劉廣林 李虎 吳子帥 羅群昌 李秋雯 朱其南 陳傳華

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007；第一作者：350595613@qq.com；*通訊作者：chenchuanhua@gxaas.net）

隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對優(yōu)質(zhì)稻米的需求不斷擴(kuò)大，并呈多樣化。香米由于具有獨(dú)特的香味，深受消費(fèi)者青睞，其市場價(jià)格也比普通大米高出許多，這也為香稻研究和推廣提供了更廣闊的市場前景[1]。香味被認(rèn)為是一種重要的稻米品質(zhì)指標(biāo)[2]，香味的遺傳規(guī)律以及香味物質(zhì)的研究已取得較大進(jìn)展。多數(shù)研究者認(rèn)為，香味是由位于水稻第8號染色體上1個(gè)隱性基因控制，研究證實(shí)是Badh2基因。Badh2基因全長1 509 bp，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，編碼503個(gè)氨基酸。該基因在不同部位的缺失或插入會(huì)引起B(yǎng)adh2基因功能的喪失，導(dǎo)致產(chǎn)生米香物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP），從而使水稻表現(xiàn)為有香味[3]。目前發(fā)現(xiàn)，Badh2基因在不同的香稻品種中存在多種類型的突變，以第7外顯子有1個(gè)8 bp的缺失和3個(gè)3 bp突變[4]最為常見，還有第4和第5外顯子之間存在803 bp的缺失[5]、第12外顯子處有1個(gè)3 bp的缺失[6]、第13外顯子中插入3 bp[7]、第2外顯子有1個(gè)7 bp的缺失[8]，以及5'UTR區(qū)3 bp的缺失[9]，這些變異類型已開發(fā)出Indel2[10]、In－Del4-5[5]、GRFM04[1]、FME12[6]、Indel13[7]、FMU1-2[9]等 功能標(biāo)記。本研究利用這些功能標(biāo)記對廣西近年育成的9個(gè)香稻品種的香味基因變異類型進(jìn)行鑒定，并對這些品種的香味進(jìn)行測定，以為香稻品種的推廣及其在育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以廣西近年通過審定的9個(gè)常規(guī)香稻品種為試驗(yàn)材料。這9個(gè)品種均為秈稻品種，分別是八桂香、田東香、百香139、桂茉香1號、中廣香1號、桂野豐、廣糧香2號、桂香18、桂香99和廣糧香占。非香對照品種為常規(guī)秈稻油占8號。所有參試品種均于2019年晚季播種在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所同一試驗(yàn)大田中，每個(gè)品種種植5行，每行12株，株行距13 cm×23 cm。整個(gè)生長時(shí)期采用普通大田常規(guī)栽培管理，每個(gè)材料隨機(jī)5株混合采樣。

1.2 分子標(biāo)記法鑒定香稻香味基因型

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

等位基因Badh2-E2為Badh2基因第2外顯子7 bp缺失，采用InDel2功能標(biāo)記；Badh2-E4-5等位基因?yàn)榈?～第5外顯子803 bp缺失，采用inDel4-5功能標(biāo)記；Badh2-E7等位基因?yàn)榈?外顯子8 bp缺失和3 bp突變，采用GRFM04功能標(biāo)記；Badh2-E12為第12外顯子處有1個(gè)3 bp的缺失，采用FME12功能標(biāo)記；Badh2-E13等位基因?yàn)榈?3外顯子3 bp插入，采用InDel13功能標(biāo)記；Badh2-UTR等位基因?yàn)?'UTR區(qū)3 bp的缺失，采用FMU1-2功能標(biāo)記。上述6個(gè)引物信息詳見表1，均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 badh2基因引物序列信息表

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的檢測

DNA提取采用CTAB法[11]，PCR擴(kuò)增參照SHAO等[5]方法進(jìn)行，PCR產(chǎn)物用8%垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用0.2%硝酸銀快速染色觀察拍照。

1.3 香味物質(zhì)2-AP含量的測定

稻谷收獲后曬干，委托華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院測定2-AP含量。具體方法如下：稱取5 g研磨好的樣品放入玻璃瓶，加入10 mL色譜純二氯甲烷，蓋上密封圈，擰緊瓶蓋稍許震蕩搖勻，放入注滿水的超聲波清洗機(jī)，40 kHz、40℃超聲240 min。取出樣品瓶冷卻至室溫，加適量無水亞硫酸鈉后立即用2 mL菌注射器吸取上清液并通過有機(jī)型針頭過濾膜（孔徑0.22μm，13 mm）將上清液注入頂空樣品瓶，加入2μL濃度為0.0917 g/L的2,4,6-三甲基嘧啶（TMP）作為內(nèi)標(biāo)物，立即采用島津GC-MSQP2010plus型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行氣相質(zhì)譜測定。色譜條件：色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS，長度為30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25μm，柱溫升溫程序?yàn)椋?0℃保持1 min，以2℃/min的速率升溫至65℃，保持1 min，然后以10℃/min的速率升溫至220℃，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%）；恒壓不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量為2μL。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度為200℃，離子化能量為70eV，接口溫度為250℃，四級桿溫度為150℃，全掃描方式，掃描質(zhì)量范圍35-160m/z。

