魏雅迪，曹麗萍，劉英姿，劉曉穎，曹宏哲，張 康，邢繼紅，董金皋

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室，河北 保定 071000；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3. 河北省承德市園林管理中心，河北 承德 067000）

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一種引起植物灰霉病的重要病原真菌，它可以侵染蔬菜、水果等上千種寄主植物［1］。灰葡萄孢已成為研究植物病原真菌的模式病原菌，其生長發(fā)育和致病相關(guān)基因的功能與機制研究，不僅為深入研究灰葡萄孢生長發(fā)育和致病力的分子機理奠定基礎(chǔ)，也為其他植物病原真菌的相關(guān)研究提供重要參考［2］。

異三聚體G 蛋白是普遍存在于真核生物中，參與多種重要的生理過程［3］。絲狀真菌G 蛋白于1993 年首次報道，已明確其在生長、無性和有性發(fā)育中是必不可少的［4］；其中，G 蛋白α 亞基參與了營養(yǎng)感知、信息素反應(yīng)以及致病等過程的調(diào)控［5］。Gα亞基在稻瘟病菌（Magnaporthe grusea）的生長、繁殖以及致病過程中都具有重要的作用［6］?；移咸焰逩α亞基位于cAMP 信號通路上游，參與病菌的菌絲生長、分生孢子發(fā)育、分生孢子萌發(fā)以及致病過程［7］。Gα亞基基因BcBCG1調(diào)控病菌的菌落形態(tài)和侵染能力，BcBCG2、BcBCG3基因的突變體可以對寄主進行侵染，但是與野生型相比侵染速度緩慢［8-9］，且BcBCG3基因的突變體分生孢子的發(fā)育和分生孢子萌發(fā)均具有特異性缺陷［6］。本實驗室前期研究利用RNAi 技術(shù)獲得了灰葡萄孢BcBCG2和BcBCG3基因的RNAi 沉默突變體，通過對突變體的表型和致病力進行分析，明確了BcBCG2和BcBCG3正調(diào)控病菌的菌絲生長、分生孢子的產(chǎn)量、致病力和穿透能力［10］。

灰葡萄孢BcPDR1基因為本實驗室前期研究獲得，利用基因敲除和互補回復(fù)技術(shù)明確了BcPDR1基因正調(diào)控病菌的菌絲生長、分生孢子和菌核的發(fā)育、菌絲侵染結(jié)構(gòu)的形成以及致病力［11-12］。本研究利用qRT-PCR 技術(shù)分析BcPDR1基因突變對BcBCG2、BcBCG3基因表達的影響，以及BcBCG2、BcBCG3基因突變對BcPDR1基因表達的影響，確定BcPDR1基因與Gα 亞基基因之間的調(diào)控關(guān)系；在BcPDR1基因敲除突變體ΔBcpdr1的背景下，構(gòu)建Gα 亞基基因中過表達菌株ΔBcpdr1/BcBcBCG2-OE 和ΔBcpdr1/BcBCG3-OE， 通 過 分析過表達菌株的表型和致病力，明確BcPDR1基因與BcBCG2、BcBCG3基因之間的關(guān)系，從而確定BcPDR1基因與病菌cAMP 信號通路之間的關(guān)系，為闡明灰葡萄孢BcPDR1基因調(diào)控病菌生長發(fā)育和致病力的分子機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcPDR1基因的T-DNA 插入突變體BCt89、敲除突變體ΔBcpdr1和 回 復(fù) 菌 株CE［13］，BcBCG2、BcBCG3基 因 的RNAi 菌株，均由河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室保存及提供。

1.2 qRT-PCR 分析

利用qRT-PCR 技術(shù)，分析灰葡萄孢野生型菌株BC22，BcPDR1基因的缺失突變體BCt89和ΔBcpdr1和互補回復(fù)菌株CE 中的BcBCG2、BcBCG3基因的表達水平以及BcBCG2、BcBCG3基因的RNAi 沉默突變體中BcPDR1基因的表達水平。以灰葡萄孢Tubulin基因為內(nèi)參基因，用BcBCG2、BcBCG3和BcPDR1基因的特異性引物（見表1），以各菌株的cDNA 為模板，進行qRT-PCR 分析。

