婁行行，周萬怡，蘆紅云，陳啟和*

（1 浙江大學食品科學與營養(yǎng)系 杭州 310058 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所 杭州 310021）

黃酒是中國傳統(tǒng)的酒精飲料，一般是由煮熟的糯米經(jīng)酵母（傳統(tǒng)的發(fā)酵劑）發(fā)酵而成，因具有獨特的風味和較高的營養(yǎng)價值而受到消費者的喜愛。隨著經(jīng)濟全球化的發(fā)展，中國黃酒已出口多國。同時，隨著人們生活水平的提高，對中國黃酒的品質(zhì)要求也越來越高。然而，在黃酒發(fā)酵過程中，微生物種類繁多，環(huán)境復雜，會產(chǎn)生一些副反應，形成部分潛在風險化合物，特別是氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）。中國黃酒中的氨基甲酸乙酯含量明顯高于其它酒精飲料（米酒、白酒、葡萄酒、啤酒）[1]。氨基甲酸乙酯又稱脲烷，是發(fā)酵食品和飲料發(fā)酵過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。1940年，EC曾長期被用作抗腫瘤藥，實驗動物的催眠和麻醉劑，以及用于白血病和靜脈曲張的治療[2-3]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)EC 在許多物種包括小鼠、大鼠、倉鼠和猴子等中都具有遺傳毒性和致癌性，對人類也具有潛在的致癌風險[4]。2007年，EC 被國際癌癥研究機構(gòu)列為2A 類致癌物[5]。因黃酒中較高含量的氨基甲酸乙酯可能對消費者的健康產(chǎn)生潛在的安全隱患，故而降低其含量對黃酒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

EC 主要是由乙醇與N-氨甲?；衔镒园l(fā)反應產(chǎn)生的，EC 的形成速率及最終產(chǎn)率取決于氨甲?；D(zhuǎn)移及競爭性受體分子的存在與否[6]。目前已鑒定出的EC 前體物至少有5 種，即尿素、瓜氨酸、氰、氨甲酰磷酸和焦碳酸二乙酯[7]。在釀造酒中形成EC 的主要前體物質(zhì)為尿素、瓜氨酸和氨甲酰磷酸。尿素是黃酒中最主要的EC 前體物，其中的EC 有90%是尿素與乙醇反應產(chǎn)生的[8]。黃酒中的尿素主要來源于發(fā)酵原料本身和發(fā)酵過程中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae）精氨酸代謝產(chǎn)生，并分泌到胞外（圖1a），而過量使用氮肥也會增加原料中尿素濃度[9]。瓜氨酸是酵母和乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）精氨酸代謝的中間產(chǎn)物（圖1），主要通過發(fā)酵后期LAB 的乳酸發(fā)酵（Malolactic fermentation，MLF）產(chǎn)生，是EC的另一重要前體物質(zhì)。研究表明，發(fā)酵酒經(jīng)MLF發(fā)酵后EC 含量升高[10-11]，在葡萄酒中由瓜氨酸生成的EC 含量幾乎和尿素相同[12]。釀酒酵母中瓜氨酸可被精氨琥珀酸合成酶（ARG1 基因）降解[13]。研究表明，氨甲酰磷酸也能與乙醇反應形成EC。氨甲酰磷酸是酵母代謝產(chǎn)生的ATP、CO2和胺在氨甲酰磷酸合成酶作用下產(chǎn)生的[14]，然而，其合成途徑受發(fā)酵后期氮代謝抑制的調(diào)控，因此黃酒中的含量相對較少，能形成的EC 有限。為促進黃酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，多年來許多研究者致力于探究黃酒中EC 的控制方法。本文首先總結(jié)EC 主要前體物的代謝調(diào)控機制，然后，闡述通過調(diào)控EC 形成途徑來消減EC 的常用方法。

圖1 （a）釀酒酵母細胞中精氨酸代謝；（b） LAB 細胞中精氨酸代謝過程Fig.1 （a） Metabolism of arginine in S.cerevisiae；（b） Metabolism pathway of arginine in LAB

