劉麗梅，王家欣，姚琳琳，汪銘卉，劉墨袆，夏 薇

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

乳腺癌是威脅女性身心健康的常見腫瘤.研究[1]發(fā)現(xiàn)：乳腺癌發(fā)生發(fā)展與多種表觀遺傳修飾有關(guān)，包括DNA異常甲基化、組蛋白修飾以及miRNA，這些表觀遺傳修飾又會(huì)相互影響，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜多變的調(diào)控網(wǎng)絡(luò).已有研究[2]發(fā)現(xiàn)：多種腫瘤中miRNA的表達(dá)會(huì)受到上游啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的調(diào)節(jié)作用，因此，DNA甲基化水平改變可影響相關(guān)miRNA的表達(dá)，而DNA甲基化又受DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)與DNA去甲基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控.由于miRNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用，同樣，miRNA也會(huì)影響DNMTs的表達(dá)，從而影響DNA的甲基化水平，因此，miRNA與DNA甲基化是相互影響的.本課題組前期研究[3]也發(fā)現(xiàn)，miRNA可以使乳腺癌患者DNMT3a的表達(dá)發(fā)生改變，同時(shí)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a對(duì)相應(yīng)miRNA也有調(diào)控作用[4].這提示我們，多種miRNA的表達(dá)有可能具有相關(guān)性，因此，本研究主要探討乳腺癌患者血清中miR-29c與miR-200a表達(dá)的相關(guān)性及其機(jī)制，此研究可為乳腺癌患者的診斷和預(yù)后判定及靶向治療提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液(HyClone公司，美國)；HiPerFect Transfection Reagent(QIAGEN公司，德國)；熒光定量PCR試劑、總RNA提取試劑盒(TaKaRa公司，日本)；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Clontech公司，美國)；血清miRNA提取試劑盒(QIAGEN公司，德國)；亞硫酸氫鹽處理試劑盒(Zymo公司，美國)；5-Aza-Cdr(Sigma公司，德國)；Tag HS酶(Takara公司，日本).

1.2 方 法

1.2.1 病例收集

選取2019年1月—2020年12月吉林市中心醫(yī)院乳腺外科乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者30例，另外30名正常體檢者作為正常對(duì)照組.所有人群均在知情同意情況下由吉林市中心醫(yī)院乳腺外科醫(yī)生收集研究對(duì)象的臨床資料.采集研究對(duì)象的外周血，2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，3 000 r/min離心5 min，吸取上清，置于潔凈的1.5 mL EP管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理

5-Aza-Cdr是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能夠抑制DNA甲基化過程，從而導(dǎo)致細(xì)胞處于低甲基化狀態(tài).使用前將5-Aza-Cdr干粉用10 μL DMSO溶解，再用完全培養(yǎng)基(10%FBS+90%DMEM)稀釋至工作濃度為5 μmol/L，備用.將處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞用胰蛋白酶消化，再用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于24孔板中；每孔加入1 mL，過夜貼壁后，培養(yǎng)液中加入5-Aza-Cdr(終濃度為5 μmol/L)，由于5-Aza-Cdr在水溶液中不穩(wěn)定，需要每24 h更換新配制的培養(yǎng)液，培養(yǎng)96 h后提取各組細(xì)胞的RNA與DNA，置于-80 ℃冰箱保存待用.

1.2.3 miR-29c模擬體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成帶有FAM標(biāo)記的單鏈miR-29c模擬體及其陰性對(duì)照.miR-29c模擬體：5′-UAGCACCAUUUGAAAUC GGUUA-3′；陰性對(duì)照：5′-UUGUACUACACACAAA AGUACUG-3′.將胰蛋白酶消化MCF-7細(xì)胞(調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/mL)接種于24孔板中，每孔加入1 mL，貼壁后，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋80 ng miR-29c模擬體及其陰性對(duì)照，再各加入3 μL轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜止10 min；將miR-29c模擬體的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加MCF-7細(xì)胞中，輕輕搖勻；轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染96 h后提取細(xì)胞RNA與DNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.4 血清與細(xì)胞RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

應(yīng)用血清miRNA提取試劑盒提取乳腺癌患者血清miRNA，細(xì)胞與組織RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，提取到的RNA采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，分裝后置于-80 ℃凍存.

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系：SYBN Premix ExTaqⅡ(2×)10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，通用引物(10 μmol/L)0.5 μL，模板(cDNA溶液)1 μL，ddH2O 8 μL.反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性7 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，進(jìn)行熒光信號(hào)采集，之后加做溶解曲線程序，引物序列見表1.

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.6 miR-200a基因啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增、載體連接與測序

使用血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取5-Aza-dc處理細(xì)胞組、陰性對(duì)照組、miR29c轉(zhuǎn)染組細(xì)胞基因組DNA，使用DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒對(duì)上述3組DNA樣品進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌患者血清miR-29c與miR-200a表達(dá)相關(guān)性分析

應(yīng)用相對(duì)熒光定量法檢測血清樣本中miR-29c與miR-200a相對(duì)于U6的表達(dá)量，采用Pearson法分析二者間的相關(guān)性.結(jié)果可見，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者血清中miR-29c與miR-200a的相對(duì)表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.63，P<0.01)，且二者之間的表達(dá)有明顯相關(guān)性.見圖1.

