王雨欣，黃雨彤，楊盼盼，姜松松

（揚州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院 江蘇揚州 225127）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種炎癥性腸病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，美國和西歐等國家UC 的發(fā)病率較高[1]，亞洲地區(qū)UC 的患病率較低，然而，值得注意的是，實際患病人群可能遠(yuǎn)高于目前統(tǒng)計數(shù)據(jù)，且近年來UC 發(fā)病率顯著提高[2-3]。UC 的臨床癥狀主要為腹瀉、黏液便秘、膿血等臨床表現(xiàn)[4]，嚴(yán)重危害了人們的健康。該病多發(fā)于青壯年群體，難以痊愈、反復(fù)發(fā)作，發(fā)生癌變可能性大，一直以來被世界衛(wèi)生組織列為疑難病[5]。

由于UC 的發(fā)生受多種因素影響，其具體病因和發(fā)病機制尚未完全明確。目前的治療藥物主要有5-氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素等[6]。5-氨基水楊酸類藥物具有一定的治療效果，然而，其特殊藥代動力學(xué)機制使其對結(jié)腸外的病變幾乎無療效；糖皮質(zhì)激素可在短時間內(nèi)緩解重度患者的急性癥狀，而長期使用會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，甚至股骨頭壞死等并發(fā)癥[7]。尋找治療UC 的有效成分是研究重點。

近年來，眾多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多天然植物活性成分具有潛在治療UC 的作用。如乳香的有效成分五環(huán)三萜烯酸可非競爭性抑制脂氧合酶，抑制白三烯的合成，發(fā)揮治療作用；姜黃素可以通過抑制一氧化氮、白三烯等因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[8]。水蘇糖是一種天然性低聚糖，其甜味弱，能量低，可以代替蔗糖。水蘇糖主要是從草石蠶中提取，目前有方法制得的水蘇糖純度高達(dá)99%[9]。有研究表明，水蘇糖能顯著提高小鼠肝勻漿SOD 水平，對環(huán)磷酰胺所致肝損傷起到保護(hù)作用[10]，且可以通過減少腸道內(nèi)氨的吸收而對臨床/亞臨床肝性腦病（HE/SHE）起到一定的預(yù)防作用[11]。水蘇糖已被證實可以調(diào)節(jié)腸道菌群，改善便秘等癥狀，然而，對腸道疾病的改善作用方面，目前國內(nèi)外還鮮有報道。

本研究以水蘇糖為研究對象，利用葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，給予水蘇糖干預(yù)處理，通過相關(guān)指標(biāo)的測定，明確其干預(yù)作用，并初步探究其作用機制，以期為開發(fā)抗結(jié)腸炎的藥物或功能性食品提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

蘇舒牌水蘇糖，北京順天廣澤科貿(mào)有限公司；葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國MP Biomedicals 公司；MPO 試劑盒、IL-1β 試劑盒、IL-6 試劑盒、TNF-α試劑盒，美國BD 公司；BCA 蛋白定量試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

4 周齡SPF 級雌性ICR 小鼠50 只，體質(zhì)量17～24 g，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號：SYXK（蘇）2017-0044。小鼠5 只1 籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。試驗期間小鼠自由攝食、飲水。試驗期為4 周，每3 d 測1 次體質(zhì)量，給藥方式為灌胃。每日記錄，觀察小鼠體質(zhì)量、稀便、血便的情況。實驗于特定病原體（SPF）級動物房中進(jìn)行。

1.3 動物分組與模型建立

將小鼠隨機分為5 組，包括生理鹽水組、DSS模型組、水蘇糖低劑量組[0.25 g/（kg·d）]、中劑量組[0.5 g/（kg·d）]、高劑量組[1.5 g/（kg·d）]，每組10只。第1～7 天生理鹽水組與DSS 模型組每日一次性灌胃0.2 mL 生理鹽水，水蘇糖低、中、高劑量組每日一次性灌胃0.2 mL 不同濃度的水蘇糖溶液，各組均處理7 d。第8 天起，DSS 模型組、水蘇糖各劑量組每日一次性灌胃0.2 mL 4 g/kg DSS 溶液，水蘇糖持續(xù)給藥，生理鹽水組灌胃等量生理鹽水。實驗期間觀察小鼠大便形狀和隱血情況，每3 d稱量1 次體質(zhì)量。第14 天進(jìn)行小鼠眼眶采血，離心后取血清用于ELISA 法測定炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。小鼠采血后統(tǒng)一處死，取結(jié)腸組織，評估小鼠結(jié)腸損傷程度，其余結(jié)腸組織用于測定髓過氧化物酶含量和Western blot 實驗。本實驗符合動物倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定。