1.4 香味綜合評分

稻谷收獲后曬干，委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心檢測，依據(jù)為NY/T 596-2002《香稻米》，主要評價(jià)供試樣品稻米香味強(qiáng)度、香味風(fēng)味、滯留度的強(qiáng)度和時(shí)間以及綜合印象。稻米香味強(qiáng)度、香味風(fēng)味鑒別方法：取稻米2 g放入125 mL細(xì)口具塞棕色玻璃瓶，加50 mL蒸餾水，蓋上瓶蓋后放入沸水浴15 min，移出玻璃瓶稍加冷卻，輕輕搖晃，打開瓶蓋，閉上嘴，用鼻子吸嗅蒸汽進(jìn)行評價(jià)。香味滯留度和綜合印象的鑒別方法：稱10 g稻米樣品于鋁盒中，用清水?dāng)嚢杼韵?，適量加水浸泡30 min，于蒸飯鍋內(nèi)加水加熱至沸騰，再將加蓋鋁盒置于蒸屜上，繼續(xù)加熱并開始計(jì)時(shí)，蒸煮40 min后停止加熱，燜10 min，打開盒蓋，取出米飯少許放入口中，一邊咀嚼一邊在吸氣過程中用鼻后嗅覺法進(jìn)行評價(jià)。4項(xiàng)評分之和為樣品的香味綜合評分，以泰國香米為對照（85分）。香味綜合評分＜60分的不能作為香稻米。

1.5 香味類型的鑒定

參考王冠軍等[12]及NY/T596-2002《香稻米》的方法，并結(jié)合多年香味育種實(shí)踐將水稻香味分為烤面包香型、爆米花香型、茉莉香型、芋頭香型及萵苣香型。具體分類標(biāo)準(zhǔn)如下：烤面包香型具有烤面包和香鍋巴的香味，香氣怡人，香味純厚；爆米花香型有清香味，香味純正，比烤面包香型的香味輕快；茉莉香型有清香氣味，且有輕微的香肥皂化香味，極少數(shù)人不樂于接受，如KDML105；芋頭香型有芋頭清香；萵苣香型有萵苣清香。稻谷收獲后曬干，取170 g用小型精米機(jī)碾成精米，取稻米2 g放入125 mL細(xì)口具塞棕色玻璃瓶中，加50 mL蒸餾水，蓋上瓶蓋后放人沸水浴中15 min，移出玻璃瓶稍加冷卻。評價(jià)前應(yīng)先將盛有樣品的棕色玻璃瓶輕輕搖晃，然后將瓶逐個(gè)打開，閉上嘴，用鼻子吸嗅蒸氣，評價(jià)并記錄每一種樣品的香味類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 9個(gè)廣西香稻品種的香味及香味類型

從表2可見，9個(gè)品種中除桂野豐的香味類型為芋頭香型外，其他8個(gè)品種均為爆米花類型；9個(gè)品種香味綜合評分差異不大，在74～79分之間，均可判定為香稻品種；9個(gè)品種的2-AP含量在60～128μg/kg之間，均可判定為香稻品種。

表2 9個(gè)廣西常規(guī)香稻品種的香味及香味類型

2.2 9個(gè)廣西香稻品種香味基因變異類型

2.2.1 功能標(biāo)記GRFM04的檢測

以9份廣西香稻品種和1份常規(guī)秈稻品種（非香對照）的基因組DNA為模板，利用Badh2基因功能標(biāo)記GRFM04進(jìn)行PC R擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物采用凝膠電泳進(jìn)行檢測。田東香、八桂香、百香139、中廣香1號、桂野豐、桂香18、桂香99和廣糧香占均能夠擴(kuò)增出201 bp帶型，桂茉香1號及非香對照油占8號僅擴(kuò)增出209 bp帶型（圖1），說明田東香等8個(gè)香稻品種在Badh2基因的第7外顯子處存在1個(gè)8 bp的缺失片段和3 bp的突變，它們屬于同一種香味基因的突變類型，而桂茉香1號不屬于此種突變類型。