表1 qRT-PCR 引物設(shè)計Table 1 Primers for qRT-PCR

1.3 Gα 亞基基因過表達菌株的構(gòu)建

1.3.1 Gα亞基基因過表達載體的構(gòu)建 用BcBCG2、

BcBCG3基因的特異性引物和灰葡萄孢野生型BC22菌株的cDNA 為模板，PCR 擴增BcBCG2、BcBCG3基因的編碼區(qū)序列，電泳分離、純化后進行克隆、測序。將測序正確的BcBCG2、BcBCG3基因序列與基因過表達終載體pEarly gate 103 連接，菌落PCR 和測序鑒定后，獲得BcBCG2、BcBCG3基因的過表達載體pEarly gate 103-BcBCG2、pEarly gate 103-BcBCG3。

1.3.2 Gα 亞基基因過表達轉(zhuǎn)化子的獲得與鑒定 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法［14］，將pEarly gate 103-BcBCG2、pEarly gate 103-BcBCG3分 別 轉(zhuǎn)化BcPDR1基因敲除突變體ΔBcpdr1中，獲得轉(zhuǎn)化子后在含有抗性的培養(yǎng)基中進行多次篩選，然后利用PCR 和qRT-PCR 技術(shù)分別從DNA 水平和轉(zhuǎn)錄水平對轉(zhuǎn)化子進行鑒定。

1.4 Gα 亞基基因過表達菌株的表型分析

將灰葡萄孢野生型BC22 和突變體ΔBcpdr1、ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 分 別接種在PDA 培養(yǎng)基上，20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，對其菌落形態(tài)、菌核產(chǎn)生等表型進行觀察；同時，收集各菌株的分生孢子，用血球計數(shù)板統(tǒng)計各菌株的分生孢子數(shù)量；制備各菌株的菌絲懸浮液，顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)；分別將各菌株的菌盤（Φ=8.0 mm）接種在新的PDA 培養(yǎng)基上，20 ℃黑暗培養(yǎng)，每天定時測定各菌株的菌落直徑，進而分析菌株的生長速率［15］

1.5 Gα 亞基基因過表達菌株的致病力分析

將灰葡萄孢野生型BC22 和突變體ΔBcpdr1、ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 定量（菌盤Φ=8.0 mm）接種到離體的番茄果實上，檢測各菌株的致病力，測量其病斑面積。

2 結(jié)果與分析

2.1BcPDR1基因?qū)α 亞基基因表達的影響

利用qRT-PCR 技術(shù)，分析BcPDR1基因突變體Gα亞基基因BcBCG2、BcBCG3的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcPDR1基因缺失突變體BCt89 和ΔBcpdr1中BcBCG2、BcBCG3基因的表達水平顯著高于野生菌株BC22 和回復(fù)菌株CE（見圖1）。表明BcPDR1基因缺失影響了BcBCG2、BcBCG3基因的表達，也說明BcPDR1基因負調(diào)控BcBCG2、BcBCG3基因的表達。

圖1BcPDR1基因突變體中BcBCG2和BcBCG3基因的表達分析Fig.1 Expression levels ofBcBCG2andBcBCG3inBcPDR1mutants

2.2 Gα 亞基基因?qū)cPDR1基因表達的影響

利用qRT-PCR 技術(shù)，分析Gα亞基基因BcBCG2、BcBCG3的突變對BcPDR1基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcBCG2、BcBCG3的RNAi 沉默突變體中BcPDR1基因的表達水平顯著低于野生型菌株BC22（圖2）。表明BcBCG2、BcBCG3基因突變影響了BcPDR1基因的表達，也說明BcBCG2、BcBCG3基因正調(diào)控BcPDR1基因的表達。

圖2BcBCG2和BcBCG3基因突變體中BcPDR1基因的表達分析Fig. 2 Expression levels of theBcPDR1in RNAi mutants ofBcBCG2andBcBCG3genes

2.3BcBCG2、BcBCG3過表達菌株的構(gòu)建

利用Gateway 技術(shù)，成功構(gòu)建了BcBCG2和BCBCG3基因的過表達載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將目的基因表達載體轉(zhuǎn)入到突變體ΔBcpdr1中，通過抗性篩選獲得轉(zhuǎn)化子，在對轉(zhuǎn)化子進行PCR 驗證后進行qRT-PCR 分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcBCG2、BcBCG3基因的轉(zhuǎn)化子中BcBCG2和BcBCG3基因的表達水平顯著高于突變體ΔBcpdr1（圖3）。表明了BcBCG2和BCBCG3基因的過表達菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 構(gòu)建成功。

圖3BcBCG2和BcBCG3過表達菌株的基因表達分析Fig.3 Gene expression analysis inBcBCG2andBcBCG3overexpressing strains

