趙曉初 羅兆莉 楊 菲 李 纖*

（1）首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069；2）首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學學系，北京 100069；3）首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經生物學學系，北京 100069）

神經元（neuron）在胚胎發(fā)育中由神經祖細胞（neuroepithelial cells，NEs）經過神經元發(fā)生相轉變?yōu)榉派錉钅z質細胞（radial glial cells，RGs），通過不對稱分裂直接產生，也有一些神經元通過中間祖 細胞（neural progenitors，NPs）間 接 分 化 產生［1］。出生后，中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中的神經元再生能力十分匱乏，僅側 腦 室（lateral ventricle）的 室 管 膜 下 區(qū)（subventricular zone，SVZ）和 海 馬 齒 狀 回（dentate gyrus，DG）的 顆 粒 下 區(qū)（subgranular zone，SGZ）等幾處保留少量來自放射狀膠質細胞系的膠質源性纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陽性細胞，在內源性條件與外源性因素的共同作用下，緩慢生發(fā)少量神經元，遷移至所需位置并整合入神經網絡發(fā)揮功能［2］。

在神經系統(tǒng)疾病中，不可逆的神經元丟失是疾病發(fā)生發(fā)展過程中一個關鍵且共有的環(huán)節(jié)。帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）患者出現(xiàn)運動障礙/運動遲緩、震顫、僵硬和姿勢不穩(wěn)等運動癥狀，主要源自于黑質致密部中的多巴胺（dopamine，DA）能神經元的丟失［3］；阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）患者不同大腦區(qū)域中都能觀測到神經元數量的減少，且海馬CA1區(qū)和內嗅皮質中神經元的丟失與記憶缺陷的嚴重程度呈正相關［4］；在腦卒中（stroke）發(fā)生后，每晚1 min得到救治，患者神經系統(tǒng)就丟失1.8億個神經元［5］，從而導致不可逆的感覺缺失、運動障礙和精神后遺癥等。因此，尋找能夠進行神經元補充、神經網絡整合和功能恢復的科學手段，對神經系統(tǒng)疾病的臨床改善是十分迫切且必要的。

中樞神經系統(tǒng)的固有細胞主要包括神經元、神經膠質細胞（glia）以及巨噬細胞等［6］。神經膠質細胞在神經組織中數量龐大、功能復雜，人腦中膠質細胞的數量占人類全部中樞神經系統(tǒng)細胞的90%［7］。位于中樞神經系統(tǒng)的神經膠質細胞主要包括星形膠質細胞（astrocytes）、少突膠質細胞（oligodendrocytes）和小膠質細胞（microglia）等。小膠質細胞產生于胚胎時期的卵黃囊并遷入中樞神經系統(tǒng)［8］，其他的神經膠質細胞與神經元均起源于神經外胚層（neuroectoderm）［7］（圖1）。在胚胎神經發(fā)生的過程中，RGs在神經發(fā)生后期向膠質細胞發(fā)生相轉變，主要生成星形膠質細胞和少突膠質細胞［1，9］。其中，星形膠質細胞是腦內最豐富的細胞群之一，約占中樞神經系統(tǒng)細胞總數的50%［10］。在健康的中樞神經系統(tǒng)中，星形膠質細胞參與突觸的形成，去除細胞外液中多余的神經遞質以實現(xiàn)神經信號的精準傳遞，并通過與神經元的雙向交流來調節(jié)突觸與神經系統(tǒng)功能、行為和信息處理；還能夠通過調節(jié)局部血流增減葡萄糖與氧氣供應，并為神經元提供葡萄糖或乳酸等作為能量底物［7，11］。少突膠質細胞由RGs經少突膠質前體細胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPCs or NG2 cells）分化而來［12］，在中樞神經系統(tǒng)不同部位占比不同。其在脊髓背側柱中占總細胞數的37%~42%，其中脊髓灰質后角占13%~16%，但在大腦皮層和海馬灰質僅占4%~5%［13］。少突膠質細胞能夠包裹軸突，在維持軸突的完整、提供支持與緩沖等保護、輔助神經元沿軸突快速有效地進行電信號傳導中發(fā)揮關鍵作用，并通過自身糖代謝為神經元軸突提供諸如葡萄糖、乳酸和糖酵解產物等能量底物，支持其電活動［14］。小膠質細胞屬于單核細胞系統(tǒng)，約占中樞神經系統(tǒng)細胞總數的5%~10%［15］。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)內再生能力最強的膠質細胞，在合適條件下可達每日新增20%的增殖速度［16-17］，在中樞神經系統(tǒng)中清除碎片和吞噬細胞、維持神經系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)［18］，并為其他中樞神經系統(tǒng)細胞的發(fā)育等提供支持［16］?？偟膩碚f，由于神經膠質細胞數量眾多，易于增殖，與神經元空間位置相近，這為神經膠質細胞向神經元的轉分化提供了得天獨厚的條件。

