鄧臣，劉云浪，胡蓉，陳建義，王金玲，齊秀娟，申芝芝，謝林伸，蒙艷，朱婷婷,*

1. 深圳市環(huán)境科學(xué)研究院國家環(huán)境保護(hù)飲用水水源地管理技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市水環(huán)境中新型污染物檢測與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518001 2. 中國地質(zhì)大學(xué)（武漢）環(huán)境學(xué)院，武漢 430074 3. 深圳市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站寶安分站，深圳 518001

隨著全球逐步禁止使用溴系阻燃劑，新型有機(jī)磷系阻燃劑（organophosphate flame retardants, OPFRs）在國內(nèi)外得到越來越廣泛的應(yīng)用[1]。由于OPFRs主要以摻雜混合而非化學(xué)鍵合方式加入材料，且部分OPFRs具有半揮發(fā)性，較容易進(jìn)入土壤、水和大氣環(huán)境中[2]。磷酸三（2-丁氧基乙基）酯（tris（2-butoxyethyl） phosphate, TBOEP）是目前環(huán)境暴露的主要的OPFRs之一，在環(huán)境介質(zhì)和生物體內(nèi)廣泛檢出，含量最高可達(dá)mg·kg-1級別。如歐洲國家、新西蘭、科威特和中國北京的粉塵樣品TBOEP含量范圍為0.36～6 836 ng·g-1[3-7]，珠江淡水魚樣本中檢測到的TBOEP濃度范圍則達(dá)1 647～8 840 ng·g-1[8]。

目前TBOEP對生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等以及遺傳和基因表達(dá)的影響逐漸成為當(dāng)前TBOEP生物毒性研究的主要內(nèi)容，其潛在毒性是目前的研究熱點(diǎn)。當(dāng)前關(guān)于TBOEP的毒代實(shí)驗(yàn)主要分為體內(nèi)代謝和體外代謝實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，V?lkel等[9]探究了人體單次口服給藥TBOEP后的毒代動力學(xué)。體外代謝的研究主要集中在細(xì)胞清除率、代謝物及其影響等方面，如經(jīng)試驗(yàn)觀察，TBOEP在干細(xì)胞的光滑線粒體的體外清除率存在物種差異，人類的體外代謝速率最快，魚類次之，最后是鳥類。當(dāng)前有關(guān)于TBOEP的毒代動力學(xué)數(shù)據(jù)研究還比較缺乏，其研究對象樣本單一、暴露時間短，數(shù)據(jù)不足以探究其毒代動力學(xué)規(guī)律[10]。毒物排泄研究是構(gòu)成毒代動力學(xué)的關(guān)鍵。為此，本研究以雄性SD大鼠為觀察對象，建立液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀測定尿液和糞便中TBOEP及其代謝物含量的方法，探究TBOEP及其代謝物在尿液、糞便中的排泄規(guī)律，為其毒代動力學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試劑與儀器

磷酸三（2-丁氧基乙基）酯（tris（2-butoxyethyl） phosphate, TBOEP）和雙（2-丁氧基乙基）-2-（3-羥丁氧基）乙基磷酸三酯（tris（2-（3-hydroxy）butoxyethyl） phosphate, 3-OH-TBOEP）標(biāo)準(zhǔn)品購于德國Dr. Ehrenstorfer公司。雙（2-丁氧基乙基）-2-羥基乙基磷酸三酯（bis（2-butoxyethyl）-（2-hydroxyethyl） phosphate, BBOEHEP）、雙（丁氧基乙基）磷酸酯（bis（2-butoxyethyl） phosphate, BBOEP）標(biāo)準(zhǔn)品和回收率指示物磷酸三正丁酯-d27（tri-n-butyl phophate-d27, TBP-d27）購于加拿大Toronto Research Chemicals Inc.公司。

1260-6460液相色譜儀-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；固相萃取裝置（24位，CNW，中國）；Milli-Q Direct8超純水儀（美國Millipore公司）；微量注射器（1 000 μL、100 μL、10 mL，CNW）；WAX Plus固相萃取柱（3 mg, OASIS，美國）。標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇和乙腈（色譜純，默克，德國），甲酸、親水PTFE針式濾器（雙層膜）0.22 μm和1 mL無菌連針注射器均購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份公司（中國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SD大鼠42只，SPF級；體質(zhì)量范圍為（100±25） g；動物來源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證及動物質(zhì)量合格證號為11400700270978。實(shí)驗(yàn)動物喂養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24 ℃，相對濕度60%～65%。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物暴露劑量與染毒

SD大鼠21只，雄性，分別置于21只代謝籠中，給藥前12 h禁食，不禁水，收集空白尿液、糞便。而后灌胃染毒，劑量為750 mg·kg-1TBOEP。

1.4 取材

染毒后，分別收集0～24 h、24～48 h、48～72 h、72～96 h、96～120 h、120～144 h和144～168 h的尿液和糞便，共設(shè)7個采樣時間段。