1.4 評價指標(biāo)

1.4.1 疾病活動指數(shù) （Disease activity index，DAI）評估 每日觀察小鼠體質(zhì)量、大便性狀和隱血情況，按表1進(jìn)行評分[12-14]。根據(jù)公式“疾病活動指數(shù)=（體質(zhì)量評分+大便性狀評分+隱血評分）/3”計算每只小鼠的DAI，評估疾病活動情況。

表1 疾病活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Disease activity index scoring criteria

1.4.2 結(jié)腸組織長度測定 小鼠處死后，取盲腸末端和近端直腸之間的結(jié)腸，測量結(jié)腸長度[15]。

1.4.3 結(jié)腸大體形態(tài)評分和組織病理學(xué)評分 小鼠處死后，取小鼠2 cm 病變嚴(yán)重結(jié)腸浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定組織，石蠟包埋切片，經(jīng)二甲苯脫蠟后染色，用于結(jié)腸大體形態(tài)[16]和組織病理學(xué)評分[17]，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 結(jié)腸大體形態(tài)和組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Colonic morphological and histopathological scoring criteria

1.4.4 髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）含量的測定 小鼠處死后，取小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸段約3 cm，加入適量生理鹽水進(jìn)行勻漿，勻漿液以3 000r/min，4 ℃，離心10 min，取上清液進(jìn)行MPO 含量的測定。具體檢測步驟參照MPO ELISA 試劑盒說明書。

1.4.5 ELISA 法測定IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)水平 干預(yù)結(jié)束后小鼠內(nèi)眥靜脈采血，以4 500 r/min，4 ℃，離心10 min，取上清，-80 ℃保存，待測。具體檢測步驟參照ELISA 試劑盒說明書。

1.4.6 蛋白質(zhì)印跡分析 （Western blot） 取結(jié)腸組織，采用RIPA 裂解液進(jìn)行蛋白提取，并通過BCA 法測定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，將膜置于5% BSA-TBST 中，水平搖床孵育1 h 封閉。然后與NF-κB p65（1∶1 000）4 ℃水平搖床孵育過夜。膜用TBST 洗滌3 次，與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1 ∶10 000） 室溫孵育40 min，TBST 洗膜3 次。通過ECL 法顯色，用Image J 軟件分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin 的灰度值比值，計算其相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié)果與分析

2.1 一般狀態(tài)觀察

有研究表明UC 會導(dǎo)致患者的體重減輕[18]。因此，本研究首先觀察了各組小鼠體質(zhì)量變化，結(jié)果如圖1所示，前7 d 各組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定上升，精神狀態(tài)良好，活動能力正常；自第8 天灌胃DSS 溶液開始，除生理鹽水組，各組小鼠體質(zhì)量持續(xù)下降，小鼠出現(xiàn)精神呆滯，活動能力下降，飲食、飲水量下降，大便稀溏的現(xiàn)象。水蘇糖各劑量組于第13 天起體質(zhì)量開始增加，小鼠精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，活動能力有所上升，飲食飲水量增加，大便逐漸正常；模型組小鼠出現(xiàn)便血現(xiàn)象，精神萎靡、易驚恐，體質(zhì)量持續(xù)下降。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況Fig.1 Body mass changes of mice in different groups

2.2 疾病活動指數(shù)（DAI）評分結(jié)果

UC 小鼠的癥狀表現(xiàn)與人類UC 相似，會導(dǎo)致腹瀉、便血等癥狀[19]。因此，本研究評估了小鼠的疾病活動指數(shù)，結(jié)果如圖2所示，生理鹽水組小鼠疾病活動指數(shù)基本正常，模型組小鼠造模后出現(xiàn)稀便、便血等癥狀，其疾病活動指數(shù)顯著高于生理鹽水組（P＜0.001），水蘇糖各劑量組小鼠疾病活動指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.001），稀便、便血等癥狀均得到一定程度緩解。

圖2 各組小鼠疾病活動指數(shù)評分Fig.2 Disease activity index of mice in different groups

2.3 結(jié)腸長度測量結(jié)果

潰瘍性結(jié)腸炎會引起結(jié)腸充血水腫，進(jìn)而出現(xiàn)結(jié)腸縮短現(xiàn)象[20]。因此，本研究測量了小鼠結(jié)腸長度，結(jié)果如圖3所示，與生理鹽水組相比，模型組小鼠結(jié)腸顯著縮短（P＜0.001）。與模型組相比，低劑量水蘇糖雖在一定程度上可以緩解結(jié)腸縮短現(xiàn)象，而小鼠結(jié)腸長度無顯著性差異（P ＞0.05），中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠結(jié)腸長度Fig.3 Length of colon of mice in different groups