圖1 9個(gè)香稻品種的GRFM04分子標(biāo)記檢測結(jié)果

2.2.2 功能標(biāo)記FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13檢測

以9份廣西香稻品種和1份常規(guī)秈稻品種（非香對照）的基因組DNA為模板，利用Badh2基因功能標(biāo)記FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13進(jìn)行PC R擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物采用凝膠電泳分別檢測。檢測結(jié)果表明，利用Badh2基因功能標(biāo)記FMU1-2、InDel2、InDel4-5、FME12和InDel13都只擴(kuò)增出1條帶，大小分別為163 bp（圖2A）、107 bp（圖2B）、1123 bp（圖2C）、192 bp（圖2D）和194 bp（圖2E）的片段，說明這9個(gè)香稻品種在Badh2基因的5’UT R區(qū)和第2、4、5、12、13外顯子處均不存在突變，它們都不屬于這種香味基因突變類型。

圖2 9個(gè)香稻品種的FMU1-2（A）、InDel2（B）、InDel4-5（C）、FME12（D）和InDel13（E）分子標(biāo)記檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前常用水稻香味表型鑒定方法有咀嚼法、熱水法、氫氧化鉀法和儀器測定法等。其中，咀嚼法、熱水法、氫氧化鉀法主要是通過嗅覺及味覺感官來鑒定，方法簡單但速度慢，樣品多時(shí)誤差較大?，F(xiàn)在用得較多的儀器測定法主要是利用氣相色譜儀測定2-AP含量[12]。本研究委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心對供試品種進(jìn)行香味綜合評分評定，委托華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院對供試品種香氣的主要成分2-AP含量進(jìn)行測定，香味綜合評分主要通過感官法進(jìn)行，2-AP含量測定屬儀器測定法，兩種方法在香與非香方面判定結(jié)果基本一致，感官法9個(gè)品種的香味評分均大于60分，儀器檢測法均檢測到2-AP的存在，兩種方法均能判定9個(gè)供試品種為香稻品種；在香味濃淡方面，用感官法檢測出各供試品種香味綜合分?jǐn)?shù)值在74～79分之間，差異不大；用儀器檢測法檢測到2-AP含量則在60～128μg/kg之間，含量最高的品種是最低品種的2倍左右。目前尚未有將2-AP含量與香味濃淡程度相互匹配的標(biāo)準(zhǔn)，無法判斷人的感官對2-AP含量在60～128μg/kg之間的感知是否相近，這有待進(jìn)一步研究。2-AP含量在水稻中很低，儀器能檢測到的微小量而人的器官并不一定能感覺到，因此，儀器檢測法對香味鑒定更有優(yōu)勢，但要鑒定香味的濃淡，仍需開展進(jìn)一步研究，弄清人們能感受到濃香、香、微香所對應(yīng)的2-AP含量范圍，并制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

分子標(biāo)記輔助選擇能夠有針對性的進(jìn)行性狀改良，進(jìn)行多基因聚合，具有提高選擇效率和縮短育種年限的明顯優(yōu)勢[13]。由于香味為隱性基因控制的性狀，且在香稻的雜合株型中，香味是以粒為單位分離，既有香粒，也有不香粒，利用標(biāo)記檢測還能有效避免含有香味基因的優(yōu)良雜合個(gè)體在選擇過程中被淘汰[14]，目前已有不少應(yīng)用香型分子標(biāo)記輔助選育出香型水稻新品種的報(bào)道[15-18]。弄清育種親本的香味基因變異類型是開展香型分子標(biāo)記輔助育種的關(guān)鍵。曾宇等[19]對179份廣西特色香稻地方品種香味基因型進(jìn)行鑒定，檢測出InDel7等位基因類型40份、InDel4-5等位基因37份、InDel2等位基因1份，但該179份供試香稻材料多為地方粳糯稻品種。本研究中9個(gè)供試香稻品種均為廣西生產(chǎn)上曾經(jīng)或正在大面積推廣的香稻品種，亦為廣西香稻育種常用親本，研究結(jié)果表明，八桂香等8個(gè)香稻品種為第7外顯子缺失8 bp變異類型，這種基因型是香稻品種中最常見的變異類型。KOVACH等[20]對117個(gè)水稻品種進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)第7外顯子缺失8 bp這種基因型占到被測樣品的79.5%。針對這種變異類型 已 經(jīng) 開 發(fā) 了GRFM04[2]、InDel7[10]、YY5-YY8[14]、PMFGR[21]多種功能標(biāo)記，可利用現(xiàn)有的功能標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記選擇加快香稻新品種的選育進(jìn)程。而桂茉香1號香味評分75分、2-AP含量74.83μg/kg，但卻不屬于本研究檢測的6種Badh2基因變異類型，有可能是Badh2基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的其他變異類型或者是Badh2基因尚未發(fā)現(xiàn)的新等位基因類型，也有可能是新的香味基因，有待進(jìn)一步研究。