肖甜甜，干昭波，吳君海，馮子娟，邱樹毅，吳鑫穎*

（1 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院 貴陽 550025 2 貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室 貴陽 550025 3 山東百龍創(chuàng)園生物科技股份有限公司 山東德州 253000）

酸湯是我國貴州省黔東南苗族侗族自治州的一種傳統(tǒng)自然發(fā)酵調(diào)味品，是貴州最具代表性的，有著近千年歷史的“酸食”之一。酸湯品種根據(jù)原料、地域、色澤、風(fēng)味等來劃分，主要以米酸湯和紅酸湯為主[1]。米酸湯多以糯米為原料，按比例添加母液（上一次發(fā)酵成熟的酸湯液）或在自然條件下室溫封閉發(fā)酵3～5 d，即可得到具有獨特發(fā)酵風(fēng)味的酸湯，可配制成飲品，也可作為調(diào)料制作佳肴。酸湯味型獨特，酸味適宜，清香爽口，能健脾開胃，生津止渴[2]，具有調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡的益生菌群，能增進人體健康和預(yù)防消化道疾病[3-4]。酸湯因獨特滋味和保健功能而受到消費者的喜愛。

為弄清對酸湯酸鮮爽口的滋味和風(fēng)味起關(guān)鍵作用的物質(zhì)，文獻報道主要以氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)（HPLC）等技術(shù)，測定酸湯中的有機酸、氨基酸、揮發(fā)性物質(zhì)，為酸湯風(fēng)味成分的研究奠定了基礎(chǔ)。如：張東亞[5]采用HPLC 法測定酸湯中含有乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸，采用氨基酸分析儀測定酸湯中的游離氨基酸。田亞[6]通過GCMS 聯(lián)用技術(shù)分析貴州米酸湯的主體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為有機酸、酯類物質(zhì)。Liu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)米酸湯的有機酸中，乳酸含量最高，其次是蘋果酸、乙酸、草酸、酒石酸和琥珀酸等。王容等[8]研究米酸湯在發(fā)酵過程中的品質(zhì)變化及其相關(guān)性分析，結(jié)果表明感官評分與乳酸、蘋果酸、酒石酸呈極顯著正相關(guān)。乳酸的酸味溫和、爽口；蘋果酸帶有刺激性的爽快酸味，單純的乙酸具有刺激性氣味，草酸酸味刺激，酒石酸酸味綿長，琥珀酸給人以鮮酸的口感。

食品的柔和鮮爽的口感及味覺持久性均與多種有機酸共同作用有關(guān)[9]。米酸湯中有機酸種類眾多，多種有機酸共同作用可緩解米酸湯中較高濃度的草酸和乙酸對味覺的刺激，調(diào)和其酸味，改善質(zhì)量，賦予米酸湯獨特的風(fēng)味特征。有機酸中具有高沸點、黏性大的難揮發(fā)性有機酸在酸湯滋味和風(fēng)味中起到不可忽視的作用。它們可降低米酸湯中香味物質(zhì)的揮發(fā)速度，對米酸湯香氣有穩(wěn)定、調(diào)和、平衡等作用。酸湯中的糖類和氨基酸也可使酸味更柔和、豐滿、適口，并賦予酸湯一定的回甜味，使酸湯口感具有較長的持久感和層次感。酸類、醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)，賦予米酸湯愉悅香氣和豐富口感，修飾調(diào)節(jié)其整體風(fēng)味，對米酸湯品質(zhì)有顯著影響[10]。