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品預(yù)處理

新鮮尿液經(jīng)采集后冰上運(yùn)輸，送回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存。將尿液完全解凍后，取1 mL于特氟龍管中，加入標(biāo)準(zhǔn)替代物，使其濃度為50 ng·mL-1。

新鮮糞便經(jīng)采集后冰上運(yùn)輸，送回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存。而后經(jīng)冷凍干燥、研磨后，取0.5 g糞便于離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)替代物，使其濃度為150 ng·g-1，將加標(biāo)后的糞便放置在-20 ℃冰箱冷凍過夜，次日對糞便樣品進(jìn)行前處理；在樣品中加入0.5 mL甲醇，1粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩5 min后，離心分離取上清液，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈試管中，再重復(fù)上述步驟2次，將3次的上清液合并，并用純水稀釋至3 mL。

1.5.2 固相萃取

對經(jīng)過前處理的樣品尿液/糞便提取液進(jìn)行固相萃取，步驟如下。在固相萃取裝置上將WAX Plus萃取小柱安裝好后，將2 mL含5%的氨水甲醇溶液加入小柱，讓溶液自然滴落，待溶液與小柱內(nèi)物質(zhì)持平，再加入2 mL含8‰的甲酸的超純水進(jìn)行同樣的操作。而后將已經(jīng)過前處理的樣品過已活化好的小柱，流出液棄去。用2 mL含有8‰甲酸的超純水淋洗小柱。淋洗后，用真空泵抽吸約15 min左右，保證固相萃取小柱干燥。對干燥后的小柱，依次用300 μL（糞便0.75 mL）含5%氨水的甲醇溶液，700 μL（糞便0.75 mL）乙腈洗脫，洗脫液先浸泡柱子2 min，再使洗脫液自然滴落，收集洗脫液。用超純水定容至1 mL（糞便1.5 mL），冷凍后過0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.6.1 給藥TBOEP溶液的配制

量取適量TBOEP液體，溶于食用油，配制濃度為750 mg·mL-1的溶液，臨用前配制。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱量各目標(biāo)化合物、回收率指示物，分別溶解于甲醇中，各配制成濃度為10 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.7 色譜質(zhì)譜條件

使用Agilent 1260系列液相色譜用于目標(biāo)化合物的分離，色譜柱為Agilent ZORABX SB-C18，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動相為甲醇（A）和0.002 mol·L-1的乙酸銨溶液（B），流動相流量250 μL·min-1。流動相梯度洗脫如表1所示。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；離子源電離模式Positive。毛細(xì)管電壓為3 500 V，霧化器壓力為310.2 kPa，載氣為高純氮?dú)猓d氣溫度為330 ℃，流量9.5 L·min-1，用MRM檢測，分析物的濃度均配制為50 μg·L-1。通過連接注射針泵注入離子源（注射流量為10 μL·min-1，色譜泵流量200 μL·min-1），樣品帶電后進(jìn)入質(zhì)量分析器，通過總離子流圖和相應(yīng)的質(zhì)譜圖結(jié)果確定每種化合物的母離子和子離子，并根據(jù)響應(yīng)情況優(yōu)化碰撞能和碎裂電壓，每種分析物的保留時間、監(jiān)測離子、輸入電壓和碰撞能如表2所示。

1.8 數(shù)據(jù)處理

按如下公式計(jì)算結(jié)果：每24 h尿液（糞便）排泄量=每24 h尿液（糞便）總量×尿液（糞便）中濃度；累積排泄量=0～24 h、24～48 h、48～72 h、72～96 h、96～120 h、120～144 h、144～168 h共7個采樣時間段的排泄量之和；排泄速率=每個采樣時間段排泄量/進(jìn)入體內(nèi)化學(xué)品總量×100%；累積排泄率=累積采樣時間段排泄量/進(jìn)入體內(nèi)化學(xué)品總量×100%。

表1 流動相梯度洗脫Table 1 Gradient elution of mobile phase

2 結(jié)果（Results）

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

利用TBP-d27作為標(biāo)準(zhǔn)替代物，配制2、5、10、50、100和500 μg·L-1曲線點(diǎn)，繪制配制濃度的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線。目標(biāo)化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限如表3所示。

2.2 加標(biāo)回收率與基質(zhì)效應(yīng)

制備樣品基質(zhì)加標(biāo)樣（混標(biāo)濃度10 μg·L-1（樣品基質(zhì)））各6個，不加標(biāo)基質(zhì)樣品3個，超純水不加標(biāo)空白對照樣品3個，按照1.5節(jié)方法進(jìn)行前處理，計(jì)算加標(biāo)回收率。各目標(biāo)物回收率范圍在65%～126%之間，平行樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<15%。

