劉 斌，張 帥，劉濮毓，趙云環(huán)，王榮申，范京惠，左玉柱

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001；2.石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種烈性傳染病。臨床癥狀多表現(xiàn)為不同年齡段豬出血、發(fā)熱以及呼吸道癥狀和懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱胎等為特征的繁殖障礙，因部分感染豬會(huì)出現(xiàn)耳尖、尾尖、乳頭、四肢末端或皮膚發(fā)紺，故又稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”［1-2］。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大以及養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，PRRS 的發(fā)病率日益增加。當(dāng)前，我國(guó)防控PRRS 以接種疫苗為主，但由于PRRSV 的高變異率導(dǎo)致高致病性毒株（HP-PRRSV）、NADC30-like PRRSV 以及重組毒株的出現(xiàn)，使得PRRSV 流行毒株呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性，防控PRRS 的難度越來(lái)越大，嚴(yán)重影響了中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展［3-5］。

中藥為純天然物質(zhì)，可在不傷害機(jī)體的前提下抑制病毒復(fù)制，對(duì)機(jī)體毒副作用小［6］。PRRSV 的主要感染機(jī)制是在豬肺泡巨噬細(xì)胞上增殖并對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞造成嚴(yán)重破壞，引發(fā)豬發(fā)熱等炎癥反應(yīng)，以及呼吸困難等呼吸道癥狀，并通過(guò)免疫抑制機(jī)制誘導(dǎo)其他疫病發(fā)生［7］。從中醫(yī)角度來(lái)講，豬感染PRRSV 是外邪入侵、免疫低下所致，因其外部濕氣不斷積聚體內(nèi)，導(dǎo)致肺氣不宣，進(jìn)而陰陽(yáng)失調(diào)，發(fā)生該?。?］。因此，中醫(yī)上以“增免解毒”、“清熱燥濕”、“補(bǔ)益肺衛(wèi)”作為主要對(duì)策，做到標(biāo)本兼治。同時(shí)，在減抗替抗的大環(huán)境下，中藥處方防控PRRS 成為了重要發(fā)展方向。黃芪具有益氣固表、斂汗固脫、脫毒排膿、扶正祛邪等功效［9］；板藍(lán)根和大青葉具有清熱解毒、涼血利咽、抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效［10］；蒲公英和金銀花具有抗菌抗炎、保肝利膽、增強(qiáng)免疫力等功效［11］；甘草具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝等多重功效［12］。為了有效防治豬繁殖與呼吸綜合征，減少PRRS 對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的損失，降低PRRS 發(fā)病率，檢驗(yàn)以黃芪、板藍(lán)根、金銀花、蒲公英、大青葉、甘草為主要成分的芪板青顆粒抗PRRSV 的效果，本試驗(yàn)通過(guò)用芪板青顆粒水溶液作用于接種PRRSV的Marc-145 細(xì)胞，觀察其對(duì)PRRSV 的抵抗作用，以期為防治PRRS 提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 芪板青顆粒（生產(chǎn)批號(hào)：21112204），購(gòu)自河北征宇制藥有限公司，主要成分：黃芪、板藍(lán)根、金銀花、蒲公英、大青葉、甘草；胎牛血清（生產(chǎn)批號(hào)：12A288），購(gòu)自上海依科賽生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)液（生產(chǎn)批號(hào)：12100），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 毒株與細(xì)胞株 PRRSV、Marc-145 細(xì)胞均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芪板青顆粒安全濃度的測(cè)定 將Marc-145細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)成致密單層后，棄上清。用DMEM 維持液將芪板青顆粒進(jìn)行溶解稀釋?zhuān)龠M(jìn)行2 倍倍比稀釋?zhuān)♂尳K濃度分別為100 000.0、50 000.0、25 000.0、12 500.0、6 250.0、3 125.0、1 562.5、781.3、390.6 和195.3 mg/L，共10 個(gè)稀釋濃度。將各稀釋濃度芪板青溶液分別加到已長(zhǎng)有單層Marc-145 細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)6 孔。另以病毒液接種細(xì)胞和DMEM 維持液加到細(xì)胞中分別作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，置于37 ℃ CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)4 d 觀察細(xì)胞病變情況，根據(jù)細(xì)胞病變情況確定芪板青顆粒對(duì)Marc-145 細(xì)胞的毒性，以不出現(xiàn)細(xì)胞病變的最大芪板青溶液濃度為最大安全濃度。

