湯 富，曾 造，王繼杉，顧 熙，謝 美，吳 雷

(1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州省應(yīng)用化學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 畢節(jié) 551700)

斑蝥素是昆蟲綱類動(dòng)物大斑蝥中提取的有效成分，可作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)中治療疾病的一種藥物分子[1]。研究表明[2]，斑蝥素對(duì)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成有一定的抑制作用，具有較高藥用價(jià)值，但斑蝥素毒副作用較大，合成工藝復(fù)雜，因此在臨床應(yīng)用方面受限。去甲去氫斑蝥素是天然抗腫瘤藥物斑蝥素的去甲基去氫類似物，兩者抗腫瘤作用類似，毒副作用較低，能減緩斑蝥素對(duì)泌尿系統(tǒng)、腎臟等的刺激作用[3]。去甲斑蝥素是我國(guó)首先研發(fā)的唯一可以升高白細(xì)胞且副作用小的人工合成抗癌藥物，抗腫瘤的某些機(jī)制尚未明確。茴香醛作為天然抗微生物生物劑[4]之一，具有良好的抗菌、抗真菌、抗氧化的活性[5-7]。人血清白蛋白(簡(jiǎn)稱HSA)[8-11]是人體血漿中的最豐富的蛋白質(zhì)，約占總量的60%，具有增加血容量、運(yùn)輸配體、維持血漿膠體滲透壓和調(diào)節(jié)血液pH值等功效，常被選作目標(biāo)蛋白，用以研究藥物分子對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響。分子對(duì)接是以預(yù)測(cè)藥物活性成分與蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)有力的工具，在闡明藥物活性成分與靶蛋白相互作用方向發(fā)揮著重要作用，主要應(yīng)用在藥物設(shè)計(jì)與研發(fā)領(lǐng)域。基于此，筆者以呋喃、馬來酸酐和水合肼為原料合成了去甲斑蝥素酰亞胺茴香醛，通過熒光光譜法和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(CADD)[12]為基礎(chǔ)，模擬、推測(cè)去甲去氫斑蝥素縮茴香醛與HSA之間的相互作用關(guān)系。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

順丁烯二酸酐，AR，廣州市中業(yè)化工有限公司；呋喃，AR，上海麥克林生化科技有限公司；乙醚，AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；水合肼、對(duì)甲氧基苯甲醛、二甲基亞砜(DMSO)，AR，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；人血清白蛋白(HSA)，AR，上海華美生物有限公司。

F-2700 FL熒光分光光度計(jì)，日立公司；600 MHz核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))，瑞士Bruker公司；冷凍藥品保存柜，中科美菱；制冰機(jī)，Watoor；顯微熔點(diǎn)儀，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。

1.2 目標(biāo)化合物的制備

稱取1.5 g(152.9 mmol)順丁烯二酸酐放入100 mL清潔無水三頸燒瓶中，滴加適量乙醚使其完全溶解。逐滴添加2.04 g(339.6 mmol)呋喃，攪拌30 min，加熱回流24 h，趁熱過濾，結(jié)晶得到2.06 g粗品去甲去氫斑蝥素(中間體Ⅰ)。通過重結(jié)晶并用無水乙醇干燥得到1.86 g白色針狀物，收率73.2%。稱取1.66 g(100.0 mmol)中間體Ⅰ于三頸燒瓶中，加入適量無水乙醇溶解，溶解后逐滴加入1 g(20 mmol)水合肼，加熱回流20 h。趁熱過濾，沉淀結(jié)晶，用無水乙醇重結(jié)晶，得到去甲去氫斑蝥素酰亞胺(中間體Ⅱ)，干燥后得1.12 g，收率為62.2%。稱取中間體Ⅱ 0.18 g(1.00 mmol)于三頸燒瓶中，向燒瓶中添加適量無水乙醇以溶解。加入0.27 g(2 mmol)茴香醛，加熱回流5 h，用TLC跟蹤反應(yīng)過程。冷卻結(jié)晶后過濾，用無水乙醇重結(jié)晶，干燥制得到淡黃色固體(Ⅲ)，收率60.4%。m.p.145.2～146.3 ℃(文獻(xiàn)值[13]:145.6～146.5 ℃)。合成路線如圖1。

圖1 去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛合成路線

1.3 目標(biāo)化合物熒光實(shí)驗(yàn)

1.3.1 藥品的配置

稱取0.03 g(0.1 mmol)去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛于燒杯中，使其完全溶解。完全溶解后，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容，配制成1×10-4mol/L溶液，保存在4 ℃冷凍藥品保存柜中備用。稱取0.33 g HSA于燒杯內(nèi)，溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容，配制成2×10-5mol/L的HSA溶液備用。Tris-HCl 緩沖溶液(pH=7.4，含0.10 mol/L的NaCl)。所用試劑均在4 ℃下的藥品保存柜中保存，備用。

1.3.2 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)