目前，通過傳統(tǒng)定量技術(shù)對酸湯中的主要成分已有較深入的了解，然而，由于檢測目標預(yù)先設(shè)定，導(dǎo)致不能全面了解酸湯在發(fā)酵前、后有哪些物質(zhì)發(fā)生變化，有些物質(zhì)因含量低于檢出限而不被關(guān)注，卻在酸湯風(fēng)味上有重要貢獻。隨著檢測技術(shù)和設(shè)備的發(fā)展，近幾年發(fā)展起來的基于氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（GC-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)、超高效液相色譜與Q-ExactiveHF-X 質(zhì)譜（UHPLC-QE-MS）聯(lián)用等多種檢測平臺的非靶標代謝組學(xué)技術(shù)，可全面系統(tǒng)地解析生物樣本中的多種小分子代謝產(chǎn)物，具有靈敏度高，檢測范圍廣，重復(fù)性好等優(yōu)點，目前廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)領(lǐng)域[11-13]。通過多元統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)分析，可較好地剖析樣本間或過程中物質(zhì)變化的差異性，并可分析其涉及的差異代謝途徑，揭示樣本處理后成分變化的生理機制[14]。食品中的物質(zhì)被攝入口腔后，使感覺器官（舌頭）產(chǎn)生感覺印象的物質(zhì)，稱為呈味物質(zhì)，主要為強極性、難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的化合物[15]。強極性和熱不穩(wěn)定性化合物可通過液相色譜-質(zhì)譜檢測，難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的化合物，可通過衍生化處理，將其轉(zhuǎn)變成易揮發(fā)和穩(wěn)定的化合物，再進行氣相色譜-質(zhì)譜分析[16]。在米酸湯發(fā)酵過程中，各物質(zhì)之間有著非常復(fù)雜的聯(lián)系[8]，目前對米酸湯的報道主要集中于酸湯中有機酸含量或揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類的研究，對米酸湯中關(guān)鍵呈味物質(zhì)及其對滋味影響的相關(guān)研究較少。本研究采用經(jīng)衍生化處理后的GC-TOF-MS 和UHPLC-QE-MS 技術(shù)，以及感官評定方法，全面系統(tǒng)地描述米酸湯發(fā)酵前、后呈味物質(zhì)的差異，以及與滋味特征的相關(guān)性，解析米酸湯在發(fā)酵前、后呈味物質(zhì)形成的機制，及其與酸湯品質(zhì)提升的關(guān)系，為高品質(zhì)米酸湯的工藝優(yōu)化和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米酸湯樣品，采集于貴州省凱里市某知名酸湯企業(yè)；吡啶、氯仿均為色譜純，阿達瑪斯試劑公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，美國CNW Technologies 公司；核糖醇（標準品），純度≥99%，美國Sigma 公司；1%三甲基氯硅烷（TMCS），分析純，美國REGIS Technolo-gies 公司；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氧銨鹽，分析純，日本TCI 公司；飽和脂肪酸甲酯，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；L-2-氯苯丙氨酸 （標準品），純度≥99%，上海恒柏生物科技有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉等常見試劑均為分析純級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A 氣相色譜儀、DB-5MS 毛細管柱 （30 m×250 μm，0.25 μm）、Agilent 1290 UHPLC 超高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Q Exactive Focus 高分辨質(zhì)譜儀、PEGASUS HT 質(zhì)譜儀，美國LECO 公司；UPLC 超高壓液相色譜柱HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），沃特世公司；明澈D24 UV 純水儀，默克密理博公司；Spectra-Max iD3 酶標儀，美谷分子儀器有限公司；DF-101S 磁力攪拌器，鄭州生化儀器有限公司；Heraeus Fresco17 冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司；Forma900 series 超低溫冰箱，賽默飛世爾科技公司；PS-60AL 超聲儀，深圳市雷德邦電子有限公司；PPHSJ-4F pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DHG-9023A 烘箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TNG-T98 真空干燥儀，太倉市華美生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 樣品采集過程詳見圖1，按照傳統(tǒng)的發(fā)酵方法制作，口感鮮爽、風(fēng)味獨特、極具地方民族特色、備受消費者喜愛的貴州省黔東南苗族侗族自治州某知名企業(yè)的米酸湯產(chǎn)品為本研究對象。米酸湯的主要生產(chǎn)工藝為：以糯米粉為原料的米湯煮沸倒入發(fā)酵缸中，冷卻至室溫后接種適量米酸湯母液（上一次發(fā)酵成熟的酸湯），攪拌均勻，于28～30 ℃靜置發(fā)酵3～5 d 即得自然發(fā)酵米酸湯。在發(fā)酵車間中不同位置選取米酸湯壇，充分攪動每壇酸湯后進行采樣。每樣采集3 個平行樣，裝入密封容器中，干冰保藏運輸至實驗室，在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 米酸湯樣品取樣流程圖Fig.1 Flowchart for sampling rice sour soup