2.4BcBCG2、BcBCG3過表達菌株的表型分析

對ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 菌株的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)進行觀察（見圖4），發(fā)現(xiàn)過表達菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 的菌落灰褐色，產(chǎn)生大量菌核，菌絲灰黑色、分隔明顯，與野生型BC22 的表型非常一致，而顯著區(qū)別于BcPDR1基因的敲除突變體ΔBcpdr1。對過表達菌株的菌絲生長速率和分生孢子產(chǎn)量進行分析，發(fā)現(xiàn)ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BCBCG3-OE 菌株的生長速率和分生孢子數(shù)量均與野生型較為接近，其生長速率與野生型沒有明顯差別，其產(chǎn)孢量略低于野生型；過表達菌株的生長速率和分生孢子數(shù)量均顯著區(qū)別于突變體ΔBcpdr1。表明BcBCG2、BcBCG3基因的過表達使突變體ΔBcpdr1的表型得到了恢復(fù)，也說明BcPDR1基因與BcBCG2、BcBCG3基因之間密切相關(guān)。

圖4BcBCG2和BcBCG3過表達菌株的表型分析Fig. 4 Phenotypic analysis of over-expression isolates ofBcBCG2andBcBCG3

2.5BcBCG2、BcBCG3過表達菌株的致病力分析

以灰葡萄孢野生型BC22菌株和BcPDR1基因的敲除突變體ΔBcpdr1為對照，對ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE 菌 株 的 致 病力進行分析，發(fā)現(xiàn)接種野生型BC22 和過表達菌株的部位均能產(chǎn)生明顯的病斑，且接種過表達菌株的病斑面積與野生型基本一致，而接種突變體ΔBcpdr1的部位并未產(chǎn)生明顯的病斑（圖5）。表明BcBCG2、BCBCG3基因的過表達均能使突變體ΔBcpdr1的致病力得到了恢復(fù)，進一步說明了BcPDR1基因與BcBCG2、BcBCG3基因之間密切相關(guān)。

圖5BcBCG2和BcBCG3過表達菌株的致病力Fig. 5 Pathogenicity analysis of over-expression isolates ofBcBCG2andBcBCG3

3 結(jié)論與討論

灰葡萄孢cAMP 信號途徑在病菌的生長、發(fā)育和致病過程中起著重要作用。異源三聚體G-蛋白Gα 亞基由BcBCG1［7］、BcBCG2［16］、BcBCG3［17］基因編碼，位于灰葡萄孢cAMP 信號途徑上游，參與調(diào)控病菌的形態(tài)建成、分生孢子萌發(fā)和侵入生長［18］。其中，BcBCG1基因的缺失突變體ΔBcBCG1不能產(chǎn)生2 次擴展病斑，外源cAMP 的添加可以使ΔBcBCG1突變體的菌落形態(tài)恢復(fù)到野生型；BcBCG2、BcBCG3基因的缺失突變體ΔBcBCG2、ΔBcBCG3可以侵染寄主并能繼續(xù)擴展，但是擴展速度較野生型緩慢［8-9］。ΔBcBCG3可以使分生孢子萌發(fā)受損并引起延遲發(fā)病。實驗前期研究明確了灰葡萄孢BcPDR1參與病菌的生長、發(fā)育和致病力的調(diào)控［18］，但是灰葡萄孢BcPDR1與cAMP信號途徑之間的關(guān)系并未明確［20］。因此，本研究首先利用qRT-PCR 技術(shù)，分析了BcPDR1突變體中BcBCG2、BcBCG3基因表達水平和BcBCG2和BcBCG3突變體中BcPDR1基因表達水平，結(jié)果確定了BcPDR1基因負調(diào)控BcBCG2、BcBCG3基因的表達，BcBCG2、BcBCG3基因正調(diào)控BcPDR1的表達，表明了BcPDR1基因與病菌的cAMP 信號途徑密切相關(guān)。為進一步明確BcPDR1基因與BcBCG2和BcBCG3基因之間的關(guān)系，試驗成功構(gòu)建了BcBCG2和BCBCG3基因的過表達菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE，然后對過表達菌株進行表型和致病力分析，確定了BcBCG2和BcBCG3基因的過表達能夠使BcPDR1基因的敲除突變體ΔBcpdr1的表型和致病力得到恢復(fù)，表明了BcPDR1基因與BcBCG2和BcBCG3基因之間密切相關(guān)，同時說明了BcPDR1基因與病菌cAMP 信號途徑之間具有相關(guān)性。但是BcPDR1基因與病菌cAMP 信號途徑之間的調(diào)控關(guān)系及機制尚需深入研究，為闡明灰葡萄孢生長發(fā)育和致病力調(diào)控的分子機理奠定基礎(chǔ)。