Fig.1 The development of neuronal and glial cells in the central nervous system圖1中樞神經系統(tǒng)神經元與神經膠質細胞發(fā)育過程

為改善神經元丟失這一病理進程，學者們嘗試將非神經元細胞在一定條件下誘導為具有以下特征的神經元：具備胞體、軸突與樹突的神經元基本形態(tài)；表達Tuj1、MAP2、NeuN、Synapsin等神經元標志物；具有神經元極化特點；表面表達有功能的膜通道蛋白（如電壓門控Na+通道）和能夠被激活的神經遞質受體（如谷氨酸受體）；具備靜息電位、動作電位等神經元電生理特性；具有形態(tài)（包含突觸小泡等結構）和功能（具有自發(fā)的突觸后電流）完整性，能夠整合進入神經網絡并在撤除誘導因素后仍保持神經元特性的穩(wěn)定［19］。如前所述，神經膠質細胞與神經元位置相近、譜系相同，因而膠質細胞-神經元轉分化以其原位、直接等優(yōu)點，成為逆轉神經元丟失的潛在有效手段［20］，因而作為這一領域中的熱點問題之一，受到了廣泛的關注與期待。

所謂轉分化（cellular conversion），指通過各種手段對細胞進行基因重編程，使某種細胞跳過誘導多能干細胞狀態(tài)，直接轉變?yōu)榱硪环N細胞并表達其特征的過程［21］。如能成功實現(xiàn)神經膠質細胞向神經元的轉分化，并整合入神經網絡，則中樞神經系統(tǒng)疾病病理過程中的神經元丟失就可能得到逆轉，神經系統(tǒng)功能就可能得到改善，神經系統(tǒng)疾病的臨床治療可能因此產生新的希望。

1 星形膠質細胞-神經元轉分化的研究進展

中樞神經損傷后，受損處原本處于靜止狀態(tài)的星形膠質細胞被表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、內皮素1（endothelin 1）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等激活為反應性星形膠質細胞（reactivated astrocytes），并重新進入細胞周期增殖增生［22-23］。反應性星形膠質細胞因所受刺激不同，能夠通過不同信號通路改變自身功能并影響其他細胞，導致神經功能障礙［23］。此外，星形膠質細胞長時程激活會形成難以降解的膠質瘢痕（glial scar），雖然限制了神經炎癥的擴散，但其在神經損傷修復的過程中會通過多種復雜的信號級聯(lián)反應產生細胞毒性分子，抑制突觸與髓鞘的再生、對附近的神經通路造成長期負面影響，導致慢性炎癥或神經性疼痛［23］。由于其在刺激下能夠增殖甚至去分化并獲得部分神經干細胞的特性［24-25］，星形膠質細胞作為可能向神經元轉分化的一種理想原料成為研究者們的關注對象。另一方面，將星形膠質細胞轉分化為神經元可能減少膠質瘢痕對神經修復的長期負面影響，可能為神經損傷后的修復帶來積極影響。

研究者們首先將目光聚集在體內自然狀態(tài)下的神經發(fā)生過程中、對細胞命運改變起到關鍵作用的轉錄因子上，諸如配對框基因6（paired-box 6，Pax6）［26］、少突膠質細胞轉錄因子2（oligodendrocyte lineage transcription factor 2，Olig2）［27］、原神經基因2（neurogenin 2，Ngn2）［28］、神經母細胞特異性轉移因子1（achaete-scute homolog 1，Ascl1）［29］、無 遠 端 同 源 盒2（distal-less homeobox 2，Dlx2）［30］、神 經 分 化 因 子1（neurogenic differentiation 1，NeuroD1）［31］等，希望通過對其轉錄活性進行操縱，以達到膠質細胞轉分化為神經元的目的（圖2）。