2.3 尿液樣品的排泄情況

大鼠經(jīng)口灌胃750 mg·kg-1TBOEP后，尿液中TBOEP及其代謝物不同時間段排泄量測定數(shù)據(jù)如圖1所示，累積排泄速率數(shù)據(jù)如圖2所示。由圖1可知，0～168 h，母體化合物尿液排泄量為（3.61±0.92） μg，代謝物BBOEP為（5.88±1.41） μg，BBOEHEP為（9.86±1.53） μg，代謝物BBOEHEP主要經(jīng)過尿液排泄。大鼠經(jīng)口染毒后，隨著時間的增加而排泄量增加，母體化合物TBOEP暴露后24 h在尿液中排泄量最大，168 h后依然可以檢出?？芍?，母體化合物TBOEP在第1天排泄量較高，證明通過飲食途徑攝入的TBOEP可以被大鼠通過循環(huán)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)快速排出體外，而后續(xù)的波動可能說明了大鼠排除體內(nèi)TBOEP的速度受到多重因素的影響，具體的影響則需要結(jié)合器官中的毒物殘留數(shù)據(jù)來進(jìn)行分析。代謝物方面，除3-HO-TBOEP在尿液中未檢出外，BBOEP和BBOEHEP在尿液中均能檢測到。由圖1可知，代謝物BBOEP在0～24 h的排泄量為（1.01±0.21） μg，第2天（24～48 h）的排泄量升至（2.74±0.52） μg，之后的數(shù)據(jù)呈下降趨勢。代謝物BBOEHEP在0～24 h的排泄量最大，達(dá)到了（8.67±1.22） μg，第2天（24～48 h）的排泄量出現(xiàn)了大幅度下降，僅為（0.039±0.013） μg，呈現(xiàn)了較大的波動，在第3天（48～72 h）和第5天（96～120 h）出現(xiàn)比前日樣本讀數(shù)高的情況，分別為（0.88±0.23） μg和（0.23±0.05） μg，可以看出BBOEHEP在大鼠體內(nèi)生成的速率較快，因此第1天的尿液中檢出量遠(yuǎn)高于后續(xù)檢出量。

表2 ESI-MS/MS保留時間、監(jiān)測離子、碎裂電壓和碰撞能Table 2 ESI-MS/MS retention time, monitoring ion, fragment and collision energy

圖1 不同時間段TBOEP及其代謝物尿液排泄量Fig. 1 Urine excretion of TBOEP and its metabolites at different time periods

圖2 大鼠灌胃750 mg·kg-1 TBOEP后尿液中TBOEP及其代謝物排泄率Fig. 2 The excretion rate of TBOEP and its metabolites in the urine of rats after intragastric administration of 750 mg·kg-1 TBOEP

168 h內(nèi)TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP的尿液累積排泄率分別為0.0043%、0.0069%和0.0114%。根據(jù)圖2尿液中TBOEP及其代謝物不同時間段的排泄率可知，在TBOEP的代謝物中BBOEP和BBOEHEP的生成量明顯多于3-HO-TBOEP。根據(jù)van den Eede等[11]的研究，人類肝細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)的情況下，將TBOEP轉(zhuǎn)化為BBOEHEP的速率約為2 560 pmol·min-1·mg-1（蛋白質(zhì)），而BBOEP的轉(zhuǎn)化速率則會根據(jù)TBOEP的濃度發(fā)生改變[12]。本研究發(fā)現(xiàn)染毒初期大鼠體內(nèi)BBOEHEP的生成速率非常快，但是相應(yīng)的代謝速度也較快，第2天的大鼠尿樣相比第1天的尿樣的BBOEHEP的排泄率降低了90%以上。這與V?lkel等[9]探究了人體單次口服給藥TBOEP后的毒代動力學(xué)（選取3名男性和女性志愿者單次口服TBOEP），發(fā)現(xiàn)尿液樣品中7 h尿液中BBOEHEP的含量最高，本文與其結(jié)論一致。而BBOEP的濃度在前3 d的大鼠尿樣中都未呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，直到暴露第5天才出現(xiàn)降低。由此來看，BBOEP在大鼠體內(nèi)不僅生成速率較慢，還會受到TBOEP濃度的影響，但是排出體外的速度也相對較慢。由圖2可知。尿液內(nèi)母體物質(zhì)TBOEP和代謝產(chǎn)物BBOEHEP呈現(xiàn)了一定程度同步的峰谷趨勢，出現(xiàn)了較為統(tǒng)一的變化趨勢?？赡苁怯捎贐BOEHEP作為TBOEP較為主要的代謝產(chǎn)物和TBOEP存在著最高的相關(guān)性，當(dāng)某一組織內(nèi)TBOEP濃度高時，產(chǎn)生的BBOEHEP也較多，而這些母體化合物和代謝產(chǎn)物被同時排出，因此出現(xiàn)這種情況。

