劉 暢，董康挺，張雅晰，李靜思，邊秀舉，李會(huì)彬，王麗宏，孫鑫博

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/河北省作物生長調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

匍匐翦股穎(Agrostis stolonifera)屬禾本科植物，一種冷季型草坪草。由于其修剪品質(zhì)高、再生能力強(qiáng)、抗逆性較好，是北方地區(qū)常用的優(yōu)質(zhì)草種［1］，尤其用于建植高質(zhì)量的精細(xì)草坪，如高爾夫球場的果嶺和運(yùn)動(dòng)場草坪。然而，匍匐翦股穎耐熱性較差，在其使用過程中，常常會(huì)因?yàn)槭艿礁邷孛{迫而對其生長發(fā)育和草坪質(zhì)量造成嚴(yán)重影響［2］。因此，提高匍匐翦股穎的耐熱性是目前亟待解決的問題。挖掘高溫響應(yīng)基因，了解匍匐翦股穎高溫響應(yīng)途徑和機(jī)理是解決該問題的重要途徑。當(dāng)前，已有部分研究揭示了匍匐翦股穎與高溫相關(guān)基因的功能［3］，為培育新的抗高溫草坪提供了一定的借鑒。然而，植物響應(yīng)高溫脅迫的途徑非常復(fù)雜，因此，系統(tǒng)地挖掘與高溫相關(guān)的基因，揭示其整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程是提高匍匐翦股穎抗高溫能力的關(guān)鍵所在。

酵母cDNA 文庫是挖掘植物相關(guān)功能基因的常用方式，而酵母雜交系統(tǒng)則能夠利用酵母細(xì)胞內(nèi)DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD）的融合表達(dá)功能篩選出目的基因互作蛋白［4］。目前，關(guān)于酵母cDNA 文庫在各種作物中的研究已逐漸深入［5-9］。隨著cDNA 文庫的廣泛應(yīng)用，越來越多的未知基因被發(fā)現(xiàn)，其功能也被深入的研究［10-12］。但是，關(guān)于匍匐翦股穎的cDNA 文庫構(gòu)建信息還未見報(bào)道。因此，構(gòu)建質(zhì)量好、容量高的匍匐翦股穎cDNA 文庫對后續(xù)匍匐翦股穎分子機(jī)理的研究具有重要意義。通過建立酵母cDNA 文庫，能夠得到植物基因組的完整信息及克隆片段［13-14］，從而進(jìn)一步挖掘匍匐翦股穎在高溫脅迫下有顯著變化的基因，對其進(jìn)行研究，闡明其功能。此外，通過酵母雙雜交技術(shù)可以對已知抗熱基因的互作蛋白進(jìn)行篩選與檢驗(yàn)，再使用該技術(shù)對篩選出的互作蛋白進(jìn)行一對一驗(yàn)證，揭示抗熱基因與其它基因的相互作用，從而闡明匍匐翦股穎抗熱信號(hào)途徑，驗(yàn)證抗熱基因功能［15-16］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 將匍匐翦股穎種子均勻的撒播于育苗缽中，待其發(fā)芽后移植到直徑20 cm 的花盆中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)土體積比為泥炭∶蛭石=1∶2，在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，條件為光23 ℃/16 h，暗23 ℃/ 8 h。

1.1.2 試劑選擇 選用載體pDONR222/pGADT7-DEST 為建庫載體，所用到的與構(gòu)建cDNA 文庫相關(guān)的試劑主要來源于美國英杰生命技術(shù)有限公司（Invitrogen）；轉(zhuǎn)化大腸桿菌的材料來源于TaKaRa（大連寶生物）公司；培養(yǎng)基等在Sigma 公司購買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)處理 將培養(yǎng)8 周的匍匐翦股穎植株置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫處理，處理?xiàng)l件為光37 ℃/16 h、暗37 ℃/8 h，分別在處理的第0、2、8 和24 h 取葉片，并進(jìn)行混合，用于后續(xù)總RNA 的提取。

