,因此,國內(nèi)研究以使用TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液的較多。成熟培養(yǎng)液在基礎(chǔ)培養(yǎng)液上常添加10%胎牛血清(FBS)、10 IU/mL促卵泡素(FSH)、10 IU/mL促黃體素(LH)、0.6/0.57 mmol/LL-半胱氨酸等,或用10%豬卵泡液代替10%FBS,用10 IU/mL孕馬血清促性腺激素(PMSG)、10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素(hCG)代替10 IU/mL FSH和10 IU/mL LH,有條件的還可加上10 ng/mL表皮生長因子(EGF)及其他改良因子等。培養(yǎng)條件基本都是38.5～39℃、飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42～44 h。也有培養(yǎng)46～48 h,甚至更長的,但據(jù)賈佩[22]報道培養(yǎng)時間較長其卵裂率和囊胚率均顯著低于40～42 h。一般而言,豬卵母細(xì)胞的體外成熟時間應(yīng)不低于40 h,但也不能太長,否則會增加染色體的異常率。

2 豬成熟卵母細(xì)胞的體外受精

體外受精技術(shù)主要用于體外胚胎的生產(chǎn)。因其可對精子質(zhì)量進(jìn)行直接的檢驗(yàn),也常用于各種精子稀釋液、冷凍保存液、種公畜精液等的品質(zhì)檢測。由于豬的多胎特性及豬體外胚胎移植產(chǎn)仔率顯著低于人工授精的現(xiàn)狀,使得體外胚胎生產(chǎn)在豬的應(yīng)用推廣上難度較大。因此該技術(shù)環(huán)節(jié)常見于實(shí)驗(yàn)室研究、檢驗(yàn)及少量的良種保護(hù),在科研中常被孤雌激活技術(shù)所替代。

2.1 精子的洗滌

精子的洗滌是為獲能做準(zhǔn)備,同時去除雜質(zhì),篩選出活力較強(qiáng)的有效精子。精子獲能是體外受精的必備前提,獲能的好壞直接關(guān)系到體外受精成功與否。因此,精子的洗滌環(huán)節(jié)十分重要。但對于某些特殊對象或試驗(yàn)研究,精子的獲能環(huán)節(jié)可被單精注射等輔助生殖技術(shù)所替代,而精子則仍需進(jìn)行洗滌。

豬精子的洗滌方法與其他家畜的一樣,有上浮法、直接洗滌法和Percoll密度梯度離心法。運(yùn)用上浮法時,上浮1 h最有利于受精胚胎的發(fā)育,且受精卵的卵裂率和囊胚率均表現(xiàn)最高[22]。運(yùn)用Percoll密度梯度離心法時,精子獲能時間在20～40 min較為理想[23]。精子洗滌方法的選擇因人和實(shí)驗(yàn)室條件而異,各有優(yōu)缺點(diǎn)。

洗滌后的精子需對濃度進(jìn)行調(diào)試,以供受精使用。豬體外受精用精子的濃度一般為105～106個/mL。蘭宗寶[24]對0.25×106～8×106個/mL豬精子濃度的體外受精情況做了對比,結(jié)果顯示,精子濃度為1×106個/mL時囊胚率表現(xiàn)最高,但該區(qū)間的卵裂率和囊胚率均無顯著性差異。

2.2 豬卵母細(xì)胞的體外受精

可用于豬卵母細(xì)胞的體外受精溶液有多種,如mTCM199、mTALP、BO液、PGM、mTBM等。其中mTBM因具有較好的受精效果而被各實(shí)驗(yàn)室廣泛采用[25]。受精前,常添加200 ug/mL的肝素以保證精子的充分獲能?；蛱砑右欢康呐Ｑ灏椎鞍?BSA)、BSA+咖啡因等獲能因子來促進(jìn)精子的獲能。其受精時間為6 h,受精條件為38.5～39℃、飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱,受精方式為微滴法。體外受精液的選擇因人、實(shí)驗(yàn)室條件和試驗(yàn)用途而異,但不管使用哪一種,其卵裂率和囊胚率均顯著低于孤雌激活胚。這可能與豬的體外受精多精入卵率相對較高(可達(dá)80%)[26]和受精后雄原核形成率相對較低等因素有關(guān)。

3 豬胚胎的體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)技術(shù)主要用于受精卵、孤雌激活胚、克隆胚、類囊胚等可發(fā)育、短暫發(fā)育胚胎、類胚胎的體外發(fā)育,以生產(chǎn)融合胚、桑囊胚及相關(guān)研究。該技術(shù)環(huán)節(jié)相對簡單,主要在于培養(yǎng)液的選用和優(yōu)化。

可用于豬胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基有NCSU-23、NCSU-37、PZM[27]等。但相比之下NCSU-23更有利于豬受精卵的體外發(fā)育,其使用時常添加0.4%的BSA,也可添加其他因子或在培養(yǎng)第5 d后添加10%FBS(或FCS、或PFF)以促進(jìn)囊胚的發(fā)育[28],不可使用豬血清。有試驗(yàn)顯示,PZM-3的卵裂率和囊胚率與NCSU-23的差異不明顯,有時還略優(yōu),囊胚細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)占囊胚細(xì)胞總數(shù)的比例均顯著高于NCSU-23[29]。因此,在國內(nèi),豬胚胎的體外培養(yǎng)多選用以上2種培養(yǎng)液,一般PZM-3更適合于豬孤雌激活胚胎和克隆胚胎的培養(yǎng)。

豬胚胎的體外發(fā)育會遇到阻滯現(xiàn)象,常發(fā)生在4-細(xì)胞階段。除上述培養(yǎng)液外,細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)也能支持豬受精卵的進(jìn)一步發(fā)育。Nagai等[30]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),豬2-細(xì)胞胚胎與豬輸卵管上皮細(xì)胞或豬胚原代成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時,囊胚率能分別達(dá)到67%和61%。此外,顆粒細(xì)胞單層亦能有效提高豬體外受精卵的囊胚發(fā)育率[31,32]。但該技術(shù)在國內(nèi)運(yùn)用的很少,一方面可能豬的試驗(yàn)材料相對較為豐富,而運(yùn)用于胚胎移植的需求相對較少。另一方面可能豬的孤雌激活囊胚率相對較高,程序簡單且穩(wěn)定,干擾因素少,較卵母細(xì)胞的體外受精和胚胎的體外培養(yǎng)更具試驗(yàn)優(yōu)勢。

豬胚胎的體外培養(yǎng)條件與其他家畜的一樣,也是38.5～39℃、飽和濕度、5%二氧化碳培養(yǎng)箱。培養(yǎng)方式為微滴法。觀察時間也基本相同,即48 h后檢查卵裂情況,7 d后檢查桑囊胚的發(fā)育情況。

4 結(jié)論

豬的體外胚胎生產(chǎn)各關(guān)鍵技術(shù)因其多產(chǎn)多胎的特性受到影響,雖然該技術(shù)體系在國內(nèi)已十分成熟,但用途仍集中在試驗(yàn)研究方面,目前以卵母細(xì)胞的體外成熟—孤雌激活—胚胎的體外培養(yǎng)線路為主流。隨著我國種質(zhì)資源普查與保護(hù)的推進(jìn),豬體外胚胎保種勢必列入各省地方豬品種保護(hù)與利用的關(guān)鍵技術(shù)之中,應(yīng)用也將更傾向于生產(chǎn)。本文討論了豬體外胚胎生產(chǎn)各關(guān)鍵環(huán)節(jié)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀,將有助于各地方豬體外胚胎保種體系的建立。