1.2.2 PRRSV 標(biāo)準(zhǔn)毒株半數(shù)感染量（TCID50）的測(cè)定 將Marc-145 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)成致密單層后，棄上清。用DMEM 維持液將PRRSV 標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行10 倍倍比稀釋成6 個(gè)濃度，將各稀釋濃度PRRSV 病毒液加到已長(zhǎng)有單層Marc-145 細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)6 孔。另以DMEM 維持液加到已長(zhǎng)有單層Marc-145 細(xì)胞的培養(yǎng)板作陰性對(duì)照，置于37 ℃ CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h 后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，記錄病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench 公式，計(jì)算PRRSV 的TCID50。

1.2.3 細(xì)胞病變判斷標(biāo)準(zhǔn) 以“+”表示細(xì)胞病變的百分?jǐn)?shù)，即0%～25%為（+），26%～50%為（++），51%～75%為（+++），76%～100%為（++++），陰性對(duì)照表示為（-）。

1.2.4 芪板青顆粒在細(xì)胞水平上對(duì)PRRSV 的抑制作用測(cè)定 將Marc-145 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)成致密單層后，棄上清。將100×TCID50PRRSV 病毒液接種于已長(zhǎng)有單層Marc-145細(xì)胞的96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h 后棄掉上清。將1.2.1 中測(cè)定的芪板青溶液從最大安全濃度開(kāi)始，倍比稀釋成10 個(gè)濃度，分別加到接種了PRRSV 病毒液的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)4 孔。另以病毒液接種細(xì)胞和DMEM 維持液加到細(xì)胞中分別作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。置于37 ℃ CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)4 d 觀察細(xì)胞病變情況。

1.2.5 芪板青顆粒在細(xì)胞水平上對(duì)PRRSV 的殺滅作用測(cè)定 將Marc-145 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)成致密單層后，棄上清。將200×TCID50PRRSV 病毒液與從最大安全濃度開(kāi)始進(jìn)行的2 倍倍比稀釋成10 個(gè)濃度的芪板青溶液等量混合，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h 后，加入有單層Marc-145 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，重復(fù)4 孔。另以病毒液接種細(xì)胞和DMEM 維持液加到細(xì)胞中分別作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。置于37 ℃ CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)4 d 觀察細(xì)胞病變情況。

1.2.6 芪板青顆粒在細(xì)胞水平上對(duì)PRRSV 的阻斷作用測(cè)定 將Marc-145 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)成致密單層后，棄上清。將1.2.1 中測(cè)定的芪板青溶液從最大安全濃度開(kāi)始，2 倍倍比稀釋成10 個(gè)濃度，分別加入有單層Marc-145 細(xì)胞的96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h 后棄掉上清。將100×TCID50PRRSV病毒液接種于已吸附芪板青溶液的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)4 孔。另以病毒液接種細(xì)胞和DMEM 維持液加到細(xì)胞中分別作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。置于37 ℃ CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)4 d 觀察細(xì)胞病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 芪板青顆粒安全濃度的測(cè)定結(jié)果