2002年，德國馬克斯·普朗克研究所Magdalena G?tz教授課題組首次發(fā)現(xiàn)，如果使用包含Pax6 cDNA的逆轉錄病毒，感染出生后5~11 d分離培養(yǎng)的小鼠皮層Pax6-的星形膠質細胞，則能夠成功誘導其轉分化為具有神經元胞體與突起的形態(tài)、表達Tuj1和NeuN等標志物、并對谷氨酸和γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）有反應的神經元［26］。經該團隊探索，Pax6在自然狀態(tài)中是一種在發(fā)育的皮層RGs中表達的神經元命運因子［32］，在小鼠胚胎皮層中能夠通過上調Ngn2、下調Ascl1促進神經元命運的決定［26］，在星形膠質細胞［26］與反應性星形膠質細胞［26］中亦能夠誘導表達部分早中期神經元發(fā)育標志物，而這些神經元是否具有功能仍待探索［27］。在成年體內神經發(fā)生中，Olig2是一種與Pax6相互拮抗的轉錄因子［33］，且Olig2基因和原神經基因的不同組合對神經外胚層譜系向神經元、少突膠質細胞或星形膠質細胞的發(fā)育有決定性意義［34］。在局部缺血和AD模型小鼠皮質內，使用能夠拮抗內源性Olig2功能的逆轉錄病毒感染反應性星形膠質細胞，可以將其轉分化為表達雙皮質素（doublecortin，DCX）的未成熟神經元［27］。接著，G?tz教授團隊又使用編碼GFP、Ngn2-IRES-GFP或Ascl1-IRES-GFP的VSV-G假 性逆轉錄病毒感染從出生后5~7 d小鼠的大腦皮層中分離培養(yǎng)的星形膠質細胞，成功將其轉分化為具有基本神經元形態(tài)特征、GFP與Tuj1雙陽性、能夠接受輸入性刺激并可產生電活動的突觸后神經元［35］，通過膜片鉗等電生理手段對轉分化而來的神經元的膜電位、突觸活動進行檢測，通過免疫熒光染色檢測能夠代表神經元功能活性的標志物Tuj1，首次驗證了星形膠質細胞能夠轉分化為具備神經元電生理特性的、有功能的神經元，并提出了不同轉錄因子誘導星形膠質細胞向不同神經元亞型轉分化的可能性。隨后學者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，應用逆轉錄病毒轉染從出生后早期（2~7 d）的小鼠皮層中分離培養(yǎng)的星形膠質細胞，過表達Ngn2可通過上調T盒腦1（T-box brain 1，Tbr1）誘導谷氨酸能神經元的產生［36］，同時過表達Dlx2和Ascl1誘導GABA能神經元的產生［36］，而同時過表達Ascl1、LIM同 源 框 轉 錄 因 子1（LIM homeobox transcription factor 1 beta，Lmx1b）或核受體相關因子1（nuclear receptor related factor 1，Nurr1），則使星形膠質細胞轉分化為DA能神經元［37］。更重要的是，通過適當的表達神經外胚層譜系細胞向神經元分化的命運決定因子能夠誘導出具備功能性突觸前輸出、能自發(fā)形成神經網絡的誘導神經元［36］，解決了轉分化神經元無法整合進入神經網絡的問題［35］。此外，膠質細胞轉分化為神經元的效率也從原本的較為低下［26，35］，通過一定比例轉錄因子的搭配提高到了較高的水平［37］。