圖1乳腺癌患者血清miR-29c與miR-200a表達(dá) 的相關(guān)性分析Fig.1Correlation of miR-29c and miR-200a expression in the serum of the patients with breast cancer

2.2 miR-29c模擬體轉(zhuǎn)染后miRNA表達(dá)情況

MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c模擬體后，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-29c與miR-200a表達(dá)的變化.結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照相比，miR-29c與miR-200a的相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，提示miR-29c轉(zhuǎn)染成功，miR-29c的轉(zhuǎn)染使miR-200a的表達(dá)顯著增加.見表1.

表1 miR-29c 模擬體轉(zhuǎn)染后miR-29c與miR-200a的相對(duì)表達(dá)量

2.3 甲基化水平分析

將陰性對(duì)照組、5-Aza-Cdr處理組、miR-29C模擬體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞DNA分別經(jīng)重亞硫酸鹽處理后進(jìn)行miR-200a啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增，其甲基化水平檢測結(jié)果可見：陰性對(duì)照組的甲基化水平為77.5%，而miR-29c 模擬體轉(zhuǎn)染組甲基化水平為52.5%，其甲基化水平顯著降低，接近甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-Cdr處理組的甲基化水平(48.3%).同時(shí)進(jìn)行各CG位點(diǎn)的甲基化水平比較，結(jié)果可見：miR-29模擬體明顯降低miR-200a啟動(dòng)子區(qū)各CG位點(diǎn)的甲基化水平(P<0.05).

圖2miR-200a啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分析Fig.2Analysis of the methylation level of miR-200a promoter

3 討 論

有研究[1]發(fā)現(xiàn)：與腫瘤相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)的表觀遺傳學(xué)改變有DNA甲基化、組蛋白修飾等多種表觀遺傳修飾.一項(xiàng)關(guān)于miRNAs基因序列的擴(kuò)展性研究[6]發(fā)現(xiàn)：約一半的miRNAs與CpG島甲基化水平相關(guān)，因此，DNA甲基化改變能夠影響miRNA的表達(dá).此外，已發(fā)現(xiàn)用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[7]、組蛋白脫乙酰酶抑制劑[8]處理細(xì)胞后，一些miRNAs出現(xiàn)表達(dá)上調(diào).本課題組前期實(shí)驗(yàn)[3]發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理乳腺癌細(xì)胞時(shí)，miR-29c、miR-200a均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，同時(shí)考慮到miR-29c對(duì)于DNMT3a的影響，推測二者的表達(dá)可能存在相關(guān)性，因此，本研究檢測了乳腺導(dǎo)管癌患者miR-29c、miR-200a的表達(dá)變化及其相關(guān)性，并通過轉(zhuǎn)染的方式將miR-29c模擬體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，考察其對(duì)miR-200a表達(dá)的影響，進(jìn)一步從DNA甲基化變化方面探究其機(jī)制.

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乳腺癌患者血清中miR-29c、miR-200a表達(dá)量變化之間具有正相關(guān)性關(guān)系，即miR-29c與miR-200a的表達(dá)具有趨同性.已知，miRNAs的表達(dá)具有獨(dú)特的時(shí)空特異性和組織特異性，因此，研究miRNAs表達(dá)的相關(guān)性對(duì)于腫瘤的檢測具有重要意義.有研究[9]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，miRNAs的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常，其血清游離miRNAs對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移均具有重要的診斷意義.XIE P等[10]在膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-29c、miR-200a的表達(dá)也具有一致性.而DI Ziyangi等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，包括miR-29c及miR-200a的9種miRNAs可作為結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物，但二者之間的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這種差異可能是不同組織的差異所造成的.為探究這種變化出現(xiàn)的原因，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了miR-29c的模擬體，將其轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，結(jié)果觀察miR-200a的表達(dá)顯著上調(diào)，其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平也相應(yīng)下調(diào)，提示miR-29c的上調(diào)能夠降低miR-200a啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，從而使其表達(dá)增高.究其原因可能是miR-29c對(duì)于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響所致，研究[12]發(fā)現(xiàn)：miR-29可作用于DNMT3a和DNMT3b的3′端非編碼區(qū)，從而影響DNMT3a與DNMT3b的轉(zhuǎn)錄后翻譯，其異常表達(dá)可導(dǎo)致總體DNA低甲基化，也導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)異常.AURE M R等[13]的研究還發(fā)現(xiàn)，在雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞中miR-29c的表達(dá)與DNMT3a的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這在很大程度上會(huì)影響CpG島的甲基化水平，從而改變相關(guān)基因的表達(dá).

綜上所述，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者血清中miR-29c的相對(duì)表達(dá)量與miR-200a存在相關(guān)性，miR-29c能夠通過改變miR-200a啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平而影響其表達(dá)，但其改變是否會(huì)影響其他miRNAs的表達(dá)還有待進(jìn)一步確認(rèn).