1.2.2 Trizol 法提取匍匐翦股穎總RNA 取上述匍匐翦股穎葉片混樣材料0.1 g，液氮研碎，用Trizol法提取匍匐翦股穎的總RNA，Oligotex mRNA Midi Kit 試劑盒進(jìn)行總RNA 的分離純化，再用1%瓊脂糖凝膠電泳對Total RNA 進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.2.3 初級(jí)cDNA 文庫的構(gòu)建 用上述所提取的RNA 作為模板DNA 進(jìn)行完整cDNA 雙鏈的合成（參照Clone Miner 說明書進(jìn)行）。在得到cDNA 雙鏈后，用已經(jīng)合成的完整cDNA 連接于3 種attB1 重組接頭。待連接完成后，進(jìn)行cDNA 的分級(jí)分離，收集產(chǎn)物。對收集到的產(chǎn)物進(jìn)行BP 重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B 進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。完成后加入SOC 培養(yǎng)基，置于37 ℃，轉(zhuǎn)速為225 ～250 r/min，搖床培養(yǎng)1 小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后取培養(yǎng)物10 μL 稀釋1 000倍，均勻在LB 培養(yǎng)基上涂50 μL，第2 天計(jì)數(shù)，用于后續(xù)的結(jié)果分析，剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%于-80 ℃存好。

1.2.4 構(gòu)建酵母cDNA 文庫 從上述建立的cDNA初級(jí)文庫中抽取質(zhì)粒，按照300 ng/μL 的濃度進(jìn)行稀釋。將稀釋好的質(zhì)粒用LR 重組反應(yīng)法連接到pGADT7-DEST 載體上，將連接好的質(zhì)粒和載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。取培養(yǎng)物10 μL 稀釋1 000 倍，均勻在LB 培養(yǎng)基上涂50 μL，第2 天計(jì)數(shù)，用于后續(xù)的結(jié)果分析，剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%于-80 ℃存好。

1.2.5 制備Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞 取Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞在YPDA 培養(yǎng)基上劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)3 ～5 d。挑取生長出來的單菌落于液體YDPA 培養(yǎng)基中震蕩，待OD600值到0.5 左右時(shí)，離心后傾析上清液，使用ddH2O 將其重懸，再次離心后使用TE/LiAc 溶液將其混合得到Y(jié)187 酵母感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.6 cDNA 文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 在無菌預(yù)冷的15 mL離心管中加入試劑Reaction Component、Herring Testes Carrier DNA、denatured 和次級(jí)文庫質(zhì)粒，取50 μL Herring DNA，100 ℃/5 min 冰浴冷卻后再重復(fù)進(jìn)行1 次。加入感受態(tài)細(xì)胞，渦旋振蕩混合完全后加入PEG/LiAc 溶液，混合后溫育，每隔15 min混合1 次。加入二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）混合完成后，離心去上清，用30 mL NaCl溶液懸浮細(xì)胞。將得到的溶液取10 μL 分別稀釋10、100、1 000、10 000 倍涂于SD/-Leu 培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)3 ～5 d。收集轉(zhuǎn)化子，挑取克隆菌落，進(jìn)行PCR 鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 匍匐翦股穎Total RNA 檢測結(jié)果

匍匐翦股穎Total RNA 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示(圖1)能夠擴(kuò)增出明亮的條帶，且條帶的長度大于500 bp，說明Total RNA 質(zhì)量良好，可作為建庫的起始樣品。

圖1 mRNA 分離結(jié)果Fig.1 mRNA separation results

2.2 cDNA 第2 鏈合成結(jié)果

使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測對合成的雙鏈cDNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果(圖2)顯示條帶呈彌散狀，大小范圍在250 ～2 000 bp。表明此cDNA 雙鏈合成質(zhì)量過關(guān)，可使用其進(jìn)行酵母cDNA 文庫的構(gòu)建。

圖2 cDNA 第二鏈合成結(jié)果Fig.2 Results of synthesis of cDNA second strand

2.3 初級(jí)文庫構(gòu)建結(jié)果鑒定

對初級(jí)文庫菌液進(jìn)行稀釋、涂布，第2 天觀察計(jì)數(shù)。用“CFU/mL= 平板上的克隆數(shù)/50 μL×100×1 000 μL=1 700/50 μL×l00×1 000 μL=3.4×106”的方法計(jì)算出庫容量的總克隆數(shù)CFU=3.4×106×4 =1.36×107個(gè)（圖3A）。從中隨機(jī)選取了24 個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測發(fā)現(xiàn)：初級(jí)文庫的重組率為100%，插入的克隆片段長度均大于1 000 bp，符合初級(jí)文庫的建庫要求（圖3B）。