取7個(gè)潔凈的10 mL容量瓶，分別取Tris-HCl 緩沖溶液和HSA溶液各1 mL于容量瓶?jī)?nèi)，并分別移取0、1、2、3、4、5、6 mL，1×10-4mol/L的去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛，用去離子水定容。按以上方法步驟繼續(xù)配置2組，將3組溶液分別置于溫度為293、303、313 K的恒溫水浴鍋中恒溫40 min左右。將處理好的溶液倒入比色皿中，分別測(cè)量不同溫度下目標(biāo)產(chǎn)物的熒光性質(zhì)(設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為286、340 nm)，由低到高的濃度依次進(jìn)行測(cè)量。

1.4 分子模擬對(duì)接

1.4.1 配體預(yù)處理

通過Chemdraw和GaussView分別構(gòu)建出所需的小分子，即合成出的目標(biāo)產(chǎn)物分子。

在GaussView軟件中畫出3D視圖后，用Gaussian對(duì)小分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化和相關(guān)計(jì)算，AutoDockTool分子對(duì)接軟件將小分子加全氫、設(shè)置為配體(自動(dòng)分布電荷)、檢測(cè)扭轉(zhuǎn)鍵、選擇扭轉(zhuǎn)鍵等操作，完成配體預(yù)處理。

圖2 目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)

圖3 目標(biāo)分子在AutoDockTool中經(jīng)處理后檢測(cè)到的可扭轉(zhuǎn)鍵(加粗部分)

1.4.2 受體預(yù)處理

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中下載人血清白蛋白(HSA)后，用pymol去掉HSA中的水分子、非蛋白質(zhì)小分子，及HSA的一半。打開AutoDockTool分子對(duì)接軟件對(duì)HSA加氫、添加蛋白質(zhì)類型、計(jì)算G電荷，完成受體預(yù)處理(圖4)。

圖4 HSA處理前后對(duì)比

1.4.3 配體-受體對(duì)接

將上述已經(jīng)處理好的配體、受體進(jìn)行配體-受體對(duì)接。受體和配體間總的對(duì)接能量[14]如下：

E總=E1+E2+E3+E4+E5

式中：E1為范德華力，E2為氫鍵相互作用力，E3為靜電相互作用，E4為配體分子內(nèi)部能量，同樣包含前3項(xiàng)的內(nèi)容。E總越低則表示對(duì)接結(jié)果越穩(wěn)定。對(duì)接方法如下。

1)導(dǎo)入配體、格點(diǎn)對(duì)接BOX：蛋白質(zhì)名稱——1AO6；XYZ維格點(diǎn)數(shù)目——126:98:112；格子盒子空間大小——0.714；格點(diǎn)盒子中心——27.326:-14.976:23.101。

2)設(shè)置對(duì)接參數(shù)及運(yùn)算方法，運(yùn)行Autodock4命令，待運(yùn)行完可查看結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

HAS的天然熒光性受結(jié)構(gòu)上能發(fā)射熒光的氨基酸殘基基團(tuán)(Trp、Tyr、Phe基團(tuán))的影響，其內(nèi)源熒光基團(tuán)[15]為色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，HSA的天然熒光主要來自于色氨酸殘基(Trp基團(tuán))的貢獻(xiàn)(激發(fā)波長(zhǎng)295 nm)。圖5是298 K下不同濃度的目標(biāo)產(chǎn)物與一定濃度的HSA相互作用熒光猝滅光譜。在286 nm的激發(fā)光下，最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在350 nm附近。從圖6可以看出，隨目標(biāo)產(chǎn)物的濃度逐步增加，HSA的最大熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，發(fā)射峰位置基本沒有變化，表明目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)HSA的Trp基團(tuán)有猝滅作用。

圖5 產(chǎn)物對(duì)HSA熒光猝滅光譜

2.2 熒光猝滅機(jī)理和常數(shù)

根據(jù)藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，外界環(huán)境引起生色基團(tuán)激發(fā)態(tài)能級(jí)發(fā)生改變，即引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度(Trp基團(tuán)最強(qiáng)，Tyr基團(tuán)次之，Phe基團(tuán)最弱)降低不同。HSA的熒光猝滅大致可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。對(duì)于靜態(tài)猝滅，基態(tài)配合物穩(wěn)定性減小，猝滅常數(shù)隨之減小，動(dòng)態(tài)猝滅則相反。藥物分子對(duì)HSA的猝滅過程規(guī)律通常遵循Stern-Volmer方程[15]:

F0/F=Kqτ0[Q]+1=Ksv+1

(1)