1.3.2 常規(guī)理化指標分析 嚴格依照相關(guān)標準及方法，對米酸湯中總酸、pH 值、總糖、還原糖等理化指標進行分析?？偹釁⒄諊鴺薌B/T 12456-2008 《食品中總酸的測定》[17]，pH 值參照國標GB 5009.237-2016《食品安全國家標準 食品pH 值的測定》[18]進行測定；總糖和還原糖采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS 法）進行測定[19]。

1.3.3 米酸湯滋味感官分析 米酸湯滋味感官的評分標準參考王容等[20]方法，并稍作修改。感官品評小組由經(jīng)過感官培訓(xùn)的10 名專業(yè)品評人員組成，5 男5 女，年齡均在22～26 歲之間。分別對米酸湯中的酸味、鮮味、回甜味、適口性、口感豐富度5 個指標進行評定，評分采用百分制，具體的感官評價標準見表1。

2014年，為加快推進鎮(zhèn)域經(jīng)濟和新型城鎮(zhèn)化建設(shè)，廣西又出臺了《廣西百鎮(zhèn)建設(shè)示范工程實施方案》，按照“缺什么、補什么”的原則，在培育主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，發(fā)展工業(yè)、邊貿(mào)、旅游和文化等方面制定了一系列的優(yōu)惠政策和支持政策，進一步優(yōu)化了廣西特色城鎮(zhèn)發(fā)展的政策環(huán)境。

表1 米酸湯感官評定指標Table 1 Sensory evaluation score of rice sour soup

1.3.4 滋味性物質(zhì)分析

1.3.4.1 GC-TOF-MS 分析

1） 樣品衍生化處理 取米酸湯樣本200 μL于2 mL EP 管中，加入600 μL 甲醇（含0.5 μg/mL核糖醇的內(nèi)標），渦旋30 s；冰水浴條件下，超聲處理10 min；-40 ℃靜置1 h；低溫（4 ℃）10 000 r/min離心15 min。最后，取上清液300 μL 于1.5 mL EP管中，真空濃縮干燥。在獲得的干燥的提取物中加80 μL 甲氧胺鹽試劑（含20 mg/mL 甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶），輕輕混勻后，置于烘箱中80 ℃孵育30 min。每個樣品中再加入100 μL BSTFA 溶液（含1%TMCS，體積分數(shù)），充分混勻后70 ℃孵育1.5 h進行衍生化，最后將衍生化的提取物放入樣品瓶中進行上機檢測。

2） GC-TOF-MS 檢測條件 GC 條件：采用DB-5MS 毛細管柱 （30 m×250 μm，0.25 μm），進樣量為1 μL；分流模式設(shè)為不分流；升溫程序設(shè)定為50 ℃維持1 min，以10 ℃/min 升至310 ℃，維持8 min；載氣（He）流速1 mL/min。

MS 條件：采用電子電離源；電子能量-70 eV；進樣口溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～500 m/z；掃描速率12.5 光譜/s；溶劑延遲時間6.33 min。

1.3.4.2 UHPLC-QE-MS 分析

1） 樣品處理 移取200 μL 樣品至EP 管中，加入600 μL 甲醇（含內(nèi)標L-2-氯苯丙氨酸1 μg/mL），其渦旋、超聲、離心處理條件均同1.3.4.1 節(jié)的方法；取上清液于樣品瓶中，上機檢測。

