鄭秋樺，李富鑫，劉廣源，龐彥韜，黎曉漩，曾松榮

（韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

0 引言

礦業(yè)廢棄地一般是指礦山開采活動(dòng)產(chǎn)生的廢石和選礦產(chǎn)生的尾礦等大量堆存，沒有經(jīng)過整治而無法使用的土地。這些廢石和尾礦等經(jīng)風(fēng)化淋濾后會(huì)將有害的重金屬轉(zhuǎn)移到土壤中，造成礦業(yè)廢棄地土壤酸化、重金屬毒性和氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)元素缺乏，植物無法生長(zhǎng)。這種裸露的礦業(yè)廢棄地因缺乏植被覆蓋，水土流失嚴(yán)重，會(huì)成為持久的污染源，對(duì)下游及周邊地區(qū)環(huán)境造成影響，導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，并可能通過食物鏈危及人類健康。礦業(yè)廢棄地的生態(tài)恢復(fù)已成為我國(guó)當(dāng)前所面臨的緊迫任務(wù)之一，其修復(fù)的關(guān)鍵是植被恢復(fù)，因?yàn)橹脖换謴?fù)能夠增加地表穩(wěn)定性，控制重金屬和水土流失，還能改善土壤的營(yíng)養(yǎng)狀況。同時(shí)，植被恢復(fù)后的土壤中的重金屬還避開了食物鏈，不會(huì)影響人體健康，因而植被恢復(fù)具有良好的環(huán)境、生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)多方面的綜合效益。然而廢石堆和尾礦庫(kù)等礦業(yè)廢棄地因?yàn)閲?yán)重酸化、重金屬毒性和養(yǎng)分缺乏等眾多的理化因素，限制了植物在廢棄地上定居和生長(zhǎng)，植被的自然恢復(fù)非常緩慢，只有對(duì)其采取積極的人工恢復(fù)措施加以干預(yù)，才能對(duì)土壤的重金屬污染進(jìn)行有效治理[1]。

已有研究表明，植物內(nèi)生菌可以通過它們自身的代謝活動(dòng)促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)，提高植物抗逆性，增強(qiáng)植物重金屬耐性[2-3]。例如，鐵載體是由微生物產(chǎn)生的高親和力低分子量的金屬螯合劑，除了螯合Fe 外，鐵載體還可與Pb、Zn 和Cr 等重金屬離子形成配合物，影響重金屬的存在方式，有利于植物根系對(duì)Fe等元素的吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[4-6]。磷元素在土壤環(huán)境中以無機(jī)磷和有機(jī)磷兩種形式為主，而環(huán)境中的溶磷微生物可產(chǎn)生特殊物質(zhì)使土壤的無機(jī)磷溶解，從而有利于植物對(duì)磷的吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。同時(shí)，微生物還可以分泌植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）等調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)與發(fā)育[7]。

本研究的前期工作中，已從粵北地區(qū)凡口鉛鋅礦廢棄地自然生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)植物中分離出內(nèi)生真菌，并篩選出抗鉛、鋅重金屬離子能力較強(qiáng)的抗性菌株。篩選出重金屬抗性較強(qiáng)菌株的目的是為了將這些菌株開發(fā)成菌劑施用到被重金屬污染的礦業(yè)廢棄地土壤，有利于促生菌株抵御重金屬的毒性，并能在土壤中存活，以及能順利地進(jìn)入宿主植物中。本研究擬以這些鉛、鋅重金屬抗性菌株為研究對(duì)象，篩選出對(duì)植物有促生長(zhǎng)作用的能產(chǎn)生鐵載體、溶磷和IAA 的內(nèi)生真菌。此項(xiàng)工作的開展可為今后利用植物與其共生的內(nèi)生真菌聯(lián)合修復(fù)礦區(qū)廢棄地重金屬污染，促進(jìn)植物在重金屬脅迫的不良環(huán)境下生長(zhǎng)，加快礦業(yè)廢棄地植被恢復(fù)，提高植被覆蓋率及防止水土流失奠定一定的基礎(chǔ)，對(duì)土壤重金屬污染的生態(tài)治理有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