在過表達神經元命運決定相關轉錄因子介導的星形膠質細胞-神經元轉分化中，NeuroD1引起了最為廣泛的關注。NeuroD1是一種具有基本螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）結構域的轉錄因子，僅在胰島、腸內分泌細胞、胃與神經元、神經干細胞中表達［38-39］，對諸如腺苷酸激酶同工酶1（adenylate kinase isozyme 1，AK1）、肌醇1,4,5-三磷酸受體1（inositol 1,4,5-triphosphate receptor 1，IP3R1）、早 期B細 胞 因子3（early B-cell factor 3，Ebf3）和POU結構域轉錄因子腦3d（brain 3d，Brn3d）等神經分化有關基因的轉錄激活十分重要［40］，在胚胎神經發(fā)生（尤其是海馬和小腦中顆粒細胞的生成［41］）以及成年神經發(fā)生、成熟和存活中均起到決定性作用［42］，并能誘導神經元的終末分化［43］。通過向1~14個月齡的小鼠腦內立體定位注射VSV-G假型逆轉錄病毒，在小鼠腦內星形膠質細胞中過表達NeuroD1，在腦外傷、AD模型小鼠皮質中星形膠質細胞轉分化為功能性谷氨酸能神經元［44］，首次完成了體內星形膠質細胞向神經元的轉分化［44］。這些新生神經元能夠整合入局部神經環(huán)路，修復神經元丟失造成的功能喪失［44］。而后，有學者發(fā)現(xiàn)，利用腺相關病毒9（adeno-associated virus 9，AAV9）穿過血腦屏障，在紋狀體等部的非反應性星形膠質細胞中過表達NeuroD1，在生理狀態(tài)下也能夠成功將其轉化為神經元［45］。以上成果為過表達NeuroD1誘導星形膠質細胞-神經元轉分化提供了基礎，使學者們開始嘗試將NeuroD1應用于更多疾病模型與臨床轉化（表1）。針對神經元丟失導致的中樞神經系統(tǒng)疾病，陳功教授團隊使用AAV在缺血性腦卒中小鼠與猴的皮質中實現(xiàn)了過表達NeuroD1，成功將星形膠質細胞轉分化為神經元［39，46］；在亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease，HD）模型小鼠紋狀體中，實現(xiàn)了同時過表達NeuroD1和Dlx2將星形膠質細胞轉分化為神經元［47］；在脊髓挫傷、刺傷（stab wound lesion）小鼠模型脊髓背角中實現(xiàn)了過表達NeuroD1或同時過表達NeuroD1和Dlx2，將星形膠質細胞轉分化為脊髓神經元亞型，并能整合入脊髓神經環(huán)路中［48］。針對以神經元過度興奮和突然同步放電為特征的癲癇［49］，陳功教授團隊成功運用基于NeuroD1過表達的膠質細胞-神經元轉分化的神經再生型基因療法，將顳葉癲癇模型大鼠的海馬腦區(qū)的星形膠質細胞原位轉分化為抑制性中間神經元，有效地降低了癲癇發(fā)作，為難治性顳葉癲癇的治療帶來了新希望［50］。針對星形膠質細胞來源的惡性膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM），陳功教授團隊通過NeuroD1在體外將人膠質母細胞瘤細胞轉分化為VGluT3+的谷氨酸能神經元，為膠質母細胞瘤的治療提供了新的可能［51］。

眾多研究結果展現(xiàn)了通過過表達NeuroD1操縱星形膠質細胞命運，使其高效轉分化為神經元的可能性，以及這一手段在臨床應用中的巨大潛在前景。然而近期，過表達NeuroD1誘導星形膠質細胞-神經元轉分化的可能性受到了質疑與廣泛討論。德州州立大學西南醫(yī)學中心張春立教授認為，由于基因編輯技術的缺陷，僅僅依據病毒表達的熒光報告基因（例如GFP或mCherry）作為判定新生神經元來源，并不能作為轉分化的金標準：AAV病毒攜帶的基因可能串聯(lián)或重組，導致NeuroD1序列對于熒光報告基因原本應有的順式調節(jié)作用變成一種類似于反式調節(jié)作用，導致熒光報告基因的異常表達［52］；同時由于AAV、慢病毒會發(fā)生泄漏，因此報告基因能夠表達在原位神經元中，而非被基因編輯的星形膠質細胞中［52］。張春立教授團隊還通過譜系追蹤法等多種手段證明，“轉分化的神經元”在譜系追蹤中無法追溯至過表達NeuroD1的星形膠質細胞，而是來源于本就存在的原位神經元［53］。面對質疑，陳功教授團隊通過轉錄組測序（RNAsequencing）等手段發(fā)現(xiàn)NeuroD1在星形膠質細胞向神經元轉分化的過程中發(fā)揮出強大的驅動力，并觸發(fā)了快速的轉錄組學變化［54］。同時他們利用雙光子活體成像展示了星形膠質細胞（包括譜系追蹤膠質細胞）逐步轉化為神經元的過程，并發(fā)現(xiàn)NeuroD1在不同腦區(qū)中誘導轉分化形成不同類型的神經元，再次驗證了過表達NeuroD1可以誘導星形膠質細胞向神經元轉分化的結論［55］。陳功教授認為，張春立教授團隊未能成功將星形膠質細胞轉分化為神經元有多種可能原因，包括：a.AAV滴度超過安全劑量導致神經元泄漏與膠質細胞損傷；b.轉分化現(xiàn)象觀察窗口期過短導致現(xiàn)象未出現(xiàn)；c.NeuroD1表達量不足以克服tdTomato標記的星形膠質細胞的轉分化阻力等［56］。目前，盡管通過過表達NeuroD1誘導星形膠質細胞向神經元轉分化這一手段表現(xiàn)出令人期待的潛力，但NeuroD1過表達能否使星形膠質細胞向神經元轉分化的問題仍在探討，且NeuroD1如何介導星形膠質細胞-神經元轉分化的分子機制也未被明確解答，再加上AAV、慢病毒、逆轉錄病毒的使用可能導致一系列臨床安全問題，NeuroD1距離真正應用于臨床仍然道阻且長。