將10 個(gè)稀釋濃度的芪板青溶液加到已長(zhǎng)有單層Marc-145 細(xì)胞的培養(yǎng)板中，經(jīng)連續(xù)4 d 觀察后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為100 000.0、50 000.0、25 000.0、12 500.0 和6 250.0 mg/L 時(shí)，細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的脫落，細(xì)胞單層被破壞，隨著芪板青溶液濃度逐漸降低，細(xì)胞病變逐漸減少，直到濃度為3 125 mg/L 時(shí)開(kāi)始，細(xì)胞未出現(xiàn)病變（圖1），因此，芪板青溶液最大安全濃度為3 125 mg/L。

圖1 不同稀釋濃度芪板青溶液下細(xì)胞生長(zhǎng)情況（200×）Fig.1 Cell growth under different dilution concentration of Qibanqing solution(200×)

2.2 PRRSV 標(biāo)準(zhǔn)毒株半數(shù)感染量（TCID50）的測(cè)定結(jié)果

將經(jīng)10 倍倍比稀釋后的PRRSV 病毒液加到已長(zhǎng)有單層Marc-145 細(xì)胞的培養(yǎng)板中，經(jīng)72 h 培養(yǎng)后，用倒置顯微鏡觀察結(jié)果如表1 所示，在病毒液稀釋度為10-5～10-1時(shí)，Marc-145 細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的病變，隨著稀釋度增加細(xì)胞病變孔數(shù)降低，在病毒液稀釋度為10-6時(shí)，Marc-145 細(xì)胞不再出現(xiàn)病變。根據(jù)Reed-Muench 公式，計(jì)算PRRSV 的TCID50值為10-2.9/0.1 mL。

表1 不同病毒液稀釋度細(xì)胞病變統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical analysis of cytopathic changes in different dilution levels of disease venom

2.3 芪板青顆粒在細(xì)胞水平上對(duì)PRRSV 的抑制作用測(cè)定結(jié)果

經(jīng)連續(xù)4 d 觀察細(xì)胞病變情況，記錄不同芪板青溶液稀釋濃度下產(chǎn)生的細(xì)胞病變情況如表2 所示，可以看出芪板青溶液在細(xì)胞水平上對(duì)PRRSV有抑制作用，在其濃度為3 125.0 和1 562.5 mg/L時(shí)，細(xì)胞病變百分?jǐn)?shù)均不到25%；隨著藥物濃度降低，芪板青溶液對(duì)PRRSV 的抑制作用逐漸降低，在濃度24.4 ～781.3 mg/L 時(shí)，細(xì)胞病變百分?jǐn)?shù)為26%～50%；在藥物濃度為12.2 和6.1 mg/L 時(shí)，雖然細(xì)胞病變百分?jǐn)?shù)到了51%～75%，但與只接PRRSV 病毒液的陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照相比，仍表現(xiàn)出了抑制作用。

2.4 芪板青顆粒在細(xì)胞水平上對(duì)PRRSV 的殺滅作用測(cè)定結(jié)果

經(jīng)連續(xù)4 d 觀察細(xì)胞病變情況，記錄各試驗(yàn)孔與對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)情況如表3 所示，在芪板青溶液濃度195.3 ～3 125.0 mg/L 時(shí)，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺滅作用，細(xì)胞病變均低于25%，從芪板青溶液濃度為97.6 mg/L 開(kāi)始，殺滅作用逐漸降低，但和只接PRRSV 病毒液的陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照相比，仍表現(xiàn)出了殺滅作用；同時(shí)和2.3 中抑制作用結(jié)果相比，殺滅作用優(yōu)于抑制作用。

表3 芪板青顆粒對(duì)PRRSV 的殺滅作用細(xì)胞病變統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Cytopathic statistics of Qibanqing granules against PRRSV

2.5 芪板青顆粒在細(xì)胞水平上對(duì)PRRSV 的阻斷作用測(cè)定結(jié)果

經(jīng)連續(xù)4 d 觀察細(xì)胞病變情況，記錄各細(xì)胞孔結(jié)果如表4 所示，芪板青溶液濃度在24.4 ～ 3 125.0 mg/L 范圍內(nèi)對(duì)PRRSV 具有阻斷作用，在濃度低于12.2 mg/L 時(shí)對(duì)PRRSV 無(wú)阻斷作用，整體來(lái)看，芪板青溶液對(duì)PRRSV 的阻斷作用低于抑制作用和殺滅作用。