采集粵北凡口鉛鋅礦廢棄地的優(yōu)勢(shì)植物香蒲（Typhaorientalis presl）、苦楝（Melia azedarach）、苧麻（Boehmeria nivea）和蓖麻（Ricinus communis）4 種優(yōu)勢(shì)植物，從這些優(yōu)勢(shì)植物中分離篩選出具有抗重金屬鉛、鋅能力的植物內(nèi)生真菌45 個(gè)菌株，本研究以這些重金屬抗性菌株作為植物促生長(zhǎng)菌株篩選的實(shí)驗(yàn)菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑配制方法

1）無機(jī)磷培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中各物質(zhì)的添加量如下：MnSO4·H2O 0.03 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L ，KNO30.76 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，蔗糖10 g/L，Ca3(PO)45.0 g/L。并將培養(yǎng)基的pH 值調(diào)整為7.5，配置后在115 ℃溫度下滅菌處理30 min。若加入瓊脂粉20 g/L，即可作為固體培養(yǎng)基。

2）無鐵查氏培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中各物質(zhì)的添加量如下：KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蔗糖30 g/L，NaNO32.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，并于115 ℃溫度下滅菌處理30 min。

3）Czapek 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中各物質(zhì)的添加量如下：KCl 0.5g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，蔗糖30 g/L，NaNO32.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，并于115 ℃下滅菌處理30 min。若加入瓊脂粉20 g/L，即可作為固體培養(yǎng)基。

4）PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中各物質(zhì)的添加量如下：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂粉15～20 g/L，并于115 ℃下滅菌處理30 min。

5）PDB（potato dextrose broth）培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中各物質(zhì)的添加量如下：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，并于115 ℃下滅菌處理30 min。

6）含氨芐青霉素的LB（luria-bertani）培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中各物質(zhì)的添加量如下：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L，并于121℃下滅菌處理20 min。待培養(yǎng)基冷卻至55～60 ℃時(shí)，加入適量無菌氨芐青霉素溶液，使培養(yǎng)基中氨芐青霉素的最終質(zhì)量濃度為100 mg/mL。若在此基礎(chǔ)上加入15～20 g/L 的瓊脂粉，則可配制成固體培養(yǎng)基。

7）CAS（chromeazurol S）檢測(cè)液的配制。首先稱取60.5 mg 鉻天青S 并加入到50 mL 蒸餾水中，待完全溶解后倒入10 mL 濃度為1 mmol/L 的氯化鐵和10 mmol/L 的鹽酸，混合搖勻作為A 液；再量取72.9 mg 十六氨基烷基溴化銨加入到40 mL 蒸餾水中，并在45 ℃水浴鍋中加熱溶解至澄清透亮，作為B 液，將A 液和B 液混合均勻即可得到CAS 檢測(cè)液。

8）鉬銻抗比色法試劑的配制。①鉬銻儲(chǔ)備液的配置：量取200 mL 蒸餾水倒入燒杯中，將燒杯放置在冷水中，然后沿著燒杯內(nèi)壁邊攪拌邊緩慢加入76.5 mL 濃硫酸，冷卻待用。稱取5 g 鉬酸銨溶于150 mL蒸餾水中，將冷卻后的硫酸溶液緩慢倒入與鉬酸銨溶液混勻，再用移液管吸取50 mL 質(zhì)量濃度為5 g/L 的酒石酸銻鉀溶液與硫酸鉬酸銨混合液混勻，最后定容至500 mL。②鉬銻抗混合顯色劑的配置：稱取750 mg 左旋抗壞血酸于燒杯中，并加入50 mL 上述已經(jīng)配制好的鉬銻儲(chǔ)備液，攪拌均勻后保存在棕色瓶中，此溶液的有效期為1 d。

9）Salkowski 試劑的配制。稱取1.2 g 氯化鐵置于燒杯中，然后加入30 mL 蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，之后邊攪拌邊沿著燒杯?nèi)壁緩緩倒入42.97 mL 濃硫酸，冷卻定容至100 mL。