Table 1 Results of neuroregenerative therapy based on overexpression of NeuroD1 in disease models表1基于過表達NeuroD1的神經再生療法在疾病模型中的研究成果

不同于上述將神經元命運決定相關轉錄因子上調的“加法”策略，“減法”策略旨在通過在非神經元細胞中敲低在神經分化過程中自然下調的關鍵抑制性轉錄因子來誘導生成神經元?！皽p法”策略中備受關注的轉錄因子是多嘧啶區(qū)結合蛋白（recombinant polypyrimidine tract binding protein，

Ptbp）。Ptbp是一類核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）聚嘧啶區(qū)結合蛋白，在哺乳動物中包括Ptbp1~3三個成員。其中Ptbp1在哺乳動物除神經元外的大多數組織細胞中表達，能夠調節(jié)可變剪接、信使RNA（messenger RNA，mRNA）翻譯與mRNA穩(wěn)定性等，從而維持神經元基因主要抑制因子的活性，抑制細胞向神經元分化的傾向［57］。敲減Ptbp1是將成纖維細胞轉分化為神經元的充分且必要的條件［58］，利用小發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）在星形膠質細胞中敲減Ptbp1，也能夠將其轉分化為功能性神經元，并可在PD小鼠模型中誘導產生新的有功能的DA能神經元、重建受損神經環(huán)路、恢復紋狀體多巴胺水平，并有效挽救DA能神經元損失，減輕PD小鼠模型的運動功能障礙［59-60］，在老年小鼠中也完成了神經元的轉分化和功能整合［61］。使用CRISPR-CasRx系統(tǒng)將Müller膠質細胞中的Ptbp1基因敲減，也被證明在完整和受損的成熟視網膜中將膠質細胞在體轉分化為視網膜神經節(jié)細胞，并建立中央投射，在藥物性視網膜損傷的小鼠模型中部分恢復了視覺功能［60］。這些研究為膠質細胞轉分化為神經元提供了新的思路、手段與證據，為PD及其他神經退行性疾病提供了極具前景的治療策略和方法。