Thermo Q Exactive 質(zhì)譜儀通過Xcalibur 軟件（版本：4.0.27，Thermo）對一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行采集。鞘氣流速45 Arb，輔助氣流速15 Arb，毛細管溫度400 ℃，全毫秒分辨率70 000 u，MS/MS分辨率設(shè)定為17 500 u，在NCE 模式下碰撞能量為20/40/60 eV；噴涂電壓為4.0 kV （正） 或-3.6 kV（負）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-TOF-MS 原始數(shù)據(jù)使用ChromaTOF 軟件（V 4.3x，LECO），對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰提取、解卷積、積分等分析[21]，最后使用LECO-Fiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫對峰進行定性，通過質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配對色譜峰進行定性。UHPLC-QE-MS 原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard 軟件轉(zhuǎn)成mzXML 格式后，使用上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司自行研發(fā)的R程序包（內(nèi)核為XCMS）對峰進行識別、提取、對齊和積分等處理，確定物質(zhì)的匹配度，對物質(zhì)進行定性分析。所有數(shù)據(jù)采用內(nèi)標歸一化法處理，獲得各組分的半定量分析結(jié)果。最后將GC-TOF-MS 數(shù)據(jù)和UHPLC-QE-MS 數(shù)據(jù)進行整合，運用SIMCA 14.1 軟件、MetaboAnalyst（https：//www.metaboanalyst.ca/） 模塊、Excel 2020、R 語言進行數(shù)據(jù)處理，利用斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價結(jié)果

由圖2可知，米酸湯在發(fā)酵后的整體感官得分均優(yōu)于發(fā)酵前。發(fā)酵后，米酸湯的回甜味優(yōu)于發(fā)酵前，這可能是米酸湯發(fā)酵過程中微生物將淀粉水解為麥芽糖、葡萄糖等還原糖，可使米酸湯具有一定的甜味；以及一些醇類物質(zhì)，如甘油，研究表明甘油對人體味覺能感覺到的甜味有輕微影響[22]。米酸湯發(fā)酵過程中代謝的乳酸、蘋果酸、乙酸等有機酸，使酸湯口感酸爽。米酸湯中所形成的氨基酸、醇類、酯類等物質(zhì)，可增加酸湯的鮮味和風(fēng)味。在多種呈味物質(zhì)的共同作用下，酸湯口感呈現(xiàn)出豐富、醇厚、余味綿長的特點。為了探究米酸湯發(fā)酵后形成酸爽、愉悅滋味的原因，本研究將對米酸湯發(fā)酵前、后理化指標和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行測定。

圖2 米酸湯發(fā)酵前后感官評分雷達圖Fig.2 Radar map of sensory evaluation for rice sour soup

2.2 理化指標分析

由表2可知，米酸湯發(fā)酵后總糖和還原糖含量以及pH 值顯著降低，總酸含量顯著增加。這與米酸湯發(fā)酵過程中微生物通過糖酵解途徑、丙酮酸代謝途徑、檸檬酸鹽循環(huán)等碳水化合物代謝途徑消耗糖類，并代謝產(chǎn)乳酸等有機酸有關(guān)[23]。

表2 米酸湯樣品發(fā)酵前、后理化指標Table 2 Physicochemical indexes of rice sour soup before and after fermentation

2.3 米酸湯呈味物質(zhì)差異性分析

米湯發(fā)酵后獲得米酸湯，在口感上存在明顯差異，其呈味物質(zhì)差異分析詳見圖3。通過非監(jiān)督模型的主成分分析（Principal component analysis，PCA） 及監(jiān)督模型正交偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）可知，在95%置信區(qū)間內(nèi)，米酸湯發(fā)酵前、后兩組樣本成分具有良好區(qū)分度。OPLS-DA 置換檢驗中，R2Y、Q2用于評估OPLSDA 模型的有效性，R2（0，0.99）和Q2（0，-0.13）值越接近于1，說明模型構(gòu)建得越好，可以很好地解釋米酸湯兩組樣本之間的差異性。這與米湯成分在自然發(fā)酵過程中，通過微生物作用將淀粉、脂肪等大分子物質(zhì)分解為小分子物質(zhì)，代謝產(chǎn)生有機酸、氨基酸、脂肪酸等小分子風(fēng)味物質(zhì)，由此使發(fā)酵前、后樣品中物質(zhì)組成具有明顯差異[7]。

圖3 米酸湯發(fā)酵前、后呈味物質(zhì)差異分析Fig.3 Analysis of difference components of rice sour soup before and after fermentation

2.4 主要呈味物質(zhì)及其代謝途徑分析

2.4.1 主要呈味物質(zhì) 為解析對米酸湯滋味產(chǎn)生影響的主要物質(zhì)，對發(fā)酵前、后的強極性、難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的化合物（呈味物質(zhì)）的相對含量進行比較，通過OPLS-DA 模型分析，共鑒定出差異代謝物49 種，包括27 種有機酸，4 種氨基酸，9 種糖類及其衍生物，3 種醇類，4 種醛類，2 種酯類。發(fā)酵前、后樣本的中差異代謝物的含量變化情況詳見圖4。