1.1.3 藥品與試劑

UNIQ-10 柱式真菌基因組抽提試劑盒、PCR（polymerase chain reaction）擴(kuò)增試劑盒和SanPrep柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；pEASY-Blunt Cloning Kit 試劑盒和Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；L-色氨酸和吲哚乙酸，購(gòu)自上海展云化工有限公司；磷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，購(gòu)自鋼研納克檢測(cè)技術(shù)股份有限公司。硫酸錳、硫酸鎂、硝酸鉀、硫酸亞鐵、硝酸鉛、磷酸鈣等均為國(guó)產(chǎn)試劑，分析純。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)鐵載體菌株的篩選及活力測(cè)定[8-9]

1）產(chǎn)鐵載體菌株的初篩選。往每支試管中添加無鐵查氏液體培養(yǎng)基5 mL，并用115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。冷卻后，把供試的內(nèi)生真菌菌株接種至培養(yǎng)基中，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，一同放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后吸取150 μL 培養(yǎng)液和等體積的CAS 檢測(cè)液于96 孔板中混勻，靜置1 min，觀察結(jié)果。以空白培養(yǎng)基和等體積的CAS 檢測(cè)液混勻后為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示為藍(lán)色；以飽和EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid）溶液和等體積CAS 檢測(cè)液混勻后為陽性對(duì)照，結(jié)果顯示為紅色。若實(shí)驗(yàn)組顯示為藍(lán)色，則說明培養(yǎng)液不含鐵載體，表明該菌株不產(chǎn)生鐵載體；若實(shí)驗(yàn)組顯示為紅色或紫色，則說明培養(yǎng)液中含有鐵載體，表明該菌株產(chǎn)生鐵載體。

2）鐵載體活力測(cè)定。把初篩獲得的產(chǎn)鐵載體陽性菌株轉(zhuǎn)接到無鐵查氏液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)7 d，然后濾紙過濾，保留濾液。量取該過濾液5 mL，與等體積CAS 檢測(cè)液混勻，室內(nèi)靜置1 h，然后用蒸餾水調(diào)零，以分光光度計(jì)測(cè)定其OD680值，記為“As”；用相同方法測(cè)定對(duì)照樣品的OD680值，記為“Ar”，對(duì)照樣品為空白培養(yǎng)基與等體積CAS 檢測(cè)液混合的混合液。SU（Siderophoreunit）表示鐵載體活力大小，且SU=[(Ar-As)/Ar]×100%。若As/Ar<0.5，則表明菌株有較好的產(chǎn)鐵載體功能。

3）鐵載體化學(xué)結(jié)構(gòu)檢測(cè)。將5 mL 過濾液與等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鐵溶液混勻，若在420～450 nm 處有吸收值，則表明培養(yǎng)液中含有異羥肟酸型鐵載體。將5 mL 過濾液與等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鐵溶液混勻，若在495 nm 處有吸收值，則表明培養(yǎng)液中含有兒茶酚型鐵載體。量取3 mL 的過濾液，并添加1 mL 濃度為250 mmol/L 的硫酸銅溶液和2 mL pH 值為4 的醋酸鈉緩沖液混勻，若在190～280 nm 處有吸收值，則表明溶液中含有羧酸型鐵載體。

1.2.2 溶磷菌株的篩選及定量測(cè)定

1）溶磷菌株的初篩。將菌株分別接種到無機(jī)磷平板上，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，然后用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑（d）及溶磷圈直徑（D）。若D/d>1，則表明該菌株有較好的溶磷效果[10]。

2）有效磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。用質(zhì)量濃度為100μg/mL 的磷標(biāo)準(zhǔn)液，分別配制出0,10,20,30,40,50,60 μg/mL 的梯度溶液，用鉬銻抗比色法測(cè)出其OD660值，繪制有效磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）溶磷菌株的定量測(cè)定[11]。將初篩獲得的菌株接種到無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。將接種的搖瓶在28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)9 d。每天用pH 計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH 值，并用鉬銻抗比色法測(cè)定培養(yǎng)液的OD660值，連續(xù)測(cè)定9 d。最后根據(jù)有效磷標(biāo)準(zhǔn)曲線求出有效磷濃度。