針對Ptbp1，許多團隊亦發(fā)文表示需要重新審視通過敲減Ptbp1誘導星形膠質細胞轉分化的可能。在兩種譜系小鼠皮層中運用CRISPR-CasRx進行敲減時，未觀測到內源Ptbp1表達量的明顯降低，也沒有在譜系追蹤時觀察到膠質細胞轉分化為神經元的現(xiàn)象［53］；使用shRNA進行敲減時，雖然觀測到內源Ptbp1敲減，但未觀測到譜系標記的星形膠質細胞轉分化為神經元［53］；通過CRISPRCasRx或shRNA敲減Ptbp1都無法將Müller膠質細胞轉分化為視網膜神經節(jié)細胞［62］；星形膠質細胞特異性譜系追蹤下通過shRNA和反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）敲減Ptbp1均無法在生理或PD病理狀態(tài)下，將星形膠質細胞直接轉分化為DA能神經元并改善小鼠運動障礙［63］；利用遺傳譜系示蹤和單細胞測序譜系追蹤，通過傳統(tǒng)基因編輯方法進行Ptbp1敲除，同樣未能觀測到視網膜Müller膠質細胞或皮層、紋狀體的星形膠質細胞向神經元轉分化［64］。約翰·霍普金斯大學Seth Blackshaw教授認為，之前研究成果中觀察到的失明小鼠的視覺恢復和PD小鼠的行為恢復可能是特異性啟動子GFAP在內源性神經元中的異位表達或在Ptbp1的脫靶效應所致［65］。針對Ptbp1的討論仍在繼續(xù)，盡管質疑聲頻起，但Ptbp1在胚胎發(fā)育的過程中的確對神經分化表現(xiàn)出十分有力的抑制作用［66］，故而敲減Ptbp1誘導星形膠質細胞向神經元轉分化具備一定的理論可行性，此后的實驗中應秉著更加審慎的態(tài)度持續(xù)探究與探討。

2 小膠質細胞-神經元轉分化的研究進展

盡管星形膠質細胞數量多，且與神經元同為神經外胚層譜系的成員，但其再生能力相對較弱［67］。相較而言，小膠質細胞是分布在整個中樞神經系統(tǒng)的常駐免疫細胞，再生能力十分強大，且腦外傷、腦卒中、神經退行性疾病等病理改變均能夠引起其大量的激活和增殖［68］。另外，小膠質細胞的消除基本不會在健康成年小鼠引起明顯的副作用，反而能在病理狀態(tài)下一定程度上通過減輕小膠質細胞引起的炎癥而緩解中樞神經系統(tǒng)疾病的病理改變［68］。因此，近兩年學者們將目光投向了小膠質細胞，對其是否具備轉分化為神經元的潛能進行了研究和探討。

2019年，九州大學Nakashima團隊實現(xiàn)了通過慢病毒在小膠質細胞內過表達NeuroD1，在體外、體內都成功誘導了小鼠小膠質細胞轉分化為表達Tuj1與MAP2ab等神經元標志物，有神經元基本特性且與原代神經元基因表達譜一致的神經元［69］（圖2）。在轉分化成功的神經元中，VGluT1+的谷氨酸能神經元占比約75%，GAD67+的GABA能神經元占比約25%［69］。在分子層面，NeuroD1的過表達能夠通過調節(jié)組蛋白修飾與DNA甲基化水平，通過表觀遺傳調控神經元轉錄激活Scrt1與Meis3兩種轉錄因子，再通過轉錄抑制Mafb與Lyl1兩種小膠質細胞免疫相關基因，加速小膠質細胞特性的消失［69］。這一研究首次提出了小膠質細胞轉分化為神經元的可能，使神經原位再生與細胞替代療法有了新的潛在選擇，具有較高的臨床價值與轉化意義。

然而也有觀點認為，小膠質細胞屬于單核細胞系，由胚胎早期卵黃囊髓系祖細胞分化產生［8］，而神經元屬于神經外胚層譜系，由RGs分化產生［70］，與小膠質細胞發(fā)育譜系差別較大，小膠質細胞不具備向神經元轉分化的理論可行性［68］：包括NeuroD1在內的轉分化誘導因子均在神經外胚層譜系RGs分化的過程中參與決定細胞的命運［42］，并不表達在小膠質細胞所在的髓系譜系中，所以髓系譜系中不一定存在支撐神經外胚層譜系細胞命運決定的下游元件。2021年，有研究通過譜系追蹤和活細胞成像等技術發(fā)現(xiàn)，使用慢病毒過表達NeuroD1，無法誘導小膠質細胞轉分化為神經元，反而表達NeuroD1的小膠質細胞發(fā)生大規(guī)模死亡［68］。這也印證了之前陳功教授團隊亦無法通過NeuroD1誘導小膠質細胞向神經元轉分化的結果［44］。針對NeuroD1能否誘導小膠質細胞轉分化的討論仍在繼續(xù)，如若成功，小膠質細胞向神經元的轉分化這一手段的臨床應用前景巨大。