圖3 初級(jí)文庫庫容量鑒定及 cDNA 插入片段重組鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of primary library capacity and recombination of cDNA insertion fragment

2.4 次級(jí)文庫構(gòu)建結(jié)果鑒定

將初級(jí)文庫的菌液取出10 μL，稀釋后進(jìn)行涂布并觀察計(jì)算克隆數(shù)量（圖4A），通過觀察計(jì)算出總克隆數(shù)CFU =3.0×106×4=1.2×107個(gè)。從中隨機(jī)選取24 個(gè)菌落進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示：該文庫的重組率為100%，平均插入片段長度＞1 000 bp（圖4B）。經(jīng)過計(jì)算，符合酵母雜交cDNA 文庫的要求，可用于后續(xù)的匍匐翦股穎酵母雜交相關(guān)試驗(yàn)。

圖4 次級(jí)文庫的構(gòu)建及鑒定結(jié)果Fig. 4 Construction and identification of secondary libraries

2.5 cDNA 文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y187 酵母菌株結(jié)果

將轉(zhuǎn)化好的菌液涂布在SD/-Leu 培養(yǎng)基上，對其進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)克隆數(shù)目為400 個(gè)，工作液的細(xì)胞密度>3×107cells/mL，文庫滴度(cells/mL) 為4.0×107cells/mL（圖5A）。從中選取24 個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定（圖5B），擴(kuò)增出了23 個(gè)單菌落條帶，由此計(jì)算出插入片段平均＞1 000 bp,文庫重組率為96%。

圖5 cDNA 文庫轉(zhuǎn)化 Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig. 5 Identification of cDNA library transformed into yeast competent cells Y187

3 結(jié)論與討論

在對建立的cDNA 文庫進(jìn)行評價(jià)時(shí)，主要從2個(gè)方面對其進(jìn)行評價(jià)：所建立的cDNA 文庫是否有代表性和提取的mRNA 是否完整［17-18］。其中，庫容量中包含的獨(dú)立重組克隆數(shù)的多少是決定文庫是否有代表性的重要因素。普遍來說，cDNA 文庫所包含的克隆數(shù)應(yīng)在1×106CFU 之上才能夠說明文庫滿足后續(xù)的使用要求［19］。通過本試驗(yàn)所建立的cDNA文庫，經(jīng)過測定得到克隆數(shù)為1.36×107CFU，大于最低克隆數(shù)，插入片段平均大于1 000 bp，重組率為100%。說明該cDNA 文庫滿足mRNA 的篩選要求，可用于后續(xù)酵母試驗(yàn)的研究。

通過構(gòu)建不同作物的cDNA 文庫，能夠?yàn)橄嚓P(guān)作物研究未知基因及其功能提供基礎(chǔ)。通過建立匍匐翦股穎酵母cDNA 文庫，能夠從中進(jìn)行挖掘并篩選一批與高溫相關(guān)的基因［20］。此外，利用酵母cDNA文庫還能夠有效的篩選目的基因的互作蛋白，通過對蛋白質(zhì)互作關(guān)系的進(jìn)一步研究，驗(yàn)證與高溫相關(guān)基因行使何種功能［21］。

采用SMART 技術(shù)構(gòu)建酵母cDNA 文庫是得到目的基因較為高效、迅速的方法［22］。本研究詳細(xì)說明了匍匐翦股穎cDNA 文庫的建立方法，通過SMART 技術(shù)，建立了可用于酵母雜交試驗(yàn)的高質(zhì)量匍匐翦股穎酵母cDNA 文庫，并將文庫質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞。為尋找匍匐翦股穎響應(yīng)高溫的基因和后續(xù)研究互作蛋白的酵母雙雜交試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，也為解釋匍匐翦股穎抗高溫信號(hào)通路提供了重要信息。