米酸湯發(fā)酵后，乳酸、琥珀酸、酒石酸等有機酸，以及一些脂肪酸在含量上發(fā)生了顯著上調(diào)。有機酸在米酸湯中有呈香和呈味作用，同時也可在發(fā)酵過程中抑制雜菌生長。米酸湯中的有機酸由微生物發(fā)酵產(chǎn)生[7]，乳酸菌、酵母菌作為米酸湯中的優(yōu)勢微生物，發(fā)酵過程中對乳酸、乙酸、琥珀酸等有機酸含量的增加具有重要貢獻[7]。蘋果酸和草酸，作為檸檬酸鹽循環(huán)中的重要中間產(chǎn)物，在米酸湯發(fā)酵過程中，可能被進一步代謝為其它物質(zhì)，或進入其它代謝途徑而被分解消耗。由圖4可知，蘋果酸和草酸在米酸湯發(fā)酵后含量降低，草酸酸味刺激，其含量降低可減緩米酸湯中酸味的刺激感。而乙酸對米酸湯的刺激感，可通過乳酸、酒石酸、琥珀酸等有機酸的相互協(xié)同，對米酸湯口感起到調(diào)節(jié)作用，使酸味變得柔和、醇厚，此外，研究表明琥珀酸還可起到增鮮作用[24]。除此以外，研究中還發(fā)現(xiàn)油酸、花生四烯酸、十八碳烯酸等高級脂肪酸含量也在發(fā)酵后有所增加。高級脂肪酸與小分子有機酸酸的協(xié)同作用可賦予發(fā)酵食品特有的酸香味和醇香味，增加滋味的豐富度和層次感[25-26]。

圖4 米酸湯發(fā)酵前、后差異代謝物熱圖Fig.4 Heat map of differential metabolites in rice sour soup before and after fermentation

氨基酸也是發(fā)酵食品中重要的風(fēng)味物質(zhì)，氨基酸所賦予的如甜、鮮、酸等諸多味感，可賦予米酸湯豐富的味覺層次感，使其具有鮮美、濃郁、柔和、協(xié)調(diào)等特征。從米酸湯中篩選出的氨基酸差異代謝物質(zhì)有N-乙酰-L-天冬氨酸、蘇氨酸、精氨酸、甘氨酸。天冬氨酸是20 種蛋白質(zhì)氨基酸之一，與谷氨酸同屬酸性氨基酸[27]。蘇氨酸作為一種必需氨基酸，對人體具有重要的生理性能，如抗氧化，促進生長發(fā)育，增強人體免疫系統(tǒng)等，此外蘇氨酸混合在食品中還可產(chǎn)生特殊香氣[28]。精氨酸與蘇氨酸相似，具有多種生理功能[29]，甘氨酸作為一種增味劑，能緩和酸味和堿味。

糖作為微生物生長代謝所需的主要碳源，通過碳水化合物代謝途徑為其生長提供能量[30]。乳果糖、乳糖、龍膽二糖、赤蘚糖、異麥芽酮糖等9 種糖類及其衍生物被鑒定為差異代謝物質(zhì)。米酸湯發(fā)酵過程中，微生物將大分子糖類分解為小分子糖，或?qū)⑻穷惤?jīng)過酶等作用后生成新的糖。葡萄糖相互作用可制得龍膽二糖，龍膽二糖是一種功能性低聚糖，用于糖果、飲料、冷飲中，可使其甜味更純。蔗糖在α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、蔗糖異構(gòu)酶的作用下可生成異麥芽酮糖，異麥芽酮糖是一種特殊甜味劑，甜味純正，溫和細致，有諸多健康生理功能?？烧诒萎愇?，平衡口感，改善食物風(fēng)味[31]。此外，米酸湯中篩選的差異代謝物質(zhì)甘油，發(fā)酵后含量明顯增加，可調(diào)節(jié)米酸湯的口感。甘油二酯口感柔軟、豐滿、潤滑，風(fēng)味特殊，還可作為食品的功能性油脂使用[32-33]。