3 NG2膠質細胞與少突膠質細胞-神經元轉分化的研究進展

少突膠質前體細胞（OPCs，也稱為NG2膠質細胞），作為成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中最常見的祖細胞，終身具備增殖分化的能力，能夠隨時重新激活增殖，或分化為少突膠質細胞或星形膠質細胞［71］。相較星形膠質細胞，NG2膠質細胞具備卓越的增殖分化能力，可能成為源源不斷的原料；而相較小膠質細胞，NG2膠質細胞與神經元譜系一致，向神經元轉分化的可行性更高。因此，NG2膠質細胞走入神經再生領域學者的視野，成為誘導向神經元轉分化的優(yōu)良候選對象（圖2）。

學者們同樣希望通過特異性高表達神經元的轉錄因子或拮抗NG2膠質細胞中抑制神經元命運的轉錄因子，誘導NG2膠質細胞轉分化為神經元。性別決定區(qū)Y盒蛋白2（sex-determining region Ybox2，Sox2）在神經發(fā)育中，對神經干細胞特性的維持及神經元亞型的分化中起重要作用［72］。在刺傷后的小鼠大腦皮質中利用逆轉錄病毒單獨過表達Sox2或同時過表達Sox2與Ascl1，可誘導NG2膠質細胞轉分化為DCX+的神經元［73］。隨后，Sox2的上調也被發(fā)現(xiàn)能在脊髓損傷中誘導NG2膠質細胞重編程為神經元，并促進新生神經元與神經通路形成突觸連接與脊髓損傷后的功能恢復［74］。此外，在成年小鼠紋狀體NG2膠質細胞中利用慢病毒同時過表達Ascl1、Lmx1a和Nurr1，能夠將其轉分化為GABA能和谷氨酸能神經元，并長時間保持穩(wěn)定的功能性神經元電生理特性［75］。

在星形膠質細胞與小膠質細胞中爭議頗多的NeuroD1與Ptbp1兩種因子，也在NG2膠質細胞與少突膠質細胞的轉分化中受到關注。通過過表達NeuroD1，可以將體外培養(yǎng)的小鼠皮層NG2膠質細胞和腦外傷小鼠的皮層NG2膠質細胞，轉分化為有功能的谷氨酸能和GABA能神經元［44］；通過慢病毒轉染體外培養(yǎng)的小鼠皮層少突膠質細胞過表達NeuroD1，也能將其轉分化為NeuN和MAP2ab雙陽性的神經元［69］。在小鼠紋狀體少突膠質細胞中敲減Ptbp1，成功誘導其轉分化為表現(xiàn)出正常電生理特性的成熟神經元［76］。目前，NG2膠質細胞/少突膠質細胞-神經元轉分化似乎已成為膠質細胞-神經元轉分化中爭議最少的部分，未來可能為中樞神經系統(tǒng)疾病，尤其是脊髓相關疾病帶來新的希望。

Fig.2 Glial cell-neuron conversion圖2膠質細胞-神經元的轉分化

4 討論與展望

使用干細胞重編程（reprogramming）為神經元，是最早嘗試的以補充丟失神經元為治療策略的研究方向。已有研究發(fā)現(xiàn)，人和小鼠源的骨髓來源的間充質干細胞（bone marrow-derived stromal mesenchymal stem cells，BMSCs）可在體外、體內分化，重編程為神經元［77-78］，人與小鼠源的成纖維細胞等體細胞經誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）狀態(tài)重編程為神經干/祖細胞后并最終分化為功能性神經元［79-82］。雖然這些研究成果，均為疾病狀態(tài)下神經元再生的治療策略奠定了基礎［83］，但體外重編程耗時長而移植窗口短，體內重編程難以實現(xiàn)，同時誘導多能干細胞向神經元的分化存在效率低、整合難、易癌變和高免疫原性等問題，極大地降低了其臨床轉化性［84-87］。

目前，使用星形膠質細胞、小膠質細胞、NG2膠質細胞等神經膠質細胞，在離體或在體模型上向神經元的轉分化，均已取得一定的研究進展，也是目前神經再生領域的熱門話題。就目前的研究進展而言，膠質細胞存在實現(xiàn)在體、原位、安全轉分化為神經元的可能，一旦實現(xiàn)穩(wěn)定高效的神經膠質細胞-神經元轉分化，將為神經系統(tǒng)疾病的治療帶來新的希望。