2.4 大體形態(tài)和組織病理學(xué)評分結(jié)果

UC 經(jīng)典組織學(xué)變化包括隱窩密度降低，隱窩結(jié)構(gòu)變形和嚴(yán)重的彌漫性黏膜炎癥等[21]。因此，本研究進(jìn)行了小鼠結(jié)腸大體形態(tài)與組織病理學(xué)評分，結(jié)果如圖4所示，生理鹽水組小鼠結(jié)腸大體正常，模型組小鼠可見結(jié)腸黏膜充血、水腫，固有層炎性細(xì)胞大量浸潤等。水蘇糖各劑量組小鼠結(jié)腸較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，部分黏膜及黏膜下層仍有少量炎性細(xì)胞浸潤。模型組大體評分、組織病理學(xué)評分顯著高于生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，水蘇糖各劑量組均能降低UC 小鼠大體形態(tài)和組織病理學(xué)評分，而低劑量組均無顯著差異（P＞0.05），中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)和組織病理學(xué)評分Fig.4 Colonic morphological scores and histopathological scores of mice in different groups

2.5 MPO 含量的檢測結(jié)果

MPO 是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶[22]，炎癥發(fā)生會引起MPO 含量的增加。因此，本研究檢測了小鼠結(jié)腸組織MPO 含量，結(jié)果如圖5所示，模型組小鼠結(jié)腸MPO 含量顯著高于生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.001）。與模型組相比，水蘇糖低、中、高劑量組均能顯著降低UC 小鼠結(jié)腸MPO 含量（P ＜0.001）。

圖5 各組小鼠結(jié)腸MPO 含量Fig.5 Colonic myeloperoxidase content of mice in different groups

2.6 結(jié)腸炎癥細(xì)胞因子含量檢測結(jié)果

當(dāng)炎癥性腸病發(fā)生時，結(jié)腸組織中會出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤[23]，使促炎因子表達(dá)升高，如IL-1β、IL-6、TNF-α 會大量釋放[24]。因此本研究檢測了小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的分泌水平，結(jié)果如圖6所示，與生理鹽水組相比，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平均顯著增加（P＜0.001）。給予水蘇糖干預(yù)后，低、中、高劑量組小鼠血清中IL-1β 表達(dá)水平較模型組顯著降低（P＜0.001），而中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；水蘇糖各劑量組均能降低小鼠血清中IL-6 和TNF-α 的分泌水平，而低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖6 各組小鼠血清細(xì)胞因子含量Fig.6 Serum cytokines content of mice in different groups

2.7 水蘇糖對NF-κB 信號通路的影響

NF-κB 信號通路參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，關(guān)鍵蛋白分子NF-κB p65 在UC 患者結(jié)腸中高度表達(dá)[25]，此外有研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道黏膜巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞中NF-κB 信號途徑被激活[26]。因此推測水蘇糖可能通過抑制NF-κB 信號途徑從而發(fā)揮改善結(jié)腸炎的作用，本研究取結(jié)腸組織，進(jìn)行Western blot 實驗，檢測結(jié)腸組織中NF-κB p65 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示。模型組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65 的蛋白表達(dá)較生理鹽水組顯著增加（P＜0.001）。與模型組相比，水蘇糖低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖7 Western blot 檢測小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65 的蛋白表達(dá)Fig.7 Western blot detection of NF-κB p65 protein expression in mice colonic tissues

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎屬于炎癥性腸病，人群發(fā)病率呈上升趨勢。臨床治療多以控制炎癥、抑制自身免疫反應(yīng)等措施為主[27]。DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型與人類UC 相似，是研究結(jié)腸炎的一種常用模型，目前大多以蒸餾水配制DSS 溶液給予動物自由飲用造模，有研究對比了DSS 自由飲用與灌胃誘導(dǎo)UC 小鼠，結(jié)果顯示灌胃法誘導(dǎo)的UC 小鼠模型動物表現(xiàn)更均一且成本低[28]，因此本實驗采用4 g/（kg·d） DSS 溶液給ICR 雌性小鼠灌胃7 d誘導(dǎo)的UC 小鼠模型，結(jié)果顯示，模型組小鼠體重下降明顯，存在腹瀉、便血現(xiàn)象，大量炎性細(xì)胞浸潤，炎癥狀態(tài)較明顯。