1.2.3 產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）菌株的篩選及含量測(cè)定

1）產(chǎn)IAA 菌株的篩選。在已滅菌的盛有5 mL Czapek 培養(yǎng)基的試管中，添加100 μL 濃度為50 mmol/L 過濾除菌的L-色氨酸溶液，輕微搖勻，使培養(yǎng)基中L-色氨酸的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，并接種菌株。以空白培養(yǎng)基為對(duì)照組，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，然后吸取150 μL Salkowski 液和等量的培養(yǎng)液加入96 孔板中混勻，避光20 min 后觀察并記錄最終的顏色?？瞻着囵B(yǎng)基為陰性對(duì)照，并以質(zhì)量濃度為20 mg/L 的吲哚乙酸為陽性對(duì)照。溶液顏色變化越深，表明IAA 濃度越高[12-13]。

2）IAA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。配制質(zhì)量濃度依次為0,0.1,0.5,5.0,10.0,15.0,20.0 mg/L 的吲哚乙酸溶液，加入等體積Salkowski 溶液混勻，避光30 min。然后用分光光度計(jì)以蒸餾水加等量Salkowski 液調(diào)零，測(cè)定混合液的OD530值，繪制IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）IAA 的定量測(cè)定。把初篩得到的菌株接種到Czapek 培養(yǎng)基中，并且以空白培養(yǎng)基為對(duì)照組，在28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。濾紙過濾除菌絲體，保留上清液。吸取3 mL 上清液和等量Salkowski 液混勻，避光30 min 后用分光光度計(jì)測(cè)定其OD530值。根據(jù)IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線求出培養(yǎng)液中IAA 濃度[12-13]。

1.2.4 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

選取產(chǎn)鐵載體、溶磷和產(chǎn)IAA 能力較強(qiáng)的菌株作為代表性菌株，采用三點(diǎn)接法接種在Czapek 平板，28 ℃下恒溫培養(yǎng)57 d。依據(jù)光學(xué)顯微鏡所觀察到的菌株個(gè)體形態(tài)特征并結(jié)合其菌落形態(tài)特征，參照魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 植物內(nèi)生菌的ITS 序列分析

對(duì)產(chǎn)鐵載體、溶磷和產(chǎn)IAA 能力較強(qiáng)的菌株做ITS 序列分析，以確定其種屬關(guān)系。

采用UNIQ-10 柱式真菌基因組抽提試劑盒抽提供試菌株的基因組，通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的基因，再用SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收。回收后，用pEASY-Blunt Cloning Kit試劑盒構(gòu)建重組載體，并轉(zhuǎn)化至 Tans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化結(jié)束后進(jìn)行抗氨芐青霉素篩選。把抗性細(xì)菌進(jìn)行菌液PCR，若存在目的基因，則把菌液制作成凍存管送至生工生物工程（上海）股份有限公司廣州分公司做ITS 序列測(cè)定。

用BioEdit 剪切獲取ITS 序列，輸入NCBI（National Coalition Building Institute）數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast，選出相似度較高的基因序列。用MEGA7.0 進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰接法獲得目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而確定其種屬關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)鐵載體菌株的篩選

2.1.1 初篩結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)組的45 個(gè)植物內(nèi)生真菌菌株中，顯示紅色的說明培養(yǎng)液中含有鐵載體，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，共篩選得到可以分泌產(chǎn)生鐵載體的菌株32 個(gè)。

圖1 45 個(gè)菌株產(chǎn)鐵載體初篩結(jié)果Fig.1 Preliminary screening results of 45 strains of producing iron carriers

圖1中，第一列為陰性對(duì)照組，第二列為陽性對(duì)照組，自A3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株為XP3.2、XP3.3、XP3.4、XP3.14、XP3.17、XP3.18、XP3.20、XP4.1、XP4.5、XP4.7；自B3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株為XP4.8、XP4.10、XP6.1；自C3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株為XP2.1、XP2.8、XP2.9、XP3.21、XP4.3、XP4.12、XP4.30、XP5.4；自D3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株為WB-2、WB-3、WB-7、WB-9、WB-12、WB-14、WB-21、WB-22、WB-23；自E3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株為ZMP5-2、ZMP5-3、ZMP7-2、ZMZ5-3、ZMZ5-5、ZMZ5-7、ZMZ6-2、ZMZ6-5、ZMZ7-2；自F3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株為BM1、BM2、BM3、BM4、BM5、BM6。