星形膠質細胞和NG2膠質細胞是神經外胚層譜系分化而來的神經膠質細胞，研究者們已成功利用多種手段將其誘導為新生神經元，整合到現(xiàn)有的神經元回路中在體內形成正確連接，并在一些突出的神經系統(tǒng)疾病（包括PD、AD和HD）的小鼠模型上，實現(xiàn)了基于星形膠質細胞/NG2膠質細胞轉分化神經元再生的可行性。與此同時，研究者們對在星形膠質細胞內過表達NeuroD1或敲減Ptbp1等部分轉錄因子的編輯，是否具備介導轉分化的功能、對現(xiàn)有研究在實驗設計的合理性與邏輯性等問題存疑，因此通過操縱NeuroD1和Ptbp1的表達，進而誘導膠質細胞向神經元轉分化的可行性仍在探討。

值得思考的是，在轉分化的誘導過程中，使用病毒載體插入整合的手段進行轉錄因子的過表達或敲減，不僅存在很大的不確定性（如病毒攜帶基因插入方向不定、基因可能存在串聯(lián)、病毒可能發(fā)生泄漏等），也可能存在巨大的安全風險（載體基因組整合入人類基因組易致瘤等）［87-88］。以上問題，為科學研究結果結論是否精準與可重復，以及臨床應用是否靶向與安全帶來隱患。因此，如更改轉錄因子的遞送手段，改用細胞因子或化合物以納米材料為載體進行定向投遞等手段取代基因治療途徑，改變膠質細胞表達譜，將其誘導為神經元，或許能增加解決目前在安全性和倫理上遇到的瓶頸問題。

另外，現(xiàn)有研究多使用標志物共表達的實驗判定新生神經元的來源，但受限于現(xiàn)存遞送技術的高滴度依賴性與易發(fā)生泄漏等缺陷，標志物共表達也許不再是證明神經元來源的最佳判斷標準。因此，使用并基于需求開發(fā)更加精準的技術，驗證新生神經元的來源是平息質疑與進行進一步探索的最優(yōu)選擇。譜系追蹤，是目前干細胞領域的“金標準”，且目前中樞神經系統(tǒng)內全部膠質細胞種類都可以使用基于Cre-loxP系統(tǒng)的報告基因進行永久追蹤，因此使用譜系追蹤等方式，或許能夠更加嚴謹的論證新生神經元的來源［52］。目前，星形膠質細胞/NG2膠質細胞-神經元轉分化中各因子的作用機制尚不完全明確，且大多在非靈長動物和體外培養(yǎng)的人膠質細胞內實踐，因此，在這一領域中，以下問題亟待進一步探索：a.安全高效的因子遞送手段的開發(fā)；b.膠質細胞成功轉分化為神經元的判定標準的確立；c.誘導因子在轉分化過程中作用機制的探索；d.在靈長動物和人腦中重復結論。

相對于與神經元同譜系的兩種膠質細胞，小膠質細胞向神經元轉分化則道阻且長。盡管有研究提出小膠質細胞向神經元轉分化的可能，但針對小膠質細胞向神經元轉分化的理論與實驗證據都顯得較為匱乏，只有嚴謹明確的譜系追蹤、設計合理的對照組、明確的活體/活細胞成像證據與殺死該細胞后轉分化現(xiàn)象的消失，才能證明膠質細胞-神經元轉分化現(xiàn)象的真實存在［68］。目前，小膠質細胞能夠通過某種誘導轉分化為神經元的論斷仍未得到公認。未來應設計更加嚴謹合理的研究思路，通過更加科學準確的技術手段，獲取更加翔實確鑿的實驗證據，以確定小膠質細胞-神經元轉分化的可能性。

總而言之，膠質細胞-神經元轉分化的研究正迅速發(fā)展，并已經取得一系列顯著的成果。盡管目前針對一些研究存在部分質疑，但討論與質疑是推動科學發(fā)展的原動力，相信在未來這一領域的面紗終將揭開，膠質細胞-神經元轉分化的研究也終將為中樞神經系統(tǒng)疾病的患者帶來福音。