孫靖輝，林 豪，王 闊，曾欽成，李 賀，王春梅，陳建光

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

代謝相關(guān)脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)作為一種與肥胖、高血脂及代謝綜合征密切相關(guān)的慢性疾病，已成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題[1].然而，目前尚無藥物被批準(zhǔn)直接用于MAFLD的治療，臨床上主要是通過減少M(fèi)AFLD相關(guān)的危險因素來達(dá)到治療目的.中藥治療MAFLD具有獨(dú)特的優(yōu)勢，研究[2]表明，中醫(yī)藥能有效改善胰島素抵抗，降低肝臟脂質(zhì)沉積和減輕肝臟炎癥.

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)，作為我國代表性補(bǔ)益類藥物已應(yīng)用2000余年[3].五味子的有效活性成分包括木脂素、多糖和揮發(fā)油等，其中木脂素(Schisandrachinensislignans，SCL)是五味子主要的活性成分，有治療肝損傷、慢性咳嗽、平喘、鎮(zhèn)靜、抗衰老及神經(jīng)保護(hù)等功效[4-6].然而，對于五味子治療MAFLD的具體成分尚不明確，其肝臟保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明.

如果運(yùn)用傳統(tǒng)的研究手段篩選五味子治療MAFLD的有效成分，實(shí)驗(yàn)樣本量巨大，研究周期較長，也很難在MAFLD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中確定五味子的潛在作用靶點(diǎn).根據(jù)SCL在大鼠體內(nèi)的分布[7]顯示，在肝臟中檢測出12種SCL原型成分，如戈米辛J、五味子醇乙、五味子酚等.因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選肝臟中12種SCL原型成分治療MAFLD的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)，再通過分子對接技術(shù)模擬核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合情況預(yù)測五味子治療MAFLD的作用靶點(diǎn)及機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 成分靶點(diǎn)預(yù)測

表1 口服五味子總木脂素后在肝臟中檢測到的12種SCL

1.1.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測

1.1.3 治療MAFLD的作用靶點(diǎn)篩選及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

1.1.4 成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及富集分析

1.2 分子對接驗(yàn)證

2 結(jié) 果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的靶點(diǎn)篩選和富集分析

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，將得到的靶點(diǎn)進(jìn)行合并，除去重復(fù)項(xiàng)，最終得到與12種SCL原型成分相關(guān)的1361個靶點(diǎn).通過MAFLD的靶點(diǎn)篩查后，得到相關(guān)靶點(diǎn)627個，其中，五味子木脂素和MAFLD交集靶點(diǎn)共226個(見圖1).

圖1五味子與MAFLD的韋恩圖Fig.1Venn diagram of potential target of Schi- sandra chinensis and treating MAFLD

將226個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到String網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)建交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型(見圖2).圖中共有222個節(jié)點(diǎn)、4636條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為41.8.圖3為根據(jù)度值排名構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因直方圖，結(jié)果提示，Akt1和PPAR-γ可能是五味子治療MAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn).

圖2交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2Protein-protein interaction network of intersection target

圖3PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因Fig.3Histogram of core genes in PPI network

圖4為成分與交集靶點(diǎn)之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)合成分靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果，提示五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J和當(dāng)歸酰戈米辛H是與Akt1較為密切的活性化合物；五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J是與PPAR-γ較為密切的活性化合物，并在接下來的分子對接實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證.

圖4成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.4Component-intersection target network

在GO富集分析中，共獲取99個GO條目，其中生物過程(BP)條目42個(主要包括對脂蛋白顆粒的反應(yīng)、細(xì)胞對脂蛋白顆粒刺激的反應(yīng)、脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)等)，細(xì)胞組成(CC)條目17個(主要包括睫狀基體、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等)，分子功能(MF)條目40個(主要包括蛋白磷酸酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、DNA結(jié)合域等)(見圖5).在KEGG富集中，共獲得40條通路，主要涉及長壽調(diào)節(jié)途徑、AMPK信號通路、破骨細(xì)胞分化、癌癥通路等.最后將P值較小的前5個GO條目和前10個KEGG通路進(jìn)行可視化分析(見圖6).

MF.分子功能；CC.細(xì)胞組成；BP.生物過程.圖5五味子活性成分治療咳嗽的GO富集分析Fig.5GO enrichment analysis of active components of Schisandra chinensis in treating cough

圖6關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析Fig.6KEGG pathways enrichment analysis of key targets

2.2 分子對接模擬結(jié)果

分子對接結(jié)果顯示：Akt1和PPAR-γ與其對應(yīng)成分的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol(見表2)，表明成分與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性[8].然后將成分與靶點(diǎn)的對接結(jié)果在Pymol 1.8中進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖7.以五味子酯乙分別與Akt1和PPAR-γ靶點(diǎn)蛋白對接為例，分析其與受體之間可能存在的作用模式，五味子酯乙與活性位點(diǎn)附近的GLU-198、ASP-292、THR-160氨基酸殘基形成氫鍵結(jié)合到Akt1，與活性位點(diǎn)附近的SER-342氨基酸殘基形成氫鍵結(jié)合到PPAR-γ.

