王偉萍 賀 剛 吳 斌，3??

（1 江西省水生生物保護(hù)救助中心 江西南昌 330000 2 江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所 江西南昌 330000 3 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇南京 210023）

卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）在促進(jìn)和維持性腺發(fā)育和生殖功能中發(fā)揮重要作用，但其生理作用需通過(guò)分布于細(xì)胞膜表面的卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone re‐ceptor，F(xiàn)SHR）介導(dǎo)，卵泡刺激素受體是GPCR（Gprotein-coupled receptors）家族的成員[1]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因與排卵和繁殖力等存在密切關(guān)系[2-3]。而檢測(cè)選擇壓力的最大似然法檢驗(yàn)已被廣泛接受，其中，選擇系數(shù)ω（ω表示非同義/同義置換速率比值）直觀地反映了生物體在密碼子水平上的適應(yīng)性進(jìn)化趨勢(shì)。ω>1、ω=1 和ω<1 分別代表在進(jìn)化過(guò)程中基因承受正選擇、中性選擇及負(fù)選擇（凈化選擇）[4]。本研究通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物FSHR基因序列進(jìn)行選擇壓力分析，分析其適應(yīng)性進(jìn)化趨勢(shì)，為水生哺乳動(dòng)物，特別是長(zhǎng)江江豚（Neophocaena asiaeorientalis）的保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1FSHR基因序列 基于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上公布的基因序列，選取33 種哺乳動(dòng)物（11 種鯨豚類(lèi)、11 種靈長(zhǎng)類(lèi)、11 種其他類(lèi)），分別代表一般1 胎1 仔的水生類(lèi)群、一般1 胎1 仔的陸生類(lèi)群、一般1 胎多仔的典型類(lèi)群（表1）。

表1 FSHR 基因轉(zhuǎn)錄本信息

1.2 方法 首先，通過(guò)FasParser2.10.0 軟件[5]，獲得FSHR基因轉(zhuǎn)錄本最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框序列（open reading frame，ORF），隨后通過(guò)MEGA X[6]將上述序列對(duì)齊。采用DAMBE6.4 軟件[7]對(duì)FSHR基因轉(zhuǎn)錄本最長(zhǎng)ORF 序列進(jìn)行飽和度檢測(cè)，使用MEGA X中的ML 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并運(yùn)用PhyloSuite v1.2.2[8]為Paml 程序運(yùn)行提供所需文件的格式轉(zhuǎn)換[4]。

其次，應(yīng)用Paml 軟件codeml 模塊中的4 種不同的模型對(duì)FSHR基因進(jìn)行選擇壓力分析。本研究采用位點(diǎn)模型中的M0：假設(shè)所有位點(diǎn)具有相同的ω值；M1：假設(shè)存在2 類(lèi)位點(diǎn)，保守位點(diǎn)0<ω<1，中性進(jìn)化位點(diǎn)ω=1，并且估算這2 類(lèi)位點(diǎn)的比率（p0、p1）；M2：假設(shè)存在3 類(lèi)位點(diǎn)，保守位點(diǎn)、中性進(jìn)化位點(diǎn)、正選擇位點(diǎn)ω>1，并且估算這3 類(lèi)位點(diǎn)的比率（p0、p1、p2）；M3：離散模型，假設(shè)所有位點(diǎn)的ω值呈離散分布；M7：假設(shè)所有位點(diǎn)0<ω<1 且呈現(xiàn)beta 分布；M8：在M7 模型的基礎(chǔ)上，增加一類(lèi)正選擇位點(diǎn)（ω>1）。通過(guò)M1/M2、M7/M8 重建似然比檢驗(yàn)LRT，使用M2 和M8 鑒別受到正選擇的位點(diǎn)，分析各位點(diǎn)承受正選擇的壓力位點(diǎn)。