本研究中生理鹽水組和水蘇糖各劑量組的DAI 評分顯著低于模型組，且從結(jié)腸大體形狀和病理學(xué)評分來看，水蘇糖中、高劑量組對UC 小鼠具有一定改善作用，可見水蘇糖能在一定程度上減輕潰瘍性結(jié)腸炎對結(jié)腸造成的損傷與炎癥反應(yīng)。該結(jié)果表明，水蘇糖可以改善DSS 誘導(dǎo)的UC小鼠的結(jié)腸黏膜炎癥表現(xiàn)，對促進(jìn)組織修復(fù)、抑制炎癥反應(yīng)方面有一定的作用。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致UC 發(fā)病的重要因素之一[29]，MPO 是反映氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。作為血紅素過氧化物酶超家族成員之一，MPO 主要存在于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞中，MPO 的升高可間接反應(yīng)炎性細(xì)胞數(shù)量的增多[30]。UC 患者腸道中MPO 含量明顯增加，可作為是否患UC 的判斷依據(jù)[31]。本研究中模型組MPO 含量明顯高于生理鹽水組，說明使用DSS 成功誘導(dǎo)UC 小鼠模型。與模型組相比，水蘇糖各劑量組均能顯著降低結(jié)腸MPO 含量，表明水蘇糖能降低小鼠結(jié)腸中過氧化氫氧化的能力，可以減輕炎性細(xì)胞聚集，一定程度上抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕結(jié)腸組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

NF-κB 作為在機體內(nèi)廣泛存在的重要轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)的信號途徑參與機體炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[32]。NF-κB 信號途徑在UC 中起到重要作用[33]，馮小娟等[34]研究表明，Mes 對UC 的治療效果可能與PXR/NF-κB 信號通路有關(guān)。NF-κB 主要以二聚體形式存在于真核生物結(jié)腸上皮細(xì)胞中，以p65 發(fā)揮主要轉(zhuǎn)錄激活作用[35]。細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中起重要作用，如IL-1β、IL-6、TNF-α 等[36]。IL-1β由單核巨噬細(xì)胞分泌，能激活致病性T 細(xì)胞參與機體炎癥反應(yīng)[37]；IL-6 作為一種多效性細(xì)胞因子在IBD 慢性炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[38]；TNF-α 可以激活NF-κB 信號通路進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[39]。當(dāng)炎癥刺激時，NF-κB 可上調(diào)IL-1β、IL-6、TNFα mRNA 表達(dá)，導(dǎo)致IL-1β、IL-6、TNF-α 釋放增加[40]，當(dāng)這些炎癥因子釋放后，可正反饋調(diào)節(jié)NFκB 的表達(dá)，使炎癥不斷加重[41]。本文研究結(jié)果顯示，DSS 誘導(dǎo)的UC 模型小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示UC 發(fā)生與NF-κB表達(dá)密切相關(guān)；水蘇糖干預(yù)后，中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65 蛋白表達(dá)明顯下降，表明NF-κB 信號通路可能是水蘇糖改善UC 的重要作用機制之一；水蘇糖各劑量組均能顯著降低IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平，然而低劑量組對IL-6 表達(dá)水平無顯著影響，表明水蘇糖在達(dá)到一定濃度后能調(diào)節(jié)腸道炎癥因子分泌并降低表達(dá)水平，由此推測水蘇糖對UC 的改善作用可能是通過減少結(jié)腸中單核巨噬細(xì)胞數(shù)來實現(xiàn)的；中、高劑量組無顯著差異，提示水蘇糖的改善作用可能有限制范圍，仍待進(jìn)一步深入分析。

綜上所述，水蘇糖對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有一定改善作用，可明顯改善UC 小鼠的一般情況和結(jié)腸組織損傷，降低MPO 含量，減少炎癥因子釋放，可能抑制NF-κB 信號通路的過度激活。同時，水蘇糖各劑量間相比，中、高劑量組對UC 小鼠的改善效果顯著優(yōu)于低劑量組，說明水蘇糖溶液濃度和治療效果具有一定相關(guān)性，然而中、高劑量組間差異不明顯，故仍需后續(xù)探索研究。本研究為以水蘇糖為原料，開發(fā)治療潰瘍性結(jié)腸炎或相關(guān)功能食品提供依據(jù)。