表2 五味子核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對接能量Tab.2 Docking energy between key components of Schisandra chinensis and key targets

圖7與MAFLD相關(guān)的五味子核心木脂素與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接模式Fig.7Molecular docking pattern of key components of Schisandra chinensis and key targets related to MAFLD

3 討 論

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變，MAFLD的發(fā)病率逐年上升，并呈現(xiàn)低齡化趨勢，嚴(yán)重威脅人民的健康[9].肝臟作為機(jī)體物質(zhì)代謝的中樞，主要涉及膽汁分泌、解毒排泄、生物代謝與轉(zhuǎn)化、凝血因子合成及免疫等多種重要的生物過程，其代謝轉(zhuǎn)化與吞噬解毒功能對機(jī)體有重要的保護(hù)作用[10].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要通過保肝、降酶、降脂、調(diào)節(jié)免疫等方法治療MAFLD，但治療效果欠佳，存在停藥反彈現(xiàn)象，且不良反應(yīng)大[11-12].中醫(yī)具有明顯的治療優(yōu)勢，能為患者提供個性化治療方案，有效改善臨床癥狀[13].

在MAFLD的研究中，五味子總木脂素顯示出顯著的治療作用，不但能夠調(diào)節(jié)高脂動物模型的脂質(zhì)代謝紊亂，還可以緩解肝臟炎癥損傷和脂質(zhì)過氧化[14-16]，但具體的活性成分和作用機(jī)制則未能明確.本研究通過TCMSP平臺篩選12種SCL原型成分相關(guān)的1361個靶點(diǎn)，再利用TTD、DisGeNET和 DrugBank數(shù)據(jù)庫收集MAFLD相關(guān)靶點(diǎn)共627個.比對成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)得到226個交集靶點(diǎn)，通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖及拓?fù)浞治鲞M(jìn)一步得到Akt1和PPAR-γ兩個關(guān)鍵靶點(diǎn).成分靶點(diǎn)篩選和成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示五味子酯乙、五味子乙素、五味子甲素、五味子酚、五味子醇乙、戈米辛J和當(dāng)歸酰戈米辛H可能是五味子治療MAFLD的核心成分.分子對接結(jié)果表明，核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間對接緊密，具有較強(qiáng)的親和力.

有研究[17]表明，人體內(nèi)許多基因、分子、信號通路等均與肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān).長壽調(diào)節(jié)途徑和AMPK信號通路是KEGG富集分析篩選得到的與MAFLD密切相關(guān)的信號通路，PI3K-Akt和NF-κB信號通路是其上游因子，而Akt1和PPAR-γ是這些通路中的重要因子.PI3K-Akt信號通路是經(jīng)典的炎癥信號通路，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化、遷移等生理過程，具有促進(jìn)細(xì)胞生存、細(xì)胞自噬及抗凋亡的作用[18].Akt1在肝臟中廣泛表達(dá)，但是肝臟中Akt1的過度抑制也可以誘發(fā)肝臟損傷[19-20].Akt1是AMPK的上游因子，能間接影響AMPK的表達(dá).AMPK是一類重要的蛋白激酶，是細(xì)胞能量傳感器，在葡萄糖及脂肪酸代謝方面都起到了關(guān)鍵的作用.AMPK信號通路與MAFLD、2型糖尿病等代謝性疾病有關(guān)，它能調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸的代謝，ATP缺乏可導(dǎo)致AMPK磷酸化激活，從而能夠降低肝臟細(xì)胞脂肪含量，并減少甘油三酯的形成[21].PPAR-γ主要存在于免疫系統(tǒng)以及脂肪組織，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、胰島素抵抗以及脂肪細(xì)胞分化[22].研究[23]表明，PPAR基因缺失可導(dǎo)致肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪酸在肝臟組織內(nèi)大量堆積，誘導(dǎo)肝臟組織發(fā)生脂肪變性，而PPAR-γ激活能減少大鼠骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)積累及減輕脂肪肝模型小鼠的肝臟脂質(zhì)積累，同時活化的PPAR-γ可以通過抑制NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的活性負(fù)向發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的效應(yīng)[24].在分子對接的驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，五味子核心成分能通過氫鍵緊密地結(jié)合相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，提示五味子可能通過調(diào)控Akt1和PPAR-γ在信號通路中的表達(dá)以及炎癥、脂質(zhì)代謝等多途徑發(fā)揮抗MAFLD的作用.

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法預(yù)測了五味子在肝臟中原型成分治療MAFLD的潛在靶點(diǎn)，探討了五味子可能通過多靶點(diǎn)、多通路來調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，從而發(fā)揮治療作用.本研究還運(yùn)用分子對接技術(shù)驗(yàn)證了核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白Akt1和PPAR-γ之間的結(jié)合活性，為后續(xù)進(jìn)一步深入探究五味子治療MAFLD的藥理機(jī)制以及五味子藥用資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).