2.1.2 鐵載體活力測(cè)定與化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)經(jīng)過初篩得到的32 個(gè)菌株再次進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)菌株ZMP7-2 和BM6 為假陽性菌株，其余30 個(gè)菌株產(chǎn)鐵載體活力與鐵載體化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 30 個(gè)陽性菌株鐵載體活力測(cè)定及類型鑒定結(jié)果Table 1 Determination results of iron carrier activity with the type identification of 30 positive isolates

由表1可知，根據(jù)比較As/Ar值發(fā)現(xiàn)，除XP2.9 外，其余菌株的As/Ar<0.5，表明有29 個(gè)菌株能產(chǎn)生活性較好的鐵載體分子。同時(shí)，除XP3.18 菌株外，其余29 個(gè)菌株所產(chǎn)的鐵載體主要類型為異羥肟酸型和兒茶酚型，或兩種鐵載體同時(shí)兼具型，這表明植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生一種或多種不同類型的鐵載體。

2.2 溶磷菌株的篩選

經(jīng)溶磷圈法篩選到3 個(gè)具有較好的溶磷作用的菌株，分別是菌株XP3.17、WB-7 和WB-21，結(jié)果如圖2所示，平板中菌落邊緣的透明圈即為溶磷圈。

圖2 菌株XP3.17、WB-7 和WB-21 溶磷篩選結(jié)果Fig.2 Screening results of phosphorus soluble strains XP3.17,WB-7 and WB-21

選取代表性菌株XP3.17 測(cè)定其有效磷濃度。菌株XP3.17 培養(yǎng)液中有效磷及pH 值變化曲線見圖3，可知培養(yǎng)液有效磷最大質(zhì)量濃度為72.864 μg/mL，最低pH 值為3.80。

圖3 菌株XP3.17 溶磷能力測(cè)定Fig.3 Determination of phosphorus solubility of strain XP3.17

從圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)液pH 值從第2 d 開始快速下降，在第4 d 后趨于平緩，不再發(fā)生劇烈變化，然而有效磷濃度卻隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，并在第6 d 達(dá)到最大值。這一結(jié)果表明，XP3.17 菌株在培養(yǎng)過程中通過代謝產(chǎn)生了某種酸性物質(zhì)，引起培養(yǎng)液的pH 值下降。然而有效磷濃度會(huì)隨著pH 值的下降而上升，表明了引起pH 值下降的酸性物質(zhì)可以有效地溶解磷酸鈣，這就表明植物內(nèi)生菌溶磷能力與其代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)存在一定關(guān)系。

2.3 產(chǎn)IAA 菌株的篩選

將培養(yǎng)液與等體積Salkowski 液混合均勻，靜置30 min 后的顯色結(jié)果如圖4所示，參照該圖第2 列的陽性對(duì)照，共篩選到18 個(gè)具有產(chǎn)IAA 能力的菌株。

圖4 45 個(gè)菌株中產(chǎn)IAA 菌株的篩選結(jié)果Fig.4 Screening results of 45 strains producing IAA

圖4中，第一列為陰性對(duì)照組，第二列為陽性對(duì)照組，自A3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株依次為XP3.2、XP3.3、XP3.4、XP3.14、XP3.17、XP3.18、XP3.20、XP4.1、XP4.5、XP4.7；自B3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株依次為XP4.8、XP4.10、XP6.1；自C3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株依次為XP2.1、XP2.8、XP2.9、XP3.21、XP4.3、XP4.12、XP4.30、XP5.4；自D3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株依次為WB-2、WB-3、WB-7、WB-9、WB-12、WB-14、WB-21、WB-22、WB-23； 自E3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株依次為ZMP5-2、ZMP5-3、ZMP7-2、ZMZ5-3、ZMZ5-5、ZMZ5-7、ZMZ6-2、ZMZ6-5、ZMZ7-2；自F3 從左到右對(duì)應(yīng)的菌株依次為BM1、BM2、BM3、BM4、BM5、BM6。