最后，用枝模型分析水生哺乳動(dòng)物的FSHR基因是否存在加速進(jìn)化。枝模型假設(shè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的不同枝之間有不同的選擇壓（即不同的ω值），以檢測(cè)不同種分枝的正選擇壓。這里采用枝標(biāo)簽分3 種情況進(jìn)行標(biāo)記：1）鯨豚類(lèi)動(dòng)物為前景枝；2）靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物為前景枝；3）其他陸生動(dòng)物為前景枝，均分別用M0 和M2 模型進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核苷酸的序列飽和度檢測(cè)結(jié)果 采用DAMBE6.4軟件對(duì)FSHR基因轉(zhuǎn)錄本最長(zhǎng)ORF 序列進(jìn)行飽和度檢測(cè)，均滿足條件P=0.0000，ISS

圖1 FSHR 基因轉(zhuǎn)錄本最長(zhǎng)ORF 序列飽和度分析

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 本研究運(yùn)用MEGAX 中的ML 方法構(gòu)建FSHR基因轉(zhuǎn)錄本最長(zhǎng)ORF 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)分類(lèi)基本一致，且bootstrap 值也基本一致，大多數(shù)在90 以上，極少數(shù)低于70，推測(cè)FSHR基因進(jìn)化速率適中，基本形成了比較穩(wěn)定的功能。

圖2 FSHR 基因轉(zhuǎn)錄本最長(zhǎng)ORF 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 位點(diǎn)模型 比較M0 和M3、M7 和M8，2ΔlnL分別為306.07、20.30，通過(guò)χ2檢測(cè)，差異極顯著。但比較M1 和M2，2ΔlnL為0，通過(guò)χ2檢測(cè)，差異不顯著。M3 模型結(jié)果表明，p0、p1 和p2 分別為0.74904、0.25096 和0.00000，對(duì)應(yīng)的dN/dS（w）為0.04768、0.66855 和25.36134。M1 模型結(jié)果表明，p0 和p1 分別為0.83578 和0.16422，對(duì)應(yīng)的dN/dS（w）為0.07879 和1.00000。M8 模型結(jié)果表明，以XM_008823037.1 為參考序列，F(xiàn)SHR基因轉(zhuǎn)錄本最長(zhǎng)ORF 序列正選擇位點(diǎn)有19 個(gè)，但只有aa 165 M 一個(gè)位點(diǎn)的P>95%，表明FSHR基因所承受的正選擇壓力相對(duì)較少，選擇壓力分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 FSHR 基因正選擇位點(diǎn)結(jié)果

2.4 枝模型 枝模型檢驗(yàn)結(jié)果顯示，靈長(zhǎng)類(lèi)和其他陸生動(dòng)物為前景枝，比較M0 和M2，2ΔlnL分別為1.22 和1.45，通過(guò)χ2檢測(cè)，差異均不顯著。而鯨豚類(lèi)動(dòng)物為前景枝，比較M0 和M2，2ΔlnL為5.60，通過(guò)χ2檢測(cè)，差異顯著。即M2 模型優(yōu)于M0 模型，不同的枝有不同的選擇壓力，且二者均為0<ω<1，表明鯨豚類(lèi)動(dòng)物FSHR基因存在加速進(jìn)化，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 枝模型的似然比檢驗(yàn)和種系選擇壓結(jié)果