1 EC 形成主要前體物的代謝調(diào)控機制

1.1 尿素的代謝調(diào)控機制

釀酒酵母細胞內(nèi)的精氨酸在精氨酸酶（CAR1基因）的作用下降解產(chǎn)生尿素和鳥氨酸，鳥氨酸在鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（CAR2 基因）的作用下進一步分解[13]。胞內(nèi)的尿素在由尿素酰胺化酶（DUR1，2基因） 激活的尿素羧化酶和脲基甲酸鹽水解酶作用下水解成NH3和CO2[7]。酵母細胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的尿素一部分被降解，還有一部分被分泌到胞外，其分泌和重吸收是一個復雜的系統(tǒng)[15]。尿素的重吸收作用因其濃度不同而分為2 種途徑，當胞外尿素濃度大于0.5 mmol/L 時，尿素通過促擴散系統(tǒng)（DUR4 基因）進入細胞，無需能量參與；低濃度條件下 （Km=14 μmol/L），尿素通過主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（DUR3 基因）重吸收[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，DUR1，2 和DUR3 的表達受DAL81 和DAL82 兩個GATA 家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[17]。尿素的產(chǎn)生、外排以及重吸收受發(fā)酵原料成分、酵母菌株和釀造條件的影響[18]。精氨酸利用率高的菌株能產(chǎn)生更多的尿素；精氨酸濃度高會抑制尿素的重吸收作用；發(fā)酵液中的乙醇含量會抑制酵母生長及代謝物運輸，高乙醇含量會抑制精氨酸代謝而減少尿素的產(chǎn)生和分泌、外排[15]。

1.2 瓜氨酸的代謝調(diào)控機制

LAB 菌通過精氨酸脫亞胺基酶途徑（Arginine deiminase pathway，ADI）降解精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸[19]，如圖2所示。LAB 細胞內(nèi)瓜氨酸合成和分解代謝動態(tài)失衡導致瓜氨酸分泌到胞外生成EC。當精氨酸在精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，ADIase）作用下降解產(chǎn)生瓜氨酸（反應1）的反應速率大于瓜氨酸在鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（Ornithine transcarbamylase，OTCase） 作用下降解產(chǎn)生鳥氨酸和氨甲酰-P（反應2）時，瓜氨酸就被分泌出細胞外[20]。當精氨酸降解產(chǎn)生的ATP（反應3）超過細胞生長所需能量時，ATP 將介導抑制OTCase 的活性，使胞內(nèi)瓜氨酸濃度升高而被分泌到細胞外[20]。也有少數(shù)菌株在精氨酸耗盡后重吸收再利用胞外的瓜氨酸[21]。

圖2 精氨酸脫亞胺基酶途徑Fig.2 The arginine deiminase （ADI） pathway

1.3 釀酒酵母中精氨酸的代謝調(diào)控機制

釀酒酵母細胞通過基本氨基酸透性酶（ALP1和CAN1 基因）和通用性氨基酸透性酶（GAP1 基因）吸收精氨酸轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中，Can1p 和Alp1p 的過表達可以提高精氨酸的吸收效率[22]。胞質(zhì)精氨酸進一步被液泡堿性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白Vba2p（VBA2 基因）轉(zhuǎn)移到液泡中作為氮源儲備[22]。

為了保障所有細胞能有效合成蛋白質(zhì)，細胞溶質(zhì)的氨基酸濃度必須保持在相對恒定的水平，釀酒酵母中氨基酸穩(wěn)態(tài)除了從外部環(huán)境攝取和生物合成氨基酸來維持以外，還可以通過液泡氨基酸區(qū)室化來維持[23]。氮饑餓時液泡氨基酸迅速從液泡中輸出到細胞質(zhì)循環(huán)用于蛋白質(zhì)的從頭合成[24-25]。釀酒酵母中堿性氨基酸，如賴氨酸、組氨酸和精氨酸在液泡中高度濃縮，約70%～90%的堿性氨基酸積累在液泡中，而90%的酸性氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸都在細胞質(zhì)中[26]。胞內(nèi)氨基酸的分布差異表明液泡上存在氨基酸的選擇性操作機制，這可能與液泡膜上存在氨基酸底物特異性主動轉(zhuǎn)運蛋白有關(guān)。目前，已經(jīng)鑒定并表征的涉及液泡氨基酸區(qū)室化的幾個關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白家族包括氨基酸/生長素通透家族（AAAP）和主要易化超家族（MFS），以上轉(zhuǎn)運蛋白家族的發(fā)現(xiàn)使得從分子水平上評估液泡區(qū)室化氨基酸對胞質(zhì)中氨基酸穩(wěn)態(tài)的重要性成為可能，如表1所示[26-31]。