表4 芪板青顆粒對(duì)PRRSV 的阻斷作用細(xì)胞病變統(tǒng)計(jì)Table 4 Cytopathic statistics of the blocking effects of Qibanqing granules on PRRSV

3 討論與結(jié)論

PRRS 是影響?zhàn)B豬行業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一，由于極高的發(fā)病率給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRS 屬外感溫?zé)岵》懂牐R床發(fā)病豬主要表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱、全身發(fā)紅、耳朵發(fā)紺、鼻孔出血、懷孕母豬流產(chǎn)等，中醫(yī)防治則以“增免解毒”、“清熱燥濕”、“補(bǔ)益肺衛(wèi)”中藥為主［13］。因此本試驗(yàn)采用以黃芪、板藍(lán)根、金銀花、蒲公英、大青葉、甘草為主要成分的芪板青顆粒復(fù)方進(jìn)行體外抗PRRSV 研究，旨在篩選有效抗PRRSV 中藥，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

PRRSV 的主要感染機(jī)制是侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞，引起豬發(fā)熱、炎癥反應(yīng)以及呼吸道癥狀［7］；同時(shí)通過(guò)破壞母豬血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致胎兒無(wú)法從母體得到充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，從而變成木乃伊胎等死胎，存活下的仔豬又通過(guò)胎盤(pán)感染PRRSV 患?。?4-15］；還通過(guò)免疫抑制作用致使機(jī)體抵抗力下降，誘發(fā)其他疾?。?6］。黃芪可補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫、提高機(jī)體免疫力；板藍(lán)根和大青葉可清熱解毒、涼血消腫、緩解患病豬呼吸道癥狀；蒲公英和金銀花具有宣散風(fēng)熱、清解血毒、增強(qiáng)抵抗力的功效［17-18］。本試驗(yàn)通過(guò)觀察細(xì)胞病變百分?jǐn)?shù)來(lái)測(cè)定芪板青顆粒對(duì)PRRSV 的抑制、殺滅和阻斷作用，發(fā)現(xiàn)在芪板青顆粒濃度24.4 ～3 125.0 mg/L 時(shí)，對(duì)PRRSV 有顯著的抑制作用，可將細(xì)胞病變抑制到50%以下，芪板青顆粒在24.4 ～3 125.0 mg/L 時(shí)，同樣能起到殺滅作用，但相對(duì)于抑制作用來(lái)說(shuō)，殺滅作用可在195.3 ～3 125.0 mg/L時(shí)將PRRSV 殺滅到細(xì)胞病變低于25%，因此殺滅作用較強(qiáng)于抑制作用；在芪板青顆粒濃度97.6 ～3 125.0 mg/L 時(shí)，可起到顯著阻斷PRRSV 感染細(xì)胞作用，但效果略差于其抑制作用和殺滅作用。雖然對(duì)PRRSV 的抑制、殺滅、阻斷作用的測(cè)定均收到一定效果，但不能完全對(duì)PRRSV 抑制、殺滅和阻斷，可能由于芪板青顆粒對(duì)Marc-145 細(xì)胞的毒害作用較大，使得芪板青顆粒對(duì)于Marc-145 細(xì)胞的最大安全濃度為3 125.0 mg/L。

PRRSV 至今仍是全球養(yǎng)豬生產(chǎn)中最重要的病原體之一，毒株多樣化導(dǎo)致患病豬臨床表現(xiàn)多變和疫苗保護(hù)效力不佳，都給豬場(chǎng)的防治造成極大的困難［19］。本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示：芪板青顆粒對(duì)PRRSV 的防控有顯著效果，為芪板青顆粒防治PRRS 提供了依據(jù)。