2.4.2 主要代謝途徑分析 發(fā)酵后各種呈味物質(zhì)的產(chǎn)生與微生物的代謝作用密不可分，本研究借助MetaboAnalyst 4.0 富集分析對所有差異代謝物進行代謝通路的生物信息學(xué)分析，共獲得27 條代謝途徑；通過影響值（Impact ＞0.01）對關(guān)鍵代謝途徑進行篩選[34]，由圖5可知，共有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Impact=0.306）、甘油脂代謝（Impact=0.285）、丙酮酸代謝（Impact=0.109）、乙醛酸和二羧酸代謝（Impact=0.104）等10 條關(guān)鍵代謝途徑。

圖5 差異代謝物通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of differential metabolite pathways

10 條關(guān)鍵代謝途徑中主要參與的差異代謝物有甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、琥珀酸酯、草酸鹽、乳酸、泛酸、甘油。米酸湯發(fā)酵過程中原料中的淀粉、蔗糖等多糖可被微生物水解為葡萄糖和果糖等，葡萄糖可通過微生物在糖酵解途徑中代謝的酶（如葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸丙酮異構(gòu)酶等）的作用下，生成丙酮酸，進入三羧酸循環(huán)，進而產(chǎn)生米酸湯中的多種有機酸。甘油酯代謝途徑中，甘油可通過米酸湯原料中的脂肪在各種酶的作用下降解產(chǎn)生；甘油也可在氨基酸代謝途徑中通過羥基丙酮酸進一步合成；此外，乳糖在酶的作用下也可生成甘油。有研究表明，酵母菌在乙醇發(fā)酵階段的重要副產(chǎn)物甘油，能幫助細胞適應(yīng)發(fā)酵液中的環(huán)境變化[35]。隨后，甘油在酶的作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸，進入丙酮酸代謝、檸檬酸鹽循環(huán)，以及泛酸和CoA 生物合成途徑。琥珀酸主要通過檸檬酸鹽循環(huán)產(chǎn)生，具有酸味，可調(diào)和米酸湯的酸味。精氨酸可在乙醛酸和二羧酸代謝、精氨酸生物合成途徑中生成，甘氨酸、蘇氨酸可在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、甲烷代謝、谷胱甘肽代謝中生成，精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸均可在酶的作用下進入檸檬酸鹽酸循環(huán)。部分有機酸和氨基酸共同作用還可促進風(fēng)味的形成，如琥珀酸與鮮味氨基酸合用時，對鮮味起到增效的作用[36]。米酸湯中微生物通過各種代謝途徑產(chǎn)生的多種呈味物質(zhì)，共同為米酸湯獨特滋味的形成做貢獻。