表1 釀酒酵母中液泡氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白及其分子功能Table 1 The transporters of vacuolar amino acids and its molecular function in S.cerevisiae

基于已有報道，VBA 家族轉(zhuǎn)運蛋白（Vba1p，Vba2p 和Vba3p） 被鑒定是參與堿性氨基酸吸收的液泡轉(zhuǎn)運蛋白[31]。Shimazu 等[31]利用釀酒酵母VBA 基因缺失突變株進行液泡膜囊泡實驗，發(fā)現(xiàn)液泡Vba1p 和Vba3p 參與了組氨酸和賴氨酸的轉(zhuǎn)運吸收，而Vba2p 參與了精氨酸、組氨酸和賴氨酸的轉(zhuǎn)運吸收，且所有這些轉(zhuǎn)運蛋白都屬于質(zhì)子/氨基酸反轉(zhuǎn)運蛋白，是由液泡質(zhì)子ATP 酶作用產(chǎn)生的質(zhì)子形成電化學梯度驅(qū)動的主動轉(zhuǎn)運。

2 EC 形成的調(diào)控途徑與方法

2.1 優(yōu)化生產(chǎn)工藝

黃酒中EC 前體物部分來源于生產(chǎn)黃酒的加工原料，糯米、輔料和水中含有精氨酸、尿素和瓜氨酸，尤其是糯米。因此可以通過精煉原料減少其中的精氨酸和尿素含量來降低EC 含量，然而精煉原料會導致原料中大量營養(yǎng)物質(zhì)的流失，影響黃酒風味，因此不適用于黃酒的實際生產(chǎn)釀造。而由于過量使用氮肥也會增加原料中尿素濃度[9]，因此在種植原料時，可以避免使用過多的尿素、氨和其它氮肥。發(fā)酵條件，如原料的添加量、溫度、光照、pH、氧、儲存時間、菌株種類、接種量、乙醇濃度和蒸餾方法，都能影響發(fā)酵過程中黃酒中尿素的量從而影響EC 的形成[32]。黃酒在裝壇前需進行高溫煎酒，以殺滅各種微生物，而由于尿素與乙醇生成EC 的反應強度與溫度、反應時間呈正相關(guān)關(guān)系，因此往往會導致煎酒后EC 含量大幅上升。為了減少EC 生成可以適當降低煎酒溫度和/或縮短煎酒時間。然而溫度的降低或者縮短時間可能會導致殺菌不徹底，給黃酒帶來生物穩(wěn)定性風險[33]。

2.2 添加外源酶活小分子抑制劑

2.2.1 外源添加脲酶 黃酒釀造過程中通過酵母和乳酸菌等不斷代謝產(chǎn)生EC 前體物，主要為尿素，黃酒中通過尿素產(chǎn)生的EC 含量約占90%。因此減少尿素的含量可以有效降低EC 含量。脲酶（EC 3.5.1.5）又稱尿素酰胺水解酶，可以將尿素水解為氨和氨基甲酸酯，后者自發(fā)水解產(chǎn)生另一分子氨和碳酸。根據(jù)脲酶最適作用pH 的不同，脲酶被分為酸性脲酶、中性脲酶及堿性脲酶。由于酒精飲品如葡萄酒、白酒以及黃酒中含有乙醇和具有低pH 值的特性，因此所選擇的脲酶在低pH 值（pH 4.0～6.0）范圍內(nèi)應具有催化活性，并要對乙醇具有一定的耐受能力（＜20%）[34]，酸性脲酶因其能在酸性條件下發(fā)揮作用而引起了人們的興趣。在美國食品和藥物管理局（FDA）推薦的幾種降低氨基甲酸乙酯含量的預防措施中，添加酸性脲酶就是其中一種最方便的方法[35]。