根據(jù)IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線求得培養(yǎng)液IAA 濃度，結(jié)果如表2所示。

表2 培養(yǎng)液IAA 濃度Table 2 IAA concentration of the culture medium

2.4 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

選取部分產(chǎn)鐵載體、溶磷和產(chǎn)IAA 能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行個(gè)體形態(tài)特征觀察及鑒定，顯微鏡下觀察到的部分菌株的個(gè)體形態(tài)（40×10）如圖5所示。

圖5中，根據(jù)菌株形態(tài)，將菌株WB-21、BM3和BM5 分別鑒定為曲霉屬（Aspergillus）、旋孢腔菌屬（Cochliobolus）、鏈格孢屬（Alternaria）。菌株XP3.21 和ZMP5-3 特征不明顯，故暫時(shí)不能通過形態(tài)特征確定其種屬關(guān)系，需要進(jìn)一步分析以確定其種屬關(guān)系。

圖5 部分菌株的個(gè)體形態(tài)Fig.5 Microscopic individual morphology of selected strains

2.5 ITS 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將上述5 個(gè)代表菌株ITS 序列輸入NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast，選出相似度較高的基因序列。用MEGA7.0進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰接法獲得目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖6所示。

圖6 基于ITS 序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on ITS sequence analysis

由圖6可知，WB-21 為曲霉屬（Aspergillus）、BM3 為旋孢腔菌屬（Cochliobolus）、BM5 為鏈格孢屬（Alternaria）、菌株XP3.21 為刺盤孢屬（Colletotrichum）、ZMP5-3為籃狀菌屬（Talaromyces）?？梢奧B-21、BM3 和BM5 菌株的分子鑒定結(jié)果與它們的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

3 結(jié)論

通過CAS 檢測(cè)液顯色反應(yīng)、鉬銻抗比色法和Salkowski 法，對(duì)在粵北凡口鉛鋅礦廢棄地的4 種優(yōu)勢(shì)植物香蒲、苦楝、蓖麻和苧麻中分離篩選出的具有抗鉛、鋅重金屬能力的45 株內(nèi)生真菌，進(jìn)行促生作用篩選及對(duì)有促生作用較好的代表菌株進(jìn)行分類鑒定，得出以下結(jié)論：

1）在促生菌株篩選方面，得到產(chǎn)鐵載體的菌株共30 株，占菌株總數(shù)的66.67%；有溶磷能力的菌株3 株，占菌株總數(shù)的6.67%；產(chǎn)IAA 能力較好的菌株共18 株，占菌株總數(shù)的40.00%。

2）不同菌株可以產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，同時(shí)體現(xiàn)出微生物代謝產(chǎn)物的多樣性，對(duì)今后繼續(xù)開發(fā)利用植物內(nèi)生菌資源有著重要的指導(dǎo)作用。

3）通過對(duì)促生菌株的代表菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和ITS 序列分析，鑒定結(jié)果顯示W(wǎng)B-21 為曲霉屬（Aspergillus）、BM3 為旋孢腔菌屬（Cochliobolus）、BM5 為鏈格孢屬（Alternaria）、菌株XP3.21 為刺盤孢屬（Colletotrichum）、ZMP5-3 為籃狀菌屬（Talaromyces）。同時(shí)這些代表菌株分屬于不同的屬，表現(xiàn)出一定的多樣性。

4）本研究經(jīng)篩選獲得的可以產(chǎn)生鐵載體、溶磷和分泌產(chǎn)生IAA 的內(nèi)生真菌，為今后利用植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)對(duì)土壤重金屬污染治理提供了理論依據(jù)，同時(shí)，還可為進(jìn)一步探究植物內(nèi)生真菌對(duì)植物促生長(zhǎng)機(jī)理奠定一定的理論基礎(chǔ)，并以此推動(dòng)內(nèi)生真菌在植物修復(fù)重金屬污染土壤工程中的應(yīng)用。