2.5 米酸湯滋味特征與差異代謝物的相關(guān)性

本研究通過關(guān)聯(lián)分析，分析了米酸湯滋味指標與關(guān)鍵差異代謝物間的關(guān)聯(lián)性，通過兩者的斯皮爾曼（spearman）相關(guān)系數(shù)，繪制了熱圖（圖6），圖中顏色越紅，說明兩者間呈現(xiàn)越緊密的正相關(guān)關(guān)系，越藍呈現(xiàn)越緊密的負相關(guān)關(guān)系。其中，米酸湯中酸味主要與油酸、亞油酸、肉豆蔻酸、3s，7，11-三甲基-6，10-十二烷酸（月桂酸）等脂肪酸呈正相關(guān)關(guān)系。這與魏光強等[25]研究的傳統(tǒng)酸凝乳餅中，酸味與月桂酸、亞油酸、肉豆蔻酸等脂肪酸呈正相關(guān)的結(jié)果相似?？茖W(xué)家研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸具有酸、甜、苦、咸、鮮5 種基本味道[37]，脂肪酸與舌面味蕾細胞的GPR40 受體和GPR120 受體相互作用[37]，隨后通過延遲整流鉀通路或刺激CD36 糖蛋白受體等途徑而被感知[38-39]。乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等有機酸也與酸味呈正相關(guān)關(guān)系，有機酸中的氫離子刺激舌黏膜而引起的味感，即為酸感，食品中多數(shù)有機酸能賦予食品爽口的酸感。食品的酸感與有機酸酸根的種類，pH 值大小，共存的其它物質(zhì)所帶來的緩沖效應(yīng)有關(guān)，如糖能很好地緩解食品中酸性物質(zhì)帶來的酸感。異麥芽酮糖、乳糖、甘氨酸與米酸湯的鮮味呈正相關(guān)，鮮味具有平衡酸、甜、苦、咸和風(fēng)味增強的綜合作用，并不是作為一種簡單的味覺存在。呈鮮物質(zhì)通過激活α-味蛋白，傳遞促發(fā)與呈鮮物質(zhì)相關(guān)的反應(yīng)，通過特定的神經(jīng)感覺系統(tǒng)傳導(dǎo)至大腦的味覺中樞，以產(chǎn)生味感[40]。異麥芽酮糖可平衡口感[31]，甘氨酸作為呈味氨基酸，可有效豐富食品的味道[41]。赤蘚糖甜味爽口[42]，甘油和蘇氨酸具有輕微甜味[22，25]，其均與米酸湯的適口性呈正相關(guān)。乳果糖、α-D-葡萄糖、毛蕊花糖、麥芽四糖、N-乙酰基-DL-天冬氨酸、三醋酸酯等與米酸湯回甜味呈正相關(guān)。甜味感覺主要是呈味物質(zhì)分子中含有的羥基與甜味感受蛋白中的氨基結(jié)合形成氫鍵，以刺激味覺感受器，進而由神經(jīng)遞質(zhì)傳入大腦，使人感到甜味[43]，肽的氨基端是天門冬氨酸的二肽衍生物也有強烈的甜味[44]。琥珀酸酐、對羥基苯乳酸、乳糖等與米酸湯口感豐富度呈正相關(guān)關(guān)系。

圖6 米酸湯滋味指標與差異代謝物的相關(guān)性熱圖Fig.6 Heat map of correlation between taste indicators and differential metabolites of rice sour soup

3 結(jié)論

米酸湯因其獨特的口感和風(fēng)味，成為我國貴州黔東南地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的典型代表，現(xiàn)正以其保健功能和獨特的口感受到廣大消費者的青睞。為了解米酸湯主要呈味物質(zhì)及形成機理，以及對滋味的影響。本研究通過衍生化結(jié)合GC-TOFMS 和UHPLC-QE-MS 非靶標代謝組學(xué)聯(lián)用技術(shù)，以及感官分析，對貴州傳統(tǒng)自然發(fā)酵米酸湯發(fā)酵前、后的理化成分，差異代謝物進行分析。結(jié)果表明，米酸湯發(fā)酵后，總體感官結(jié)果均與發(fā)酵前呈顯著差異，總糖、還原糖含量和pH 值呈明顯下降趨勢，總酸含量則相反。米酸湯發(fā)酵前、后主要呈味物質(zhì)中，有49 種非揮發(fā)性差異代謝物，使用MetaboAnalyst 4.0 對其代謝通路進行分析，發(fā)現(xiàn)在27 條代謝途徑中有10 條被鑒定為關(guān)鍵代謝途徑。將滋味指標與49 種差異代謝物質(zhì)進行相關(guān)性分析，獲悉油酸、亞油酸、肉豆蔻酸等脂肪酸，乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等有機酸與米酸湯的酸味呈正相關(guān)。異麥芽酮糖、乳糖、甘氨酸與鮮味，赤蘚糖、甘油和蘇氨酸與適口性，乳果糖、α-D-葡萄糖、毛蕊花糖、麥芽四糖、N-乙?；?DL-天冬氨酸、三醋酸酯與回甜味，琥珀酸酐、對羥基苯乳酸、乳糖等與口感豐富度均呈正相關(guān)關(guān)系。

本研究借助先進的檢測手段和多元統(tǒng)計分析，解析了對酸湯滋味有重要影響的物質(zhì)，為下一步篩選能干預(yù)或強化酸湯發(fā)酵的功能微生物篩選，優(yōu)化酸湯發(fā)酵工藝及穩(wěn)定和提高工業(yè)化生產(chǎn)中酸湯品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)。