已經(jīng)有研究證明將酸性脲酶應用于黃酒去除尿素是可行的。Yang 等[34]從腸桿菌R-SYB082 中分離得到一種新型酸性脲酶并將其應用到黃酒中去除尿素，將兩種不同的黃酒與酶（0.08 U/mL）在35 ℃下孵育7 d 時，尿素分解率超過85%。為了降低酶促加工成本，通過對初始葡萄糖濃度等條件的優(yōu)化，可以將來自腸桿菌R-SYB082 的酸性脲酶的酶活從1 100 U/L 提高到2 504 U/L[36]。來自于羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）CICC6124 的酸性脲酶在黃酒模型體系中具有良好的尿素清除性能，50 U/L 的酶在20 ℃下孵育60 h，可除去黃酒中約95.8%的尿素[37]。酸性脲酶在應用過程中也受多方面的因素限制，包括酒的品種、抑制因子（酚類化合物等）的濃度及其實際應用條件。將酸性脲酶固定化可以促進酶的循環(huán)利用，具有降低成本，提高穩(wěn)定性，提高對抑制因子抵抗力的優(yōu)勢[38]。Yang 等[39]將酸性脲酶固定在氧化石墨烯/殼聚糖微球上得到氧化石墨烯/殼聚糖脲酶珠，其在使用10 次后仍保留90%的原始活性，顯示出優(yōu)異的重復使用性，并且它具有較高的熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。在對脲酶進行固定化時，對選用的載體有較高要求，必須具備無毒、生物兼容性好、對蛋白黏附度高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、再生性好、易制備、費用低等特點。因此尋找安全有效，成本較低的固定化酶載體有助于酸性脲酶在黃酒大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵中應用。

2.2.2 外源添加小分子抑制劑 近年來，一些酚類化合物如沒食子酸、原兒茶酸等被發(fā)現(xiàn)對黃酒發(fā)酵過程中EC 的形成具有一定的抑制作用，是一種天然的小分子抑制劑。Alberto 等[40]研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸和原兒茶酸可以通過抑制ADI 途徑來減少精氨酸的降解，從而調(diào)控EC 前體物的產(chǎn)生，減少葡萄酒中EC 的形成。與此同時，也有研究指出當使用釀酒酵母作為發(fā)酵劑進行黃酒發(fā)酵時，在發(fā)酵第3 天添加沒食子酸和原兒茶酸可以調(diào)節(jié)EC 分解代謝。沒食子酸和原兒茶酸主要通過抑制精氨酸脫亞胺酶來減少精氨酸消耗，從而降低EC的含量，并且添加的沒食子酸和原兒茶酸對氨基酸和揮發(fā)性風味化合物的產(chǎn)生以及釀酒酵母的生長幾乎沒有影響[41]。除了研究單一的酚類化合物對黃酒發(fā)酵過程中EC 含量的影響，一些含有豐富的酚類化合物的天然植物提取物也被研究。竹葉提取物含有包括沒食子酸、原兒茶酸在內(nèi)的多種酚酸，是一種新型的天然植物提取物。Zhou 等[42]研究了竹葉提取物在使用3 種不同發(fā)酵劑（釀酒酵母、釀酒酵母和短乳桿菌以及中國酒藥）釀造的中國黃酒中對EC 形成的影響。結(jié)果表明，竹葉提取物可以通過抑制尿素/瓜氨酸與乙醇的反應，對多菌發(fā)酵黃酒中的EC 具有顯著的抑制作用。同時竹葉提取物可以顯著上調(diào)釀酒酵母 （S.cerevisiae）中液泡中精氨酸攝取基因（VBA2 基因）的表達，從而抑制精氨酸代謝。此外，竹葉提取物具有抗氧化、抗腫瘤等多種生物學功能[43]，添加到黃酒中可以提高黃酒的整體質(zhì)量。外源添加一些食源性酚酸類物質(zhì)（沒食子酸、原兒茶酸和竹葉提取物等）可以抑制黃酒中EC 的形成，然而將其應用到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)低含量EC 的黃酒中，還需要進一步的研究。也有研究表明外源添加L-鳥氨酸鹽可以抑制黃酒發(fā)酵過程中EC 形成，主要通過底物抑制原理激發(fā)OTCase 酶活來促進瓜氨酸代謝[44]。盡管如此，目前通過外源添加安全的小分子抑制劑來體外抑制黃酒釀造過程中EC 形成的研究還不是很多，值得更進一步探索。