式中：F0、F分別為HSA溶液加入藥物前后的熒光強(qiáng)度，Kq為雙分子的猝滅數(shù)率常數(shù)，Ksv是熒光的猝滅常數(shù)，[Q]為猝滅劑Q 的濃度，τ0是不存在猝滅劑時(shí)的熒光分子平均壽命，約為1×10-8s。以F0/F對(duì)[Q]作目標(biāo)產(chǎn)物與HSA的Stern-Volmer熒光猝滅曲線(圖6)。圖中直線方程的斜率為猝滅常數(shù)，293、303 K和310 K下Ksv分別為5.489×104、4.736×104L/mol和4.149×104L/mol。猝滅常數(shù)隨溫度的逐步升高而降低，由此可推測(cè)該過程為靜態(tài)猝滅。

圖6 目標(biāo)產(chǎn)物與HSA的Stern-Volmer熒光猝滅曲線

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)HSA的作用主要表現(xiàn)為靜態(tài)猝滅作用，由靜態(tài)猝滅公式(2)可計(jì)算結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)n。

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

分別以lg[Q]、lg[(F0-F)/F]的值為橫、縱坐標(biāo)作圖，可得結(jié)合常數(shù)為直線截距，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為斜率，結(jié)果如圖7和表1所示。

圖7 同溫度下產(chǎn)物對(duì)HSA的Lineweaver-Burk曲線

表1 產(chǎn)物與HSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

2.4 相互作用力類型

藥物小分子與蛋白質(zhì)通常相互作用形成復(fù)合物。相互作用力的類型主要有氫鍵力、疏水力、靜電力和范德華力。由熱力學(xué)方程式(3)～(5)可計(jì)算出兩者相結(jié)合的作用力類型。

ΔG=-RTlnKA

(3)

ln(KA2/KA1)=[(1/T1-1/T2)ΔH]/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

式中：ΔG反應(yīng)的吉布斯自由能；R為摩爾氣體常數(shù)(8.314 J/(mol·K)。聯(lián)立(3)～(5)可得ΔH=72.039 kJ/mol;ΔS=331.88 J/(mol·K);ΔG=-25.2 kJ/mol(293 K),-25.99 kJ/mol(303 K),-26.93 kJ/mol(313 K)。

依據(jù)Ross理論可得目標(biāo)產(chǎn)物與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)ΔH>0，ΔS>0主要表現(xiàn)為疏水作用力，ΔH>0表明反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，同時(shí)本反應(yīng)為自發(fā)反應(yīng)(ΔG<0)。

2.5 分子模擬對(duì)接結(jié)果進(jìn)行初步分析

對(duì)接結(jié)果進(jìn)行初步分析：通過文本可知，由遺傳算法(尋找最優(yōu)算法)計(jì)算出最佳打分構(gòu)象，去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛與HSA結(jié)合對(duì)接50次，得到的構(gòu)象進(jìn)行一個(gè)聚類與能量分析。在大多數(shù)晶體原配體重對(duì)接的情況下，最佳結(jié)合聚類便是最佳聚類，在第33次嘗試對(duì)接時(shí)結(jié)合能量最低，可以認(rèn)為在第33次對(duì)接最優(yōu)為，氫鍵對(duì)接結(jié)合能為-26.69 kJ/mol。

由圖8可知，去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛與人血清白蛋白(HSA)周圍6×1010m范圍內(nèi)相互作用氨基酸殘基分別為：HIS-146;SER-193;ASN-429;LYS-432。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果通過PYMOL展示

2.6 分子模擬對(duì)接結(jié)果

去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛與人血清白蛋白(HSA)在對(duì)接位點(diǎn)最優(yōu)處形成2個(gè)氫鍵，分別為1AO6:B:SER193:OG；1AO6:B:LYS432:HZ3；通過設(shè)置對(duì)接參數(shù)及運(yùn)算方法，運(yùn)行Autodock4命令，得到結(jié)果在第33次嘗試對(duì)接時(shí)結(jié)合能量最低，這兩個(gè)氫鍵的最低共同結(jié)合能為-26.93 kJ/mol(圖9)。

圖9 分子對(duì)接模擬結(jié)果

3 結(jié) 論

a.去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛與HSA相互作用猝滅過程為靜態(tài)猝滅；去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛與HSA之間的作用力主要為疏水作用力，作用過程自發(fā)放熱；且由Stern-Volmer方程可知兩者相結(jié)合的位點(diǎn)有一個(gè)。

b.分子對(duì)接模擬得到去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛與HSA周圍6×1010m范圍內(nèi)相互作用的疏水性氨基酸殘基：HIS-146和ASN-429的存在說明兩者相互作用力類型為疏水作用，另外分子中部分基團(tuán)與SER193、LYS432等氨基酸殘基之間還存在氫鍵的作用。氫鍵使得親水性減小，疏水性增大，相互作用更加穩(wěn)定。分子對(duì)接模擬還得到兩者相互作用的最小結(jié)合能約為-26.69 kJ/mol，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果(-26.93 kJ/mol，313 K)大致相同。

c.去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮茴香醛與HSA相互作用機(jī)制為藥物在機(jī)體內(nèi)的運(yùn)輸分布、作用機(jī)理、藥物活性等進(jìn)一步研究提供理論參考價(jià)值。