2.4 糞便樣品中的排泄情況

大鼠經(jīng)口灌胃750 mg·kg-1TBOEP后，糞便中TBOEP及其代謝物糞便排泄量如圖3所示，糞便排泄率數(shù)據(jù)如圖4所示。由圖3可知，0～168 h，母體化合物糞便排泄量為（65.71±6.5） μg，代謝物BBEOP為（89.13±25.58） μg，BBOEHEP為（5.87±2.25） μg，母體化合物TBOEP主要通過老鼠糞便排泄。大鼠經(jīng)口染毒168 h后，在糞便中均能檢測到母體化合物TBOEP的存在，且在0～24 h內(nèi)排泄量最大，在第3天呈現(xiàn)快速下降，說明母體化合物TBOEP在體內(nèi)排泄快。代謝物方面，3-HO-TBOEP在0～24 h的糞便有所檢出之外，其余均未檢出，雖然并不是最主要的代謝產(chǎn)物，卻是重要的代謝路徑。由圖3可知，代謝物BBOEP排泄量的峰值在第2天（24～48 h），達(dá)到（50.98±11.38） μg，代謝物BBOEHEP的排泄量峰值在0～24 h，之后呈下降趨勢，可以看出BBOEP和BBOEHEP在大鼠體內(nèi)生成的速率較快。

圖3 不同時間段TBOEP及其代謝物糞便排泄量Fig. 3 Fecal excretion of TBOEP and its metabolites at different time periods

圖4 大鼠灌胃750 mg·kg-1 TBOEP后糞便中TBOEP及其代謝物排泄率Fig. 4 The excretion rate of TBOEP and its metabolites in the feces of rats after intragastric administration of 750 mg·kg-1 TBOEP

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，168 h內(nèi)TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP的糞便累積排泄率分別為0.4221%、0.3931%和0.0434%。與尿液排泄不同的是，染毒初期糞便中BBOEP的生成速率較快，0～24 h的排泄率遠(yuǎn)高于BBOEHP。由圖4可知，與尿液一樣，糞便中BBOEP排泄率的峰谷與母體化合物TBOEP相比，有一定的滯后性，可能是由于TBOEP在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)換為BBOEP需要一定的轉(zhuǎn)化時間，導(dǎo)致排出體外的時間較慢。此外，與尿液一致，尿液內(nèi)母體物質(zhì)TBOEP和代謝產(chǎn)物BBOEHEP出現(xiàn)了較為統(tǒng)一的變化趨勢。

3 討論（Discussion）

本試驗(yàn)建立了大鼠糞便、尿液中TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP、3-OH-TBOEP的LC-MS/MS測定方法。TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP、3-OH-TBOEP在2～500 μg·L-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r>0.99），回收率范圍在65%～126%之間。方法的選擇性、殘留、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)和樣品穩(wěn)定性等均符合生物樣品分析要求，表明本方法適合于糞便、尿液中TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP、3-OH-TBOEP的分析。

本研究表明，除代謝物3-OH-TBOEP僅在糞便樣品中0～24 h時間段檢出外，TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP均在尿液和糞便樣品中有較高檢出。大鼠經(jīng)口灌胃單次染毒750 mg·kg-1TBOEP后，0～168 h，母體化合物尿液排泄量為（3.61±0.92） μg，代謝物BBOEP為（5.88±1.41） μg，BBOEHEP為（9.86±1.53） μg，而母體化合物糞便排泄量為（65.71±6.5） μg，代謝物BBOEP為（89.13±25.58） μg，BBOEHEP為（5.87±2.25） μg，代謝物BBOEHEP主要經(jīng)過尿液排泄。染毒后168 h內(nèi)，TBOEP尿液和糞便累積排泄率為0.004%、0.422%。BBOEP尿液和糞便累積排泄率為0.007%、0.3931%。BBOEHEP尿液和糞便累積排泄率為0.011%、0.0434%。在0～168 h內(nèi)，TBOEP和代謝物BBOEP主要通過糞便排泄，BBOEHEP通過尿液和糞便排泄。根據(jù)尿液和糞便中TBOEP及其代謝物的不同時間點(diǎn)的排泄量分布，BBOEP和BBOEHEP在TBOEP的代謝物中生成量明顯多于3-HO-TBOEP。由此推測，BBOEP和BBOEHEP是TBOEP在大鼠體內(nèi)主要的代謝產(chǎn)物。TBOEP在大鼠體內(nèi)僅有極少部分轉(zhuǎn)化成了3-HO-TBOEP，除了尿液和糞便排泄外可能存在其他的生物轉(zhuǎn)化途徑。該結(jié)果對TBOEP尿液和糞便的排泄規(guī)律研究有一定意義，可為闡明TBOEP體內(nèi)的代謝過程提供一定依據(jù)。