3 討論

動(dòng)物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)及適應(yīng)性進(jìn)化一直是研究熱點(diǎn)問(wèn)題，高度保守的繁殖相關(guān)基因的進(jìn)化系統(tǒng)研究能簡(jiǎn)便有效地揭示出其潛在的生物學(xué)功能。例如，鼬科、浣熊科、小熊貓科和臭鼬科均出現(xiàn)胰液核糖核酸酶基因復(fù)制，且檢測(cè)到正選擇作用和適應(yīng)性位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合RNA 組織表達(dá)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明該基因不僅有食性相關(guān)的功能，可能還有其他功能[9]。動(dòng)物采取不同的繁殖策略以適應(yīng)所處環(huán)境，通常由行為及內(nèi)分泌共同調(diào)節(jié)。有研究表明，同一單元內(nèi)雌性川金絲猴（Rhinopithecusroxellana）可能通過(guò)季節(jié)層面地錯(cuò)開(kāi)生殖狀態(tài)、懷孕機(jī)會(huì)及邀配行為的方式以減緩生殖競(jìng)爭(zhēng)并適應(yīng)環(huán)境的季節(jié)性變化[10]。有研究表明，F(xiàn)SHR基因含量的高低可能與哺乳動(dòng)物的繁殖力之間存在一定相關(guān)性[3]，F(xiàn)SHR基因正常表達(dá)是卵巢獲得促性腺激素反應(yīng)能力的關(guān)鍵，受體的缺失會(huì)引起卵泡不能正常發(fā)育，嚴(yán)重的則會(huì)引起繁殖力降低甚至不孕[11]。通過(guò)對(duì)33 種哺乳動(dòng)物的FSHR基因的選擇壓力檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)M3 模型中p2 為0，表明FSHR基因主要承受的選擇壓力是凈化選擇。Kamath和Getz[12]研究指出，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中選擇壓力不可能一直效應(yīng)于整個(gè)基因中，而是作用于某些特殊效用位點(diǎn)上，例如，某個(gè)基因編碼區(qū)域的特定位點(diǎn)。因此，F(xiàn)SHR基因的凈化選擇可能主要是FSHR基因?qū)Σ溉閯?dòng)物至關(guān)重要，較保守。但在FSHR基因也檢測(cè)出多個(gè)正選擇壓力位點(diǎn)，選擇信號(hào)是選擇作用遺留在基因上的印跡。任何一種生物想要生存下去，都必須不斷地進(jìn)行繁殖，保證自己所屬物種的數(shù)量，繁殖是動(dòng)物實(shí)現(xiàn)自身適合度的方法[13]。這可能是為了應(yīng)對(duì)不同的環(huán)境及不同的婚配制度帶來(lái)的多重挑戰(zhàn)，保證物種的可持續(xù)性發(fā)展，動(dòng)物通常采用不同的繁殖策略與行為策略以提高自身的交配機(jī)會(huì)、成功率及后代的存活率[14]而發(fā)生正向選擇突變。對(duì)鼠類(lèi)研究指出，無(wú)論是依賴(lài)光周期的天算式繁殖，還是綜合實(shí)際水熱和食物條件的鼠算式繁殖，都顯示出鼠繁殖策略的靈活性。鼠對(duì)環(huán)境調(diào)節(jié)的有效把握和相對(duì)較快的傳代速度使其更有可能演化出新的適應(yīng)策略[15]。水生哺乳動(dòng)物，例如，長(zhǎng)江江豚無(wú)論在野外還是在人工環(huán)境下均無(wú)產(chǎn)雙胞胎的記錄，長(zhǎng)江江豚的交配可能發(fā)生在一年中的大多數(shù)月份，并可能有一個(gè)以上的交配高峰，撫幼行為比較常見(jiàn)[16]，因此，推測(cè)鯨豚類(lèi)FSHR基因的加速進(jìn)化可能有助于其實(shí)現(xiàn)繁殖適應(yīng)。鯨豚類(lèi)作為物種演化歷史上一類(lèi)非常重要的次生性水生哺乳動(dòng)物，成功地適應(yīng)了水生環(huán)境并且快速地輻射進(jìn)入到全球的各水域。為了適應(yīng)水生生境，鯨類(lèi)外部形態(tài)和生理、生態(tài)產(chǎn)生了一系列的適應(yīng)性改變，在表型性狀上發(fā)生了明顯變化，特別是在繁殖、生長(zhǎng)等性狀上差異較大，但由進(jìn)化所導(dǎo)致繁殖適應(yīng)的遺傳機(jī)制尚不清楚，缺乏系統(tǒng)研究。一個(gè)種群繁殖力的強(qiáng)弱直接影響該種群以后的發(fā)展前途及最終命運(yùn)[17]，因此，對(duì)以長(zhǎng)江江豚為代表的鯨豚類(lèi)動(dòng)物繁殖適應(yīng)策略的深入研究有利于科學(xué)開(kāi)展相關(guān)保護(hù)工作。