2.3 基因工程改造選育優(yōu)勢發(fā)酵菌株

目前，利用基因工程手段主要通過構(gòu)建低產(chǎn)尿素酵母或者尿素降解量高的酵母來實現(xiàn)對EC的調(diào)控。低產(chǎn)尿素酵母的構(gòu)建是將釀酒酵母細胞內(nèi)的精氨酸酶（CAR1 基因）敲除或者沉默來實現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)敲除CAR1 基因后可以顯著降低發(fā)酵酒中EC 含量，并且不會影響釀酒酵母的發(fā)酵性能[45]。同時，隨著基因編輯技術(shù)的進步，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)來完全刪除CAR1 基因或在CAR1 基因座中引入無義突變來滅活酵母CAR1基因，通過這些改造得到的工程酵母菌株的精氨酸酶比活性降低了98%。與親本酵母菌株相比，在發(fā)酵過程中CAR1 滅活的突變體形成的EC 和尿素較少，而乙醇發(fā)酵性能變化不大[46]。值得注意的是，CRISPR/Cas9 技術(shù)去除CAR1 基因時，不會在基因附近留下任何殘留的基因組序列，可以最大限度地減少使用傳統(tǒng)隨機突變時發(fā)生的不需要的突變[46]。酵母尿素循環(huán)途徑中的尿素羧化酶和脲基甲酸鹽水解酶由同一個DUR1，2 基因編碼，尿素通過DUR3 基因編碼的主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)被重吸收再利用，因此可以通過增強DUR1，2 和DUR3 基因的表達來增強尿素降解及吸收，減少尿素分泌，從而減少發(fā)酵過程中EC 含量。在實際發(fā)酵過程中，由于更優(yōu)質(zhì)氮源精氨酸的存在，尿素在胞內(nèi)的降解及重吸收被抑制[15]，通過將DUR1，2 基因構(gòu)建到特殊基因盒子受強啟動子PGK1 的調(diào)控，得到持續(xù)高效表達后，發(fā)酵液中EC 含量降低了89.1%[47]。單獨過表達DUR3，同時過表達DUR1，2 和DUR3基因的研究表明，DUR3 對抑制EC 效果不顯著，且過表達DUR1，2 和DUR3 基因，對EC 的抑制效果沒有協(xié)同增效作用[48]。

同時，也有學者對GATA 家族轉(zhuǎn)錄因子進行研究，因為氮代謝阻遏效應（NCR）相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平受4 個GATA 家族轉(zhuǎn)錄因子——GLN3、GZF3、GAT1、DAL80 和1 個全局調(diào)控蛋白Ure2p的調(diào)控作用。而不同氮源被利用的優(yōu)先性會受到NCR 的調(diào)控。如果利用其調(diào)控機制，對釀酒酵母使用基因工程手段進行有目的地改造，使其對尿素的利用優(yōu)先性提高，就能減少EC 前體物質(zhì)尿素的積累，這是控制黃酒中EC 含量的一個較新的思路[14]。焦志華[49]發(fā)現(xiàn)將釀酒酵母BY4741 中的DAL80 基因敲除后置于低氮和高氮條件下培養(yǎng)，其脲酶的酶活均較高，發(fā)酵液中尿素濃度均較低，說明DAL80 的敲除能夠使得脲酶活性不受發(fā)酵原料中氮源優(yōu)劣的影響。試驗結(jié)果還表明，DAL80能夠提高GAP1、DUR1，2、DUR3 的轉(zhuǎn)錄水平，且敲除DAL80 對酵母的生長無影響。而將DAL80敲除菌完全替代酒藥用以黃酒發(fā)酵，EC 含量降低38.5%。

3 結(jié)論

目前，圍繞中國傳統(tǒng)發(fā)酵黃酒，尿素和瓜氨酸由于可以直接與乙醇反應生成氨基甲酸乙酯被認為是直接前體物，而精氨酸是間接前體物。本文介紹了釀酒酵母細胞中精氨酸及尿素的代謝調(diào)控機制和乳酸菌細胞中瓜氨酸的代謝調(diào)控機，并且從EC 形成的調(diào)控途徑方面綜述了黃酒發(fā)酵過程中控制EC 產(chǎn)生的方法。而現(xiàn)階段探索的方法雖然能有效地降低黃酒中氨基甲酸乙酯的含量，但是基本處于研究階段，很少能擴大規(guī)模應用于實際工業(yè)生產(chǎn)中。因此，在未來還要進一步探索出安全、有效、成本低廉，適于產(chǎn)業(yè)化、可降低黃酒中氨基